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in vivo 中通过多聚核糖体分级分离研究中枢神经系统翻译组

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DOI：

10.3791/51255

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2014年4月30日

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Neurobiology, German Cancer Research Center (DKFZ)

本文内容

摘要

本方案介绍了多核糖体分级分离的关键改进方法，用于研究体内中枢神经系统（CNS）样本的翻译组。通过分离并比较总RNA与核糖体结合的RNA组分，可实现对翻译和转录调控的全局评估。

摘要

基因表达涉及多个过程，包括转录、翻译以及mRNA和蛋白质的稳定性。这些步骤均受到严密调控，影响蛋白质丰度的最终动态。在翻译步骤中存在多种调控机制，使得仅凭mRNA水平不足以可靠地反映基因表达情况。此外，mRNA翻译的局部调控在神经元功能中尤为关键，这使得“翻译组学”（translatomics）成为神经生物学研究的关注焦点。本方法可用于连接转录组学与蛋白质组学研究。

在此，我们描述了多核糖体分级分离技术的关键改进方法。该技术通过分析活跃翻译的mRNA与多个核糖体的结合状态及其在蔗糖梯度中不同的沉降特性，来研究转译组。传统上，进行此类实验时 体内 样本，尤其是中枢神经系统（CNS）样本的处理，由于材料数量有限以及富含脂质组织成分的存在，已被证明具有挑战性。为解决这一问题，本方案专门针对极少量CNS材料进行了优化，已通过单只小鼠脊髓和脑组织的应用得到验证。简言之，首先提取CNS组织，并使用环己酰亚胺将正在翻译的核糖体固定在mRNA上；随后进行髓鞘漂浮法以去除富含脂质的组分；接着在蔗糖梯度中进行分级分离，依据核糖体的负载情况将mRNA分离开来。所获得的各组分适用于多种下游检测，包括新型全基因组范围的检测技术。

引言

基因表达由转录、翻译以及mRNA和蛋白质稳定性的共同作用决定，其中翻译具有最主要的影响1。目前明确的是，这些步骤中的每一步都受到高度调控。微小RNA（micro-RNAs）、RNA颗粒的形成、可变性多聚腺苷酸化以及胞质多聚腺苷酸化是基因表达转录后调控的一些例子2,3。这些机制中的每一种都将转录与翻译解偶联，并影响目标生物系统中的蛋白质组。因此，毫不奇怪，仅凭mRNA水平并不能准确反映蛋白质水平4。定量蛋白质组学可对基因表达提供最直接的评估，但尽管近年来已有进展，其在灵敏度和蛋白质序列分辨率方面仍存在显著局限性。因此，研究翻译组（translatome），即正在翻译的mRNAs集合，在转录组和蛋白质组研究之间提供了一个极佳的折中方案。相较于转录组学，它在评估最终基因表达时更为准确；相较于蛋白质组学，它又具有更高的覆盖度和序列分辨率。

在哺乳动物系统中，大多数翻译过程通过依赖帽结构的起始机制开始。一组真核起始因子与40S小核糖体亚基共同组装到mRNA的5'帽结构上。该复合物随后沿mRNA扫描，当到达起始密码子AUG时，招募60S大核糖体亚基，形成完整的80S核糖体。延伸阶段中，核糖体沿mRNA移动，延伸因子协助将负载tRNA上的氨基酸添加到新生肽链中。多个核糖体可同时沿同一条mRNA移动，而结合的核糖体数量已被证明与蛋白质合成速率相关5,6。这使得核糖体负载程度成为翻译活性的可靠指标，并可根据沉降速率分离处于活跃翻译状态的mRNAs。除了对正在翻译的mRNAs进行定量外，还可获得序列信息以鉴定参与翻译调控的基序。此外，可从不同组分中分离RNA结合蛋白及其他翻译因子，有助于相关调控蛋白的研究与发现。

在神经系统中，翻译调控已与 mRNA 储存、运输以及局部蛋白质合成等过程相关联。研究发现，生长锥含有特定的局部 mRNA 池，与轴突其他区域的 mRNA 不同7。此外，轴突具备局部合成蛋白质的能力8,9。因此，翻译的局部调控已成为神经生物学研究中的关键课题。多项研究已展示了多聚核糖体分级分离技术在此领域的应用潜力，该技术曾被用于研究脊髓发育过程中的轴突导向，并证实了脑内脑源性神经营养因子（BDNF）的活动依赖性翻译10,11。

方案

所有动物实验均按照德国癌症研究中心（DKFZ）的机构指南进行。
注意：为防止样本受到RNase污染，应采取基本的防RNase污染措施，并使用经DEPC处理的水配制所有缓冲液。

1. 蔗糖梯度的制备

  1. 配制17.5%、25.6%、33.8%、41.9%和50%的蔗糖溶液（见表1）。开始制备梯度时，将2 ml 50%蔗糖溶液缓慢加入聚碳酸酯超速离心管底部。将离心管置于-80 °C下冷冻20分钟，使该层凝固。
  2. 依次加入蔗糖浓度递减的各层，每加一层后均进行冷冻，直至最上层为17.5%蔗糖溶液。在添加蔗糖溶液过程中，需将梯度管保持在冰上，以防止下层已冻结的溶液融化。
  3. 蔗糖梯度应于使用前一天新鲜配制，并保存在4 °C。或者可预先配制，于-80 °C保存，并在实验前一晚转移至4 °C解冻。

2. 组织制备（脊髓和/或脑）

  1. 用氯化钠溶液配制的过量赛拉嗪和氯胺酮麻醉小鼠，经心脏灌注 20 ml 含有 200 µg/ml CHX 的汉克斯平衡盐溶液（HBSS），用于使核糖体固定在相应的转录本上。通过脚趾夹捏无反应确认麻醉效果。
  2. 迅速取出组织。从背部打开颅骨并取出脑组织。对整个胸段和腰段脊柱进行椎板切除术，并取出脊髓。分别使用全脑（约400 mg）或一段4 cm长的脊髓组织（约90 mg）。
  3. 将组织转移至预冷的匀浆缓冲液A中（参见 表1（脊髓：1 ml；脑：4 ml），用洁净的手术刀切成小块，以增加放线菌酮的吸收。后续所有步骤均在冰上进行。
  4. 孵育15分钟，然后使用Dounce匀浆器进行机械匀浆。需谨慎控制匀浆过程，以确保细胞核保持完整。所有样品应完全按照相同方式处理，以保证可比性。注意：对于脑组织： 用紧密贴合的研杵研磨组织5次。对于脊髓组织：先用松散贴合的研杵研磨5次，再用紧密贴合的研杵研磨5次。
  5. 取等分试样（脑组织400 µl，脊髓组织200 µl），迅速冷冻后于-80 °C保存，用于总RNA提取。
  6. 在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 10 分钟，去除细胞核及未破碎的细胞和组织碎片。低速离心可防止核糖体丢失。
  7. 向无细胞核的上清液中加入NP-40和脱氧胆酸钠去垢剂（每种终浓度为1%），裂解膜碎片，孵育30分钟。

3. 髓鞘漂浮

  1. 此步骤可去除样品中的脂质成分，否则这些成分会掩盖多核糖体图谱中的信号。首先，将超速离心机转子和离心管桶预冷至 4 °C，并配制 2 M、1.1 M 和 0.9 M 的蔗糖溶液（见表 1）。
  2. 将裂解液与 1.22 体积的 2 M 蔗糖溶液混合，转移至聚乙烯超速离心管中。用 1.1 M 蔗糖溶液将所有离心管补至相等体积（10 ml），然后小心地在其上层覆盖 0.9 M 蔗糖溶液。
  3. 将超速离心管放入预冷的离心管桶中，在 4 °C 条件下以 100,000 × g 离心 3 小时。在此过程中，核糖体将沉积于沉淀中，而脂质成分则上浮并保留在上清液中。

4. 蔗糖梯度分离

  1. 移去上清液，并将沉淀溶解于匀浆缓冲液B中（见表1）。使用Nanodrop或等效仪器测定各样品在260 nm处的吸光度，并根据吸光度值归一化上样量。
  2. 将蔗糖梯度（制备方法见前文）放入预冷的超速离心管中，小心地将样品加至梯度顶部。另设一个空白蔗糖梯度作为技术对照。
  3. 用匀浆缓冲液调整各离心管重量。在4 °C条件下，以285,000 × g离心1.5小时。
  4. 在离心结束前30分钟开始准备Isco分级收集仪。若使用其他型号的分级收集仪，请遵循制造商的操作说明。
    1. 设置合适的紫外灯灵敏度（脑组织为0.2 AUFS，脊髓组织为0.05 AUFS），并开启预热。安装管路穿刺器，并通过蠕动泵将其与60%蔗糖溶液连接。
    2. 通过泵入蔗糖溶液（流速：1 ml/min）测试系统，特别注意检查管路是否泄漏，以免产生气泡干扰梯度。
    3. 通过手动泵入梯度缓冲液至紫外检测器中，校正基线以消除背景吸收。
  5. 小心从转子中取出含有已沉降样品的超速离心管，置于冰上。避免任何碰撞，以防梯度分辨率下降。
  6. 将梯度样品在分级收集仪上进行洗脱。首先运行空梯度以评估背景吸收，并确保技术设置正确。
    1. 将梯度管连接至紫外检测器，并用穿刺器刺穿管底。启动60%蔗糖溶液的泵送，使蔗糖推动含有沉降样品的梯度向上移动，依次通过紫外检测器进入滴液分配器。
    2. 记录260 nm处的吸光度，生成样品的吸收图谱，其中峰代表与核糖体亚基、单核糖体以及逐渐增加数量的多核糖体结合的mRNA的沉降情况。
  7. 通过滴液分配器将样品收集为20个组分（每管600 µl，使用2 ml离心管）。

5. 从各个组分中分离 RNA

  1. 向各组分中加入10% SDS，使其终浓度为1%，充分混匀，以使蛋白质变性并解离核糖体。此时样品可在-80 °C冷冻保存。根据待解决的科学问题，可依据吸光度图谱将组分合并。
  2. 采用酸性酚/氯仿法提取RNA，该方法同时可去除污染的DNA残留。
    1. 向每个样品中加入等体积预热至室温的酸性酚/氯仿，65 °C加热10分钟，随后在通风橱内释放压力。
    2. 在室温下以17,000 × g离心20分钟。小心将水相转移至新的1.5 ml离心管中。注意在密度较高的蔗糖组分中可能出现相位倒置，离心后水相可能位于下层。
    3. 向每个样品中加入等体积异丙醇、1/9体积乙酸钠（pH 5.2）和1 µl GlycoBlue，以沉淀RNA。样品在-80 °C放置至少1小时。
    4. 在4 °C以17,000 × g离心30分钟。GlycoBlue有助于沉淀的可视化。弃上清，用预冷的80%乙醇洗涤沉淀一次，空气干燥后将沉淀溶解于无RNase的水中。
  3. 使用Nanodrop测定RNA含量，并通过Bioanalyzer芯片分析RNA完整性。本方案所获得的RNA适用于所有先进的高通量检测技术，包括微阵列 和深度测序。

结果

图2展示了分级分离后具有代表性的多聚核糖体图谱。脑和脊髓的图谱显示出与先前在细胞系中描述的特征性吸收曲线一致的形态。与小核糖体亚基（40S）结合的mRNA在较轻的组分中沉降，在图谱上首先表现为一个峰，随后是大核糖体亚基（60S）和单体核糖体（80S）结合的mRNA。与多个核糖体结合的mRNA沉降于较重的组分中，后续出现的峰表示结合的核糖体数量逐渐增加。可通过图谱评估整体翻译活性。例如，脑组织的多聚核糖体与单体核糖体的比值高于脊髓组织，表明其翻译活性更高。

通过Bioanalyzer检测各组分提取的RNA，结果显示18S和28S rRNA的分布情况。18S rRNA在图谱中出现较早，与小核糖体亚基沉降于较轻的蔗糖组分相一致。脑组织总RNA的典型产量为10–20 µg，脊髓组织为2–4 µg。各组分RNA的产量分别可达脑组织4 µg和脊髓组织0.8 µg，具体产量取决于组分位置。空白蔗糖梯度在260 nm处已显示出一定的背景吸收，这是由于DTT的存在所致。在数据分析过程中可扣除该背景值，以校正样品数值。EDTA处理使多核糖体峰消失，证明沉降图谱反映的是翻译活性。

经心脏灌注至RNA测序工作流程示意图；离心、酚提取、分析。

图1. 工作流程及潜在应用 体内 多核糖体分级分离 请点击此处以查看此图的放大版本。

脑和脊髓蔗糖梯度；多聚核糖体图谱；吸光度，mRNA组分；图表。
图2. (A) 脑和脊髓典型的多聚核糖体图谱，以及通过Bioanalyzer对提取的RNA进行评估。(B) 通过qRT-PCR检测Gapdh mRNA在各组分中的分布。(C) 空梯度及经或未经EDTA处理的脑组织的多聚核糖体图谱。请点击此处查看该图的高清版本。

1.12倍梯度缓冲液30 mM Tris-HCl pH7.4, 30 mM MgCl2, 600 mM NaCl, 200 µg/ml 环己酰亚胺 (CHX), 2 mM 二硫苏糖醇 (DTT)
1.117.5% 蔗糖溶液8.67 g 蔗糖, 25 ml 2倍梯度缓冲液, 加 DEPC H2O 至 50 ml
1.125.6% 蔗糖溶液12.8 g 蔗糖, 25 ml 2倍梯度缓冲液, 加 DEPC H2O 至 50 ml
1.133.8% 蔗糖溶液16.9 g 蔗糖, 25 ml 2倍梯度缓冲液, 加 DEPC H2O 至 50 ml
1.141.9% 蔗糖溶液20.95 g 蔗糖, 25 ml 2倍梯度缓冲液, 加 DEPC H2O 至 50 ml
1.150% 蔗糖溶液25 g 蔗糖, 25 ml 2倍梯度缓冲液, 加 DEPC H2O 至 50 ml
2.3匀浆缓冲液 A0.25 M 蔗糖, 50 mM Tris/HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl200 µg/ml CHX, 1× Roche 完整蛋白酶抑制剂, 1 mM DTT, 1 mM 苯甲基磺酰氟 (PMSF), 100 U/ml RNAsin
3.12 M 蔗糖溶液68.4% 蔗糖, 50 mM Tris-HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl100 µg/ml CHX, 1× Roche 完整蛋白酶抑制剂, 1 mM DTT, 1 mM PMSF
3.11.1 M 蔗糖溶液38.5% 蔗糖, 50 mM Tris-HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl100 µg/ml CHX, 1× Roche 完整蛋白酶抑制剂, 1 mM DTT, 1 mM PMSF
3.10.9 M 蔗糖溶液30.8% 蔗糖, 50 mM Tris-HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl100 µg/ml CHX, 1× Roche 完整蛋白酶抑制剂, 1 mM DTT, 1 mM PMSF
4.1匀浆缓冲液 B0.25 M 蔗糖, 50 mM Tris/HCl, pH7.4, 5 mM MgCl2, 25 mM KCl, 1% NP-40, 1% 脱氧胆酸钠200 µg/ml CHX, 1× Roche 完整蛋白酶抑制剂, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 U/ml RNAsin

表1. 缓冲液与溶液列表。

讨论

尽管多聚核糖体分馏并非一种新颖的技术，但它仍然是一项颇具挑战性的实验方法。根据起始材料的不同，往往需要进行大量的优化。这种情况尤其适用于 体内 中枢神经系统样本，其材料数量通常有限，且富含脂肪组织成分，会阻碍正在翻译的mRNA的分离。目前大多数已发表的分级分离方案针对的是酵母或哺乳动物细胞系，而对于脑组织已有成熟的分离方案。12,13,14相比之下，描述脊髓分级分离的文献极少，且以往的实验方案需要脊髓 从大量动物中采集并合并样本15由于这些原因，对原有的组分分离方案进行了多项关键性改进，以适用于中枢神经系统组织（包括单只小鼠脊髓）的样本处理。在动物灌注过程中使用环己酰亚胺进行核糖体固定，以防止在漫长的组织提取过程中核糖体解离。随后，采用特定方法提取多聚核糖体RNA，以最大化多聚核糖体的得率。首先，通过玻璃匀浆器（douncing）对组织进行可控匀浆，以保持细胞核完整并防止DNA污染。接着通过离心可靠地去除细胞核。NP-40与脱氧胆酸钠两种去垢剂联用，可有效裂解内质网并释放其膜结合的核糖体。此外，富含脂质的髓鞘中的紫外吸收成分会干扰多聚核糖体图谱的检测，因此必须进行髓鞘漂浮去除：在此步骤中，密度较高的组分（如多聚核糖体）形成沉淀，而较轻的组分（如髓鞘）上浮并被移除16随后，多聚核糖体通过17.5%至50%的蔗糖梯度沉降。除了手动逐层叠加并冷冻每层蔗糖溶液外，也可使用梯度混合器制备梯度。利用酸性酚/氯仿从各组分中提取RNA，可在最小程度损失RNA的同时去除DNA。然而，在高浓度蔗糖组分（第16组分以上）中可能出现相位倒置现象。

与针对翻译水平的其他常规方法相比，本方案具有多项优势。例如，检测磷酸化S6蛋白（一种显著的翻译标志物）以及利用放射性同位素标记新生肽链，均可提供有关整体翻译水平的信息，但无法揭示具体哪些mRNA正在被翻译。而多聚核糖体分馏技术不仅能够评估整体翻译水平，还能鉴定正在翻译的mRNA种类及相关调控蛋白。对分离得到的RNA可进行定量实时PCR，快速检测特定mRNAs的表达水平；也可进行微阵列分析或新一代RNA测序，以开展全基因组范围的研究。本文所介绍的优化步骤使得该技术仅需极少量中枢神经系统组织即可完成，从而减少了实验动物的使用数量，并通过缩短组织处理时间提高了整体实验质量。然而，该技术无法区分停滞的核糖体与正在翻译的核糖体。携带停滞核糖体的转录本会沉降到较重的组分中，在解读数据时应充分考虑这一因素。

最近报道了两种技术，即RiboTaq和TRAP，它们分别以细胞类型特异性的方式用表位标签或报告分子标记核糖体，并通过免疫沉淀分离与其结合的mRNA17,18。该技术可与多核糖体分级分离联用，从而对特定细胞群体提供高分辨率的检测结果。核糖体足迹分析（ribosome foot-printing）是另一种新兴技术，其通过核酸酶消化产生由核糖体保护的mRNA小片段，即“足迹”片段。随后由这些足迹片段构建文库并进行测序。该方法可实现翻译过程的密码子水平全基因组分析，能够鉴定停滞的核糖体、非AUG起始密码子以及上游小开放阅读框，而这些信息无法通过多核糖体分级分离获得19。然而，多核糖体分级分离可与核糖体分析技术联用，用于富集含有单个核糖体的消化片段，从而提高文库构建所需分子物种的纯度，满足高纯度样本的要求。综上所述，多核糖体分级分离是一种具有持久重要意义的灵活方法，可与多种下游应用相结合，包括下一代测序等全基因组检测技术。

致谢

本工作由德国联邦教育与研究部（BMBF）、癌症信号转导系统生物学（Helmholtz系统生物学联盟）以及德国癌症研究中心（DKFZ）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Hank’s 平衡盐溶液Gibco14170-138
薄壁管，聚烯烃材质，14 ml，14 x 95 mmBeckman Coulter331374
焦碳酸二乙酯 SigmaD5758caution
放线菌酮SigmaC7698danger
二硫苏糖醇Sigma43815warning
完全蛋白酶抑制剂混合片剂Roche11697498001
苯甲基磺酰氟溶液Sigma93482danger
RNasin Plus RNase 抑制剂PromegaN2611
Nonidet P-40Roche11332473001danger
脱氧胆酸钠SigmaD6750warning
酸性酚:氯仿，pH 4.5（含 IAA，125:24:1）AmbionAM9722danger
GlycoBlueInvitrogenAM9516
仪器设备
Dounce 组织研磨器，1 ml/7 mlWheaton357538/357542
Nanodrop 2000Thermo Scientific
SW 40 Ti 转头，摆桶式，钛合金，6 x 14 ml，40,000 rpm，285,000 × gBeckman Coulter331302
密度梯度分馏仪Teledyne Isco
2100 BioanalyzerAgilent Technologies

参考文献

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