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方法文章

DNA折纸法制备生物响应型机器人的折叠与表征

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DOI：

10.3791/51272

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2015年12月3日

 ,  , 
1Faculty of Life Sciences and the Institute for Nanotechnology & Advanced Materials, Bar-Ilan University

本文内容

摘要

DNA 折纸是一种通过编程 DNA 分子自组装来制备精确纳米级结构的强有力方法。本文描述了一种利用 DNA 折纸技术折叠生物响应型机器人的方案，以及其纯化和用于透射电子显微镜成像（TEM）的负染色方法。

摘要

DNA纳米机器人是一种中空的六边形纳米级装置，设计用于在特定刺激下打开并释放其内部封存的货物。刺激物和货物均可根据具体需求进行定制。本文描述了利用DNA折纸技术制备DNA纳米机器人的实验方案。该过程首先将短的单链DNA订书钉链混合成储备液，随后将其加入到长的环状单链DNA支架链中，并在折叠缓冲液存在下进行反应。使用标准的热循环仪程序逐步降低混合反应的温度，以促进订书钉链与支架链之间的退火，这一过程是驱动纳米机器人折叠成型的关键因素。60小时的折叠反应完成后，通过离心过滤去除过量的订书钉链，然后通过琼脂糖凝胶电泳（AGE）进行产物可视化。最后，采用透射电子显微镜（TEM）结合甲酸铀酰负染法验证纳米机器人的成功制备。

引言

核酸纳米技术的应用令人瞩目。沃森-克里克碱基配对具有高度可操控性，加上定制寡核苷酸的大规模合成简便且成本相对较低2，推动了DNA纳米技术领域的应用3和研究迅猛发展。结构DNA纳米技术以不可移动的Seeman连接点4,5为基本构建单元，利用DNA作为自组装的基本元件，用于构建任意形状的纳米结构6-8。

近年来，带支架的DNA折纸技术9的发展使得能够以亚纳米级精度构建复杂的二维/三维纳米结构10-12，并为制造日益复杂且具有惊人多样性的新型功能物体提供了高效途径。该构建过程基于一条长链单链DNA支架，通常来源于病毒基因组，通过数百条短链单链DNA寡核苷酸（称为订书钉链）的杂交将其折叠成目标构型。该技术所获得的高结构分辨率直接源于DNA双螺旋的天然尺寸，而制备的可重复性则源于对短链单链订书钉序列的定制设计，以实现最大程度的氢键互补配对。通过缓慢的温度退火程序，可高效且高保真地获得设计所预期的最低能量、热力学上优先形成的纳米结构。将连接点设计规则轻松地编码为计算机程序，推动了CAD工具（如caDNAno13）的发展，极大简化了包含数百个连接点的大型复杂结构的设计任务。

此前，我们借助 caDNAno 工具描述了 DNA 纳米机器人设计14,15。本文展示了该纳米机器人的制备及其通过透射电子显微镜（TEM）的可视化结果。该纳米机器人是一种尺寸为 35 × 35 × 50 nm3 的三维中空六边形纳米装置，设计用于在特定预设刺激下发生显著的构象变化，从而释放出内部封装的特定货物分子，如蛋白质或核酸寡核苷酸。中空骨架内部设有 12 个装载位点，但实际结合的货物数量取决于货物分子的大小。货物分子的种类范围从小型 DNA 分子到酶、抗体以及 5–10 nm 的金纳米颗粒。货物可以是均一的，也可以是异质的，即每个纳米机器人可包含多种不同分子的混合物。传感功能通过两个双螺旋锁控门实现，可检测蛋白质、核酸或其他化学物质，其原理基于适体传感器16,17 或 DNA 链置换18 技术。近年来适体筛选技术的进展19–21 使得设计能够响应日益广泛分子种类和细胞类型的纳米机器人成为可能。

早期研究表明，一种携带特定抗体的纳米机器人在与抗原结合后，能够在混合细胞群体中向特定细胞类型内部传递抑制性或促进性信号15。这些纳米装置的一个引人注目的特性是，当单一群体中引入不同亚型的纳米机器人时，它们能够执行更为复杂的任务并实现逻辑控制。最近，我们展示了特定亚型的纳米机器人可作为正向或负向调节因子，调控含有活性载荷分子的效应群体22。

本文所述方案介绍了一种由适配体传感器序列门控的纳米机器人，其可特异性结合血小板源性生长因子（PDGF），从而促进纳米机器人的开启15,22。该制备过程与 Douglas et al.15 首次描述的纳米机器人制备方法类似，但进行了若干改进，旨在缩短整体操作时间，同时提高产率和纯化效率。

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方案

1. 准备短链DNA链混合物

  1. 按照 表1（见 材料）所列，在96孔板中订购冻干的DNA纳米机器人短链，并将其归一化至10 nmol。有关DNA纳米机器人的设计与结构的详细描述，请参见 Ben-Ishay 等14 和 Douglas 等15）。
  2. 用无DNase/RNase的超纯水将每个短链孔重新溶解，使其浓度达到100 µM。对于归一化至10 nmol的短链，使用100 µl超纯水进行溶解。
  3. 使用多通道移液器和无菌55 ml溶液容器，将每种短链各取20 µl混合在一起。
    注意：由于纳米机器人的结构由254条短链组成（包括核心、边缘、手柄和引导序列，表1），因此在短链混合池中每种短链的浓度为394 nM。从短链混合池中移除某些短链，或以不同体积添加部分短链，可能会显著降低产率，或导致未折叠的聚集体生成。

2. 制备构建反应混合物

  1. 对于标准反应混合物，使用 40 µl M13mp18 病毒基因组环状单链 DNA，相当于 4 pmol 的支架 DNA（100 nM 储备液，参见 材料最终浓度为20 nM，终体积 200 µl.
    1. 根据具体需求调整支架DNA的用量；但需保持反应体系中支架DNA的终浓度恒定为20 nM。
  2. 将短链DNA链（staples）加入，使支架链（scaffold）与短链的比例为1:10。当支架DNA浓度为20 nM时，254条短链中每条的终浓度为200 nM。对于 200 µl 最终反应体积添加 102 µl 引物池混合物（第1.2节）
    1. 此时将特定的门序列（Gate sequences）单独加入折叠反应混合物中。这些寡核苷酸需单独订购，并要求进行高效液相色谱（HPLC）纯化。确保门序列寡核苷酸与支架链的比例为1:10。 即 每种寡核苷酸200 nM，用于20 nM的支架浓度。对于一个 200 µl 折叠反应体积，加入 0.4 µl 对于四种门控寡核苷酸中的每一种 100 µM 储备浓度
  3. 加入 10x TAE 储存缓冲液，使终浓度为 1x TAE（40 mM Tris-乙酸盐，1 mM EDTA）。对于一个 200 µl 折叠反应体积，添加 20 µl 10倍浓度TAE缓冲液
  4. 加入 1 M MgCl₂2 至终浓度为 10 mM。对于一个 200 µl 折叠反应体积，加入 2 µl 1 M MgCl₂2.
  5. 添加 36 µl 加入无DNase/RNase的超纯水，调节至终体积 200 µl.
  6. 涡旋并分装 100 µl 将样品加入PCR管中。
    注意：请参考热循环仪的规格说明，了解可使用的最大反应体积。将体积减少至符合这些限制不会降低获得的产量；但超过指定的最大体积将影响产量。

3. 制备反应的温度退火程序

  1. 按照以下程序设置热循环仪：
    1. 以 5 min/°C 的速率将温度从 85 °C 降至 60 °C。
    2. 以 75 min/°C 的速率将温度从 60 °C 降至 4 °C。
    3. 在 4 °C 长时间保温。
  2. 制备完成后，将样品保存于 -20 °C。

4. 去除过量的DNA短链

  1. 添加 100 µl 将折叠反应混合物加入0.5 ml离心管中 过滤器 截留分子量为 分子量为100 kDa。保留 10 µl 用于后续分析的纳米机器人纯化前样品。
  2. 离心 10 分钟，9,600 x g。
  3. 添加 400 µl 1× TAE，10 mM MgCl₂ 折叠缓冲液2).
  4. 重复步骤 4.2 和 4.3，共进行两次。
  5. 离心 5 分钟，9,600 x g。
  6. 将滤器倒置放入干净的微量离心管中，于9,600 × g离心1分钟，以回收浓缩样品。最终体积可能因初始加入滤器中的制备反应混合物体积不同而有所差异。通常为25-60 µl 获得浓缩纳米机器人样品的终体积。
  7. 通过分光光度计在 260 nm 处测定样品中 DNA 的浓度。使用分子量 5.3 µg/pmol 在计算纳米机器人样品的摩尔浓度时。
    注意：双链DNA的摩尔消光系数， 50 µg/OD260, 足以满足大多数应用需求。 48 µg/OD260 考虑了边缘 staples 上的多聚胸腺嘧啶单链 DNA 片段。

5. 折叠纳米机器人琼脂糖凝胶电泳分析

  1. 制备含 10 mM MgCl2 的 0.5× TBE（45 mM Tris-硼酸盐，1 mM EDTA）和 2% 琼脂糖凝胶（改编自 Ernesto Castro 等21）：
    1. 将 6.25 ml 的 10× TBE 储存缓冲液加入 118.75 ml 的 ddH2O 中，稀释配制 0.5× TBE 缓冲液。
    2. 将 2.5 g 琼脂糖溶解于 125 ml 的 0.5× TBE 缓冲液中。
    3. 在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。
    4. 加入 1.25 ml 的 1 M MgCl2，使终浓度为 10 mM。
    5. 加入 7 µl 的 10 mg/ml 溴化乙锭。
    6. 待溶液稍冷却后，在琼脂糖凝固前倒入凝胶托盘，并立即插入合适的梳子。
    7. 通过将 50 ml 的 10× TBE 储存缓冲液和 10 ml 的 1 M MgCl2 加入 940 ml 的 ddH2O 中，配制 1 L 的 0.5× TBE 电泳运行缓冲液。
    8. 凝胶完全凝固后，向电泳装置中加入运行缓冲液，并将装置置于冰浴中。
  2. 在凝胶上加载纳米机器人纯化前（步骤 3.2）和纯化后（步骤 4.7）的总 DNA 各 1 µg，同时加载支架 DNA 样品和 1 kb DNA 标记物。示例见图 2。实际加样体积取决于纯化后的浓度。每个样品均按 1:6 的终体积比与上样缓冲液混合后上样。
  3. 将电源设定为 80 V，电泳运行 3 小时。电泳过程中需将装置置于冰水浴中。若琼脂糖凝胶在电泳过程中升温，纳米机器人会解折叠并呈现为弥散条带。电泳期间应添加额外冰块以防止装置过热。
  4. 在紫外灯台下观察凝胶（图 2）。

6. 采用甲酸铀酰对纳米机器人进行负染色

  1. 2% 甲酰酸铀酰储备溶液的制备（改编自 Castro 等23）：
    1. 将 100 mg 甲酰酸铀酰粉末称取至 15 ml 离心管中。
    2. 将无 DNase/RNase 的超纯水煮沸 3 分钟以去除氧气。
    3. 向含有甲酰酸铀酰粉末的 15 ml 离心管（来自上一步）中加入 5 ml 去氧热水（约 60 °C）。盖紧管盖，用铝箔包裹，并在涡旋振荡器上剧烈振荡 10 分钟（将离心管固定在涡旋振荡器上）。溶液应呈现浑浊的黄色。
    4. 通过 0.2 µm 注射器滤器过滤溶液。溶液应变为澄清。
    5. 将 200 µl 溶液分装至微量离心管中。
    6. 在台式离心机中以最大转速离心 5 分钟，使样品沉降至管底。
  2. 样品加样至载网及负染色：
    1. 解冻一份 200 µl 的 2% 甲酰酸铀酰溶液（按步骤 6.1 制备）。加入 10 µl 0.5 M NaOH 溶液，并剧烈涡旋振荡 3 分钟。使用台式离心机以最大转速离心 5 分钟。
    2. 同时，使用室内空气对载网进行辉光放电处理，条件为 0.2 mbar 和 25 mA，持续 30 秒。
    3. 取纯化后的 2 nM 纳米机器人样品 15 µl（来自步骤 4.7），加至载网（用镊子夹持）的正面，静置吸附 1 分钟。将载网置于滤纸上，利用滤纸吸除多余液体。切勿触碰载网表面。
    4. 向载网（用镊子夹持）正面加入 10 µl 2% 甲酰酸铀酰溶液（来自步骤 6.2.1）。
    5. 迅速将载网置于滤纸上，用滤纸吸除多余液体。切勿触碰载网表面。
    6. 重复步骤 6.2.4 和 6.2.5。
    7. 向载网（用镊子夹持）正面加入 10 µl 2% 甲酰酸铀酰溶液（来自步骤 6.2.1），静置染色 30 秒。
    8. 将载网置于滤纸上，用滤纸吸除多余液体。切勿触碰载网表面。
    9. 将载网正面朝上放置于滤纸上，完全干燥至少 30 分钟，然后送入透射电子显微镜（TEM）进行观察。

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结果

代表性结果如图2A所示。所有泳道均上样1 µg总DNA，通过分光光度计（OD260）测定。与环状单链DNA支架（第2泳道）相比，由于DNA折纸纳米机器人在支架上结合了短链DNA后分子量更高，因此在凝胶中迁移受阻（第3泳道，红色箭头）。第3泳道中低分子量条带代表未与支架DNA结合的过量短链DNA（绿色箭头）。通过离心过滤纯化后，大部分过量短链DNA被去除（第4–6泳道），此时纳米机器人可准备装载与手柄互补链偶联的货物分子14,15,22。第4–6泳道中出现的高分子量条带代表纳米机器人二聚体（蓝色箭头），即相互结合的纳米机器人群体。在制备过程中降低支架DNA的浓度（至5或10 nM）可能减少此类高分子量结构的相对含量。第4–6泳道展示了在纯化步骤上略有调整的纯化后纳米机器人样品，具体差异包括：加入离心滤膜的初始纳米机器人体积（步骤4.1，第4泳道：50 µl；第5泳道：100 µl；第6泳道：100 µl），以及向滤膜中添加缓冲液的次数（步骤4.4，第4泳道：2次；第5泳道：2次；第6泳道：5次）。

不同实验...

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讨论

我们描述了DNA纳米机器人制备、纯化及可视化的方法。在完成该装置的六边形骨架制备后，通过向纳米机器人中引入特定的载荷分子和感应链，即可对其功能进行编程；这些分子会凭借与可用单链对接位点之间的氢键互补性，迅速定位至指定位置14,15,22。

所述的制备方案采用缓慢退火程序，这通常在我们的实验室中用于折叠多种DNA折纸结构。如果生产时间成为关键因素，则可采用其他方案，例如Sobczak等人等24 描述的快速折叠方案。该方案据报道可实现高产率的DNA折纸折叠，但需要针对每种DNA折纸结构进行校准。

采用离心过滤法从过量的短链DNA（staples）中纯化纳米机器人。将样品或缓冲液上样至离心柱时，应注意避免移液枪头损伤膜。膜一旦破裂，将导致产率显著降低。建议在通过琼脂糖凝胶电泳（AGE）观察到纳米机器人之前，不要丢弃穿滤液。

对于某些应用，需要更高的纯化率；这可以通过使用原始的离心柱重复过滤步骤来实现。若需要更高的纯度...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨向 S. Douglas 致以诚挚感谢，感谢其富有价值的讨论与建议；同时感谢 Bachelet 实验室全体成员提供的有益讨论与工作支持。本研究得到生命科学学院与纳米技术研究所资助项目的资助。 & 巴伊兰大学先进材料学院

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无DNase/RNase的蒸馏水Gibco10977
M13mp18 单链DNA支架NEBN4040S
10x TAEGibco15558-042
1 M MgCl2AmbionAM9530G
Amicon Ultra 0.5 ml 离心滤膜，100K MWCOAmiconUFC510024
琼脂糖PromegaV3125
TBE缓冲液PromegaV4251
溴化乙锭 10 mg/ml 溶液Sigma AldrichE1510
1 kb DNA MarkerNEBN3232S
上样染料NEBB7021S
甲酸铀酰polysciences24762
碳支持膜透射电镜载网 Science servicesEFCF400-Cu-50
Thermal Cycler c1000 TouchBio-Rad
Glow Discharge K100XEmitech
UV凝胶成像系统 Gel Doc EZ ImagerBio-Rad
NanoDrop 2000cThermo Scientific
透射电子显微镜 FEI-G12Tecnai

参考文献

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