折叠的DNA折纸一个生物反应机器人与表征

摘要

DNA 折纸是一种通过对 DNA 分子的自组装进行编程来制造精确纳米级物体的强大方法。在这里，我们描述了一种从 DNA 折纸折叠生物响应机器人的方案，其纯化和用于透射电子显微镜成像 （TEM） 的负染色。

摘要

该DNA纳米机器人是一个中空的六角纳米器件，设计成响应于特定的刺激和本货物内部隔离开。既刺激和货物可以根据具体需要量身定做。在这里，我们描述了DNA纳米机器人制造协议，与使用DNA折纸技术。该步骤首先短单链DNA订书钉混合到原料混合物中，然后加入到长圆形，单链DNA的支架中的折叠缓冲液中的存在。一个标准的热循环仪被编程，以逐渐降低所述混合反应温度，方便钉到脚手架退火，这是纳米机器人的折叠背后的导向力。一旦60小时折叠反应完成后，过剩的钉被使用离心过滤器，接着经由可视琼脂糖凝胶电泳（AGE）丢弃。最后，将纳米机器人的制造成功是由透射电子显微镜检验（TEM）与使用双氧铀酸盐作为负染色。

引言

的用途核酸纳米技术是惊人。在Watson-Crick碱基配对的易处理性以及大规模合成的定制寡核苷酸²的易用性和相对低的成本已生成的应用³中的DNA纳米技术领域的爆炸和研究。结构DNA纳米，基于所述不动的塞曼结^4,5-作为基本构建块利用的DNA，作为任意形状^6-8的结构的自组装基本单位。

脚手架DNA折纸⁹技术的最新发展使得复杂的2D / 3D纳米结构^10-12亚纳米级精度的建设，是建设新的功能对象日益增长的复杂性和惊人的多样性的有效途径。施工过程是基于一个长脚手架单链DNA，通常是从病毒染色体组衍生即，它可以通过几百短单链DNA寡核苷酸的杂交被折叠称为订书钉。通过这种技术获得的高结构分辨率是DNA双螺旋的自然尺寸的直接结果，而制造的再现性剪裁短单链订书钉序列以促进最大的氢键互补达到的结果。与使用慢温度退火的斜坡设计最低能量，热力学优选的纳米结构中达到高的产率和保真度。在计算机代码轻松实现连接处的设计规则允许的CAD工具，如caDNAno ¹³的发展，也极其简化设计包含数百个路口相连的大，结构复杂的任务。

先前我们描述的DNA纳米机器人的设计与caDNAno工具^14,15的助剂。在这里，我们描述的制造和可视化，通过透射电子显微镜（TEM），所述纳米机器人，一个三维空心六角纳米器件，具有尺寸为35×35×50纳米的^三件设计成经受到预定刺激和本具体货物中，响应一个主要的构象变化，例如蛋白质或核酸的寡核苷酸，隔离内部。虽然12装载站可在空心机箱内部，束缚货物的实际数量与不同尺寸的货物。货物分子范围从小型DNA分子的酶，抗体和5-10纳米金纳米颗粒。 Cargocan要么是均匀的或异质的，使得每个纳米机器人包含不同的分子的混合物。感测通过两个双螺旋锁定门设计实现成感测蛋白质，核酸或其它化学品，或者基于适体传感器^16,17或DNA链置换¹⁸的技术。在适体选择的协议^19-21最近的事态发展使纳米机器人的设计响应到分子和细胞类型的不断增加的范围。

早期的工作表明一个纳米机器人携带的特异性抗体，其在结合其抗原可以中继既抑制性或多产的信号，以特定的细胞类型的内部以混合细胞群^15。这些纳米器件的一个令人兴奋的特性是他们与一个单一的群体推出不同的纳米机器人亚型的执行更为复杂的任务和逻辑控制能力。最近，我们证明了在执行作为正或负调节纳米机器人的特定亚型，控制含活性货物分子²²的效应器群体。

这里介绍的协议描述门控与选择性结合的PDGF以促进纳米机器人^15,22的开口适体传感器序列的纳米机器人的制造中，纯化和成像。中描述的制造过程类似于n个anorobot制造工艺最初由Douglas 等人 ¹⁵的变化旨在减少整个过程持续时间所描绘的，同时增加了产率和纯化率。

方案

1.准备的斯台普斯池混合

1. 如表 1中所列的96孔板顺序冻干的DNA纳米机器人订书钉（ 见材料），并归一至10纳摩尔。将DNA纳米机器人的设计和结构的详细描述，请参见本- Ishay 等人 ¹⁴和Douglas 等人^15）。
2. 重构各订书钉以及用DNA酶/无RNase超纯至100μM的浓度。主食归到10纳摩尔，重组与100微升超纯水。
3. 池一起20微升各订书钉的使用多通道移液器和无菌55毫升解决方案盆地。
   注：由于纳米机器人形状是由254短 ​​链（包括核心，边缘，手柄和指南序列， 表1），每个U形钉池中的订书钉的浓度为394纳米。从订书钉池中取出钉，或添加一些不同的卷超微电极，可降低产率相当，或者以其他方式导致展开聚集体。

2.制备制作反应液

1. 对于一个标准的反应混合物用40微升的M13mp18病毒基因组的环状单链DNA中，对应于4皮摩尔脚手架的DNA（100nM的原液， 见材料）。支架在制造混合物的最终浓度为20nM的，最终体积200微升。
   1. 调整根据具体需要脚手架DNA的量;然而，保持在反应混合物中的DNA支架的最终浓度在恒定的20纳米。
2. 添加订书钉达到支架为1订书钉比率至10。对于20纳米支架DNA浓度，每254订书钉'最终浓度是200nM的。对于200微升最终反应体积加上102微升斯台普斯游泳池混合物（第1.2节）的。
   1. 添加特定的门序列，分别为thË折叠反应混合物在这个时候。这些寡单独订购，并要求HPLC纯化。确保门寡核苷酸存在于1:10支架到门序列比， 即 200nM的每种寡核苷酸的20nM的脚手架浓度。对于200微升折叠反应体积，在100微米的股票浓度增加0.4微升每个四门寡。
3. 添加10倍TAE储备缓冲到达1×TAE（40mM的Tris-醋酸，1mM EDTA）中的最终浓度。对于200微升折叠反应体积，加入20微升的10X TAE。
4. 添加1M的_MgCl 2的，以10mM的终浓度。对于200微升折叠反应体积，加入2微升的1M _氯化镁 。
5. 添加36微升DNA酶/ RNA酶游离超纯水，使达到200微升的最终体积。
6. 涡和分装100微升样品到PCR小瓶。
   注：请有关最大反应体积中使用热循环仪规范。减少体积，以满足这些限制将不降低获得的收益率。反应体积上述规定将危及收益率的最大值。

制作反应3.温度退火斜坡

1. 程序热循环仪如下：
   1. 坡道85℃至60℃，在5分钟/℃的速率。
   2. 斜坡60℃至4℃下以75分钟/℃的速率。
   3. 保持在4℃下去。
2. 经过加工已经结束商店样品在-20℃。

4.去除多余史泰博

1. 加入100微升的折叠反应混合物与0.5 ml的离心过滤器100 kDa的的MWCO。保存纳米机器人预纯化供以后分析的10微升样品。
2. 离心机在9,600×g的10分钟。
3. 加入400微升的折叠缓冲液（1×TAE，10毫米氯化镁_2）。
4. 重复步骤4.2和4.3的两倍多。
5. 离心5分钟，在9,600×g的。
6. 通过将过滤器倒置在一个干净的离心管中，自旋为1分钟，在9600×g下恢复该浓缩物。最终体积可以根据制造反应混合物的初始体积被放入过滤器的不同而不同。通常浓缩纳米机器人样品的25-60微升最终体积被获得。
7. 测量通过分光光度计在样品中的DNA的浓度在260纳米。计算摩尔浓度的纳米机器人的样品时，应采用5.3微克/皮摩尔分子量。
   注：摩尔消光系数为双链DNA，50微克/ OD _260，足以满足大多数应用。 48微克/ OD ₂₆₀考虑到聚胸腺嘧啶的ssDNA延伸在边缘处缝合钉。

折叠纳米机器人的5琼脂糖凝胶电泳分析

1. 补充了10mM的MgCl ₂ 0.5×TBE（45毫摩尔Tris-硼酸盐，1mM EDTA中），2％琼脂糖凝胶的制备（改编自埃内斯托·卡斯特罗^等 [21]。）：
   1. 在118.75双蒸₂ O.毫升准备0.5X TBE缓冲液稀释6.25毫升10倍TBE储备缓冲
   2. 溶解2.5克琼脂糖在125毫升的0.5×TBE缓冲液。
   3. 沸腾在微波直到琼脂糖完全溶解。
   4. 加入1.25毫升的1M的MgCl _2的 10mM的最终浓度。
   5. 加7微升10毫克/毫升的溴化乙锭。
   6. 等待解决方案，以偏凉和琼脂糖凝胶固化前，填补了凝胶托盘。立即安装所需的梳子。
   7. 制备1升0.5×TBE缓冲液加入50毫升10×TBE储备缓冲和10ml的1M _MgCl 2的940至双蒸_{2 O}中的溶液
   8. 一旦凝胶是固体加载运行缓冲液的电泳设备，并把设备在冰浴中。
2. 在纳米机器人预净化负载1微克总DNA（步骤3.2），和纯化后（步骤4.7），旁边一个支架DNA样品和1 kb的DNA标记，凝胶上。给出一个例子在图2中。样品的实际量取决于纯化后得到的浓度。每个样品装入在1装载缓冲液：6终体积比。
3. 设置电源到80伏，并运行凝胶3小时。运行在装满冰和水的浴中的凝胶。纳米机器人将展开，如果琼脂糖凝胶电泳过程中加热出现一抹黑。电泳过程中添加额外的冰块，以保持设备的加热。
4. （ 图2）紫外线表视图凝胶。

纳米机器人6.用铀甲酸盐负染色

1. 2％的铀甲酸盐原液制备（改编自卡斯特罗等^23）：
   1. 权衡的双氧铀酸盐粉末100毫克到15毫升管。
   2. 煮沸DNA酶/ RNA酶的超纯水进行3分钟脱含氧化合物。
   3. 添加5毫升脱氧热水（〜60℃）入15ml试管中含有双氧铀酸盐粉末（来自之前的步骤）。紧紧合上机盖，包装在铝箔和涡严格的10分钟（系管涡流）。溶液应出现浑浊带有黄色。
   4. 通过0.2微米注射器滤波器过滤解决方案。解决方法应该很清楚。
   5. 分装200微升的溶液倒入离心管中。
   6. 离心机中以最大速度为5分钟在台式离心机以池的样品在管的底部。
2. 样品电网和消极染色加载：
   1. 除霜2％铀甲酸盐溶液（6.1节准备）200微升等分。加入10微升0.5M的NaOH溶液和涡旋严格3分钟。离心机中以最大速度用台式离心机5分钟。
   2. 同时，辉光放电网格使用室内空气在0.2毫巴和25 mA的30秒。
   3. 添加15微升为2nM纳米机器人样品的纯化后（secti上4.7）到电网的顶侧（用镊子保持），并让吸收1分钟。使用滤波器纸张放置在网格上的滤纸的顶部以排出多余的液体。请勿触摸网格表面。
   4. 加入10微升2％的铀甲酸盐（从步骤6.2.1）的网格上的顶面（用钳子举行）。
   5. 快速使用滤波器纸张放置在网格上的滤纸的顶部以排出多余的液体。请勿触摸网格表面。
   6. 重复步骤6.2.4和6.2.5。
   7. 加入10微升2％的铀甲酸盐（从步骤6.2.1）的网格上的顶面（用钳子举行）。让染色溶液吸收30秒。
   8. 使用滤波器纸张放置在网格上的滤纸的顶部以排出多余的液体。请勿触摸网格表面。
   9. 让格完全干燥至少30分钟，面朝上的滤纸，注射入的TEM之前。

结果

代表性的结果示于图2A。所有泳道含有1微克总DNA，通过分光光度计（OD _260）来测定。与环状单链DNA的支架（泳道2）相比，纳米机器人是受阻在凝胶由于它们的较高分子量，的订书钉杂交至骨架的DNA的结果（泳道3.红色箭头）。在泳道3的低分子量带代表其中不结合该支架的DNA（绿色箭头）过量订书钉。通过离心过滤纯化后大部分过量的订书钉被除去（泳道4-6）和纳米机器人准备下载缀合于把手互补链^14,15,22货物分子。泳道4-6含有超高分子量带代表纳米机器人二聚体（​​蓝色箭头），纳米机器人的这些结合在一起的人口。降低制造过程中的支架的浓度（以5或10纳米）可以潜在热镀CE这些高分子量结构的相对量。泳道4-6显示纳米机器人后净化用轻微变化所描述的纯化方案，即制造的纳米机器人的初始体积加入到旋转过滤器（步骤4.1泳道4：50微升;泳道5：100微升;泳道6：100微升），和次缓冲液加入到过滤器的数目（步骤4.4泳道4：2倍;泳道5：2倍;泳道6：5次）。

的不同变化到协议（图2C...

讨论

我们介绍的加工，净化，和可视化的DNA纳米机器人的。继装置的六边形底盘的制造中，所述纳米机器人的功能进行编程时将简单介绍的特定货物和传感链到机器人容易地找到它们的指定的位置，由于氢键互补可用单链对接位点^{14 ，15,22。}

描述的制造协议使用缓慢退火坡道，其通常使用在我们的实验室折叠广泛折纸形状。如果生产时间成为关键因素的其它协议，如由Sobczak 等描述的快速折叠协议²⁴可以使用。该协议被报告以实现高产率折纸折叠，然而它需要校准每个折纸形状。

自旋过滤被用来净化从过量订书钉的机器人。当装载在S与样品或缓冲销柱，应注意不要损伤膜枪头。该膜可以潜在破裂从而显着降低了产量。明智的做法是不丢弃流过，直到纳米机器人是由AGE可视化。

对于某些应用程序更高的净化率需要;这可以通过使用原始旋转柱重复过滤来实现。对于甚至更高的纯度，一个新的旋转柱可以使用，然而，这将对收率率产生重大的负面影响。其它方法用于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含 DNase/RNase 的蒸馏水	Gibco	10977
M13mp18 ssDNA 支架	NEB	N4040S
10x TAE	Gibco	15558-042
1 M MgCl2	Ambion	AM9530G
Amicon Ultra 0.5 ml 离心过滤器 100K MWCO	Amicon	UFC510024
琼脂糖	Promega	V3125
TBE 缓冲液	Promega	V4251
溴化乙锭 10 mg/ml 溶液	Sigma Aldrich	E1510
1 kb DNA 标记	NEB	N3232S
加载染料	NEB	B7021S
甲酸铀酰	polysciences	24762
碳涂层 TEM 网格	科学服务	EFCF400-Cu-50
热循环仪 c1000 Touch	Bio-Rad
辉光放电 K100X	艾米特
紫外台式凝胶 Doc EZ 成像仪	Bio-Rad
NanoDrop 2000c	Thermo Scientific
TEM FEI-G12	Tecnai