记录鸽子在自由移动状态下经历三个学习阶段的单个神经元动作电位

摘要

学习新的刺激-反应关联会激活广泛的神经过程，最终反映为单个神经元放电输出的变化。本文描述了一种行为学实验方案，可在单次实验过程中持续记录动物在习得、消退及重新习得条件反应时的单个神经元活动。

摘要

尽管学习这一主题长期受到行为科学与神经科学领域研究者的广泛关注，但仅有相对少数的研究人员在动物获得操作性条件反射或该反射被消退的过程中，观察过单个神经元的活动。然而，即便在这些研究中，观察期通常也仅涵盖学习的单一阶段。 即 获得或消退，但不同时进行（例外情况包括采用逆转学习的方案；参见 Bingman） 等¹ 例如，习得与消退涉及不同的学习机制，因此预期会伴随不同类型和/或不同脑区的神经可塑性变化。

因此，我们开发了一种行为范式，可在单次行为实验中实现学习的三个阶段，并适用于同时记录单个神经元的动作电位。动物被训练执行一种单时间间隔的强制选择任务，要求将两种可能的选择反应分别与不同新异视觉刺激的呈现相对应（习得阶段）。当达到预设的行为表现标准后，其中一种选择反应不再受到强化（消退阶段）。在行为表现水平出现一定程度下降后，再次对正确反应进行强化（再习得阶段）。通过在每次实验中使用一组新的刺激，动物可反复经历习得-消退-再习得的过程。由于学习的三个阶段均发生在单次行为实验中，该范式非常适用于同时观察多个单神经元的放电输出。我们采用鸽子作为模型系统，但该任务可轻松推广至任何具备条件性辨别学习能力的其他物种。

引言

学习新的刺激-反应-结果关联会涉及广泛的神经可塑性过程。这些过程最终反映在单个神经元放电输出的变化上。可以说，最常采用的学习范式之一是利用啮齿类动物进行的巴甫洛夫式恐惧条件反射实验。在此实验条件下，条件反应的习得与消退可在数十次试验内完成²。条件性恐惧的快速形成具有优势，因为它允许在短时间内测试大量动物。此外，在未经训练的动物中，条件反应的习得和消退既可在单日内通过数十次试验完成^3,4，也可分布在2 至3 天内完成^2,5-8。然而，从这些实验中获得的关于学习过程中神经活动变化的认识，并不一定适用于恐惧条件反射以外的情境。例如，由正向强化驱动的目标导向行为，更适合通过操作性条件反射而非巴甫洛夫条件反射来建模，且可能部分依赖于不同的神经基础^9,10。此外，恐惧条件反射发展极为迅速，导致对条件刺激（CS）的神经反应仅能在数十次试验中被观察到，这严重限制了对学习过程中神经活动变化的分析。

遗憾的是，操作性反应的获得与消退通常需要数天时间。这对于神经生理学研究而言是不利的，因为记录单个细胞的活动超过数小时已众所周知地困难。由于细胞外记录的动作电位波形具有高度相似性，很难断言某一天记录到的锋电位与第二天记录到的具有相似波形的锋电位来自同一个细胞^11,12，尤其是在细胞密度较高的脑区，如海马体。

为了解决这....

方案

伦理声明

所有实验均按照德国关于科学实验动物护理与使用的指南进行。相关操作程序已获得德国北莱茵-威斯特法伦州国家伦理委员会的批准。

系统概述

操作性测试箱

操作箱（图1）尺寸为34 cm × 34 cm × 50 cm。箱体后壁嵌入三个半透明的反应键（4 cm × 4 cm，距箱底约20 cm高处）。刺激通过安装在反应键后方的LCD平板屏幕呈现。箱体两侧壁装有两个2瓦的灯泡，提供微弱照明。操作箱置于隔音屏蔽箱内，以屏蔽外界噪音。扬声器持续播放白噪音。食物（谷物）由位于中央反应键下方的食物分配器提供。实验硬件由自行编写的MATLAB代码²¹控制。动物通过安装在箱体前壁的数字摄像机进行持续监测。

定制微驱动装置

我们实验室自行定制了容纳16根电极丝的微型驱动装置；其设计基于Bilkey及其同事的研究^22,23，详细描述请参见这些文献。我们对该设计进行了改进，以容纳更多电极（16根而非8根；25 µm镍铬电极丝），并通过导电银胶将电极丝连接至前置放大器插座。此外，我们对电极尖端进行镀金处理以降低阻抗，提高信....

结果

行为

图4A 显示了某只动物在一次示例实验中的行为表现。该动物在180次试验（45次刺激呈现）内即达到NS 2的判定标准，且从实验开始时对NS 1的反应正确率就接近100%。这种策略——即最初对两个新刺激均作出相同的按键反应，随后再对其中一个刺激调整反应——与最初对两个新刺激均随机反应的情况出现频率大致相当。在本实验中，NS 2被随机选定进入消退阶段，意味着在此刺激之后的所有选择均不再产生后果（学习阶段之间的转换以垂直的黑色虚线表示）。在消退阶段，动物对消退刺激的反应表现下降，但对另一新刺激（NS）的反应表现仍保持较高水平。在第370次试验时达到判定标准。此后，正确与错误反应再次分别受到强化与惩罚（重新习得阶段），在第402次试验时表现水平再次达到标准。对FS的反应表现始终维持在较高水平（>95%；数据未显示）。b) 完成各学习阶段所需平均试验次数（共5只动物，总计44次实验的平均值）。平均而言，动物需要约700次试验才能稳定地作出正确反应。消退阶段平均需要约900次试验，而重新习得阶段仅需约60次试验，显著少于最初的习得阶段（图4B

讨论

本方案描述了一种适用于同步单细胞记录的复杂行为学任务。我们以鸽子的SIFC任务为例进行了说明，但该任务可轻松改编用于啮齿类动物 ，只需将按键啄击改为鼻触或按压杠杆，并将视觉刺激替换为嗅觉、听觉或触觉刺激即可。

训练过程中最关键的步骤可能是：1）逐步降低奖励概率，以及 2）增加试验次数。关于熟悉刺激的间歇性强化，我们选择的奖励概率范围为 0.5 至 0.8；这一范围足以维持稳定的表现，同时又足够低以防止过早的满足感。然而，许多鸟类在奖励概率低至 0.2 时仍愿意保持良好的表现。

每轮实验需要进行大量试验（500–1,500 次），原因在于条件反应的习得、消退和再习得本身就需要如此多的试验次数，同时也因为当试验次数少于约25次时，难以精确估计神经元的放电率，尤其是在记录低放电率神经元时（在NCL中，基础放电率<1 Hz）。因此，我们将完成一个学习阶段所需的最少试验次数设定为每个刺激至少呈现35次。

对于未经训练的动物而言，完成SIFC任务的训练大约需要4个月.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电阻丝（用作电极）	美国加利福尼亚州格罗夫海滩，加州细线公司		Stablohm 675；镀有formvar的镍铬丝（外径25 µm)
微连接器	加拿大安大略省尼皮安，Ginder Scientific公司		GS18PLG-220（插头） & GS18SKT-220（用于构建前置放大器的插座）
套管针	Henke Sass Wolf，德国图特林根		0.4 × 20 mm / 27 G × 3/4"
镀金溶液	Neuralynx，博兹曼，蒙大拿州，美国		SIFCO 工艺金无氰，编号 5355
超声波清洗机用溶液	Alconox, Inc.，美国纽约	1304	Tergazyme
导电胶	Henkel Loctite		LOCTITE 3888 银填充导电胶黏剂
不锈钢螺钉	J.I. Morris，美国马萨诸塞州索斯布里奇		F0CE125 自攻微型螺钉，体长 1/8 英寸
光固化牙科粘接剂	van der Ven 牙科，杜伊斯堡，德国		Omniceram Evo Flow A2
光固化仪	van der Ven 牙科，杜伊斯堡，德国		Jovident Excelled 215 光固化灯（无线LED光固化装置）
滤波放大器	npi electronic GmbH，德国	DPA-2FS
模数转换器	英国剑桥，剑桥电子设计公司	power 1401
Spike2 软件	英国剑桥，剑桥电子设计公司		版本 7.06a
MATLAB	The Mathworks，美国马萨诸塞州纳蒂克		R2012a