依次 体内 骨折修复过程中成骨干细胞/祖细胞的成像

摘要

对骨折愈合过程中骨祖细胞功能进行定量测量，需要高分辨率的连续成像技术。本文提供了利用活体显微镜结合成骨谱系示踪技术，对内源性成骨干细胞/祖细胞在修复骨骨折过程中的迁移、增殖和分化进行连续成像与定量分析的实验方案。

摘要

骨骼不断更新，并在受伤后具有很强的再生能力。人们长期以来一直推测成骨干细胞/祖细胞可能存在，但 体内 此类细胞的展示直到最近才得以实现。此处， 体内 提供用于研究内源性成骨干细胞/祖细胞（OSPCs）及其子代细胞在骨修复中作用的成像技术。利用成骨细胞谱系示踪模型及对颅骨诱导微骨折进行活体成像，可在损伤后最初数天内直接观察OSPCs，此阶段正是骨修复早期关键事件发生的时期。通过连续成像可追踪损伤部位，揭示OSPCs向损伤区域迁移、数量增加并分化为成骨细胞的过程。这些方法为研究干细胞内在及外在分子调控因子在骨再生与修复中的作用提供了有效手段。

引言

导致骨质疏松性骨折风险升高的退行性骨病及年龄相关性骨量丢失已成为公共卫生领域的主要挑战¹。骨组织的维持由成骨细胞（骨形成细胞）和破骨细胞（骨吸收细胞）共同调控。成骨细胞功能缺陷是年龄相关性骨量丢失和退行性骨病的主要原因^2,3。尽管已有大量研究致力于促进骨折愈合，但发现能够有效治疗退行性骨病并逆转骨质疏松性骨折脆弱性的可靠药物仍是当前的重要课题。因此，研究成骨细胞的来源及其在骨再生与修复过程中的调控机制，为增强骨骼再生能力及逆转骨丢失疾病提供了新的思路。

骨髓中存在多能间充质细胞，这一观点基于已鉴定出具有克隆形成能力的细胞群体，这些细胞可分化为成骨、成脂和成软骨谱系 离体⁴. 最近，多项研究报道，骨骼干细胞/间充质干细胞（SSCs/MSCs）是成骨细胞的天然来源，在骨转换、骨重塑及骨折修复过程中发挥关键作用^5,6此外，我们的谱系示踪研究发现，成熟的成骨细胞具有出乎意料的短半衰期（约60天），在正常稳态和骨折修复条件下均持续由其干细胞/前体细胞补充。⁶。然而， 体内 干细胞的身份及其对骨折损伤的反应和提供成骨细胞的能力尚不明确。因此，建立一种能够在生理条件下分析内源性SSCs/MSCs迁移、增殖和分化的方法至关重要。

骨折修复是一个由多种复杂细胞因子和生长因子调控的多细胞动态过程⁷。目前骨折研究最常用的方法是采用长骨骨折的动物模型，并通过骨组织切片和免疫荧光技术对骨组织进行分析^8-10。该修复过程可通过多种成像技术进行监测，包括显微CT¹¹、近红外荧光成像¹²和化学发光成像¹³。然而，每种技术均存在一定的局限性，目前尚无有效方法可在活体（in vivo）水平上于细胞层面监测骨骼干细胞（SSCs）/间充质干细胞（MSCs）的功能。近年来，共聚焦/双光子活体显微成像技术已被开发并用于在活体动物中，以单细胞分辨率检测移植的癌细胞和造血干细胞在其骨髓微环境中的行为¹⁴。通过将该技术与一系列谱系示踪模型相结合，我们发现成骨干细胞/祖细胞可通过myxovirus resistance-1（Mx1）启动子的瞬时激活实现遗传标记，且Mx1诱导产生的祖细胞能够长期维持大部分成熟成骨细胞，但在成年小鼠中不参与软骨细胞的生成⁶。此外，我们还证明了在骨折愈合过程中，新生成的成骨细胞主要来源于Mx1标记的骨源性祖细胞（OSPCs）⁶。

此处利用骨系追踪模型和活体显微技术，提供了一种定义 体内 动力学 Mx1⁺ 骨折修复中的成骨干细胞/祖细胞。本方案提供连续成像技术，用于追踪成骨干细胞/祖细胞向骨折部位的迁移过程，并对早期修复阶段中成骨祖细胞的扩增进行定量测量。该方法可适用于多种研究场景，包括评估促进骨修复的潜在治疗候选物。

方案

1. 小鼠与预处理

注意：所有小鼠均饲养于无病原体环境中，所有实验方案均经麻省总医院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。所有手术操作均应使用经高压灭菌的无菌器械，在无菌条件下进行。 Mx1-Cre¹⁵, Rosa26-loxP-stop-loxP-EYFP （Rosa-YFP），以及 Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato （蔷薇-番茄）, 购自杰克逊实验室。 Osteocalcin-GFP 小鼠由Henry Kronenberg博士提供。用于OSPC迁移和增殖的定量分析 体内, Mx1-Cre⁺Rosa-YFP⁺ （单色报告基因）小鼠被用于更详细地追踪其向分化的过程 骨钙素⁺ 成熟的成骨细胞，我们使用了三重转基因 Mx1-Cre⁺Rosa-Tomato⁺Ocn-GFP⁺ 小鼠

1. 标记 Mx1⁺ 细胞 体内，用无菌PBS溶液配制聚胞苷酸-聚肌苷酸（pIpC，2.5 mg/ml），按每20 g体重注射200 μl Mx1-Cre⁺ 每两天一次，连续10天，通过腹腔注射将报告基因小鼠给药。
2. 为了消除常驻 Mx1⁺ 造血细胞，在单次照射剂量为9.5 Gy的条件下对小鼠进行照射。照射后24小时，移植野生型骨髓细胞（1×10⁶）⁶ 细胞/小鼠，静脉注射¹⁶。注意：由于 Mx1可诱导细胞包括造血细胞和由造血细胞衍生的破骨细胞，其消除 Mx1⁺ 造血细胞提高了成像质量和定量分析的准确性 Mx1⁺ 成骨细胞
3. 骨髓移植后，需对动物进行四到六周的监测，以确保供体骨髓细胞成功重建造血。

2. 小鼠准备

1. 按照IACUC批准的操作规程，通过腹腔注射50 μl的氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮100 mg/kg，赛拉嗪12 mg/kg体重）对小鼠进行麻醉。注意：可通过追加一次氯胺酮/赛拉嗪剂量来延长麻醉作用时间。
2. 通过轻捏脚趾和/或尾巴无反应来判断小鼠是否已完全麻醉。（可选）小鼠麻醉后，用胶带将异氟烷气体面罩固定于鼻部，并调节异氟烷浓度以确保动物处于充分镇静状态。
3. 使用电动剪刀或小剪刀剪除头皮毛发。清除毛发碎屑，并用70%酒精棉片消毒暴露的皮肤。涂抹眼用凝胶以防止角膜脱水。

3. 微骨折损伤

1. 确认动物已完全镇静后，做一个倒L形切口以打开头皮皮肤。具体而言，先做一个横向切口（长度小于1 cm），从一侧耳部延伸至另一侧耳部。然后转向约60°，继续向鼻部方向切开，直至距离鼻部约2-3 mm处。注意：该切口可最大限度减少成像区域上方瘢痕组织的形成。
2. 用镊子将皮瓣向两侧拉开，充分暴露额骨以及矢状缝与冠状缝的交界处。
3. 用无菌PBS冲洗并用无菌纱布或棉签轻轻擦拭创面，直至彻底清除所有残留毛发。
4. 为在颅骨上制造微骨折，用一只手固定小鼠头部，另一只手持30 G针头。在左侧额骨靠近矢状缝与冠状缝交界处，以轻微压力并配合旋转动作，将30 G针头尖端刺入颅骨，形成一个微穿孔（直径约0.2 mm，深度<1 mm）。注意：必须避免针头刺入脑组织，以最大限度减少出血和组织损伤。
5. 更换为较大针头（20 G或25 G），通过旋转针头扩大穿孔至约0.5 mm直径。
6. 重复步骤3.3–3.5，在对侧额骨上制造第二个穿孔。
7. 持续滴加PBS并擦拭损伤部位，直至出血停止。
   注意：骨折部位出血会影响成像质量，并诱发瘢痕形成。
8. 在颅骨表面滴加一滴无菌生理盐水或2% Methocel，防止干燥。注意：切勿让颅骨表面干燥，否则会降低成像清晰度。应使用足量的凝胶或盐水完全覆盖成像区域。

4. 活体成像

1. （可选）成像前，可对部分小鼠注射血管染料以可视化血管。通过眼眶后注射方式注入 80 ml PBS 中稀释的 20 μl 非靶向 Qtracker 705（50 mM 硼酸盐缓冲液中的 2 μM 溶液）。使用胰岛素注射器以尽量减少试剂浪费。若信号亮度不足，可能需要增加注射量。
2. 打开扫描仪。注意：基于多边形的激光扫描仪可实现多通道图像的同步采集，速率达视频帧率（每秒 30 帧）。视频速率扫描对活体动物成像至关重要。
3. 打开多光子激光器（飞秒钛：蓝宝石激光器）。将波长设为 880 nm，并调节功率以实现骨组织的二次谐波成像（440 nm）。对于 GFP 和 tdTomato 的激发，开启 491 nm 和 561 nm 的固态激光器。
4. 为每个信号开启光电倍增管（PMT）检测器（二次谐波信号使用 435 ± 20 nm 带通滤光片，GFP 使用 528 ± 19 nm 带通滤光片，tdTomato 使用 590 ± 20 nm 带通滤光片）。（可选）使用 638 nm 氦氖激光器及配备 695 ± 27.5 nm 带通滤光片的 PMT 检测 Qtracker 705 信号。
5. 将动物置于 XYZ 轴电动显微镜载物台上。使用电加热垫使小鼠保持最舒适的位置，以维持体温（降低动物丢失风险）。用胶带固定小鼠，以减少成像过程中的移动，并尽可能使成像区域保持水平。
6. 在颅骨上滴加一滴温热的 2% 甲基纤维素凝胶或生理盐水溶液，防止干燥。在成像区域覆盖盖玻片。使用低倍物镜（30 倍水浸物镜，NA 0.9）扫描颅顶骨。
7. 通过 XYZ 轴控制器，利用骨组织产生的 SHG 信号定位颅顶骨表面，并识别关键解剖标志位置，例如矢状缝与冠状缝的交点。获取图像并记录 XYZ 坐标。
8. 继续通过观察 SHG 和荧光信号，寻找损伤位置。
9. 当找到损伤部位或感兴趣区域时，获取包含目标细胞 SHG 和荧光信号的最佳焦平面图像。保存 XYZ 坐标以及距矢状缝与冠状缝交点的距离，以精确定义该位置，供后续成像轮次使用。
10. 为获取骨折损伤的三维细胞与骨结构图像，从骨内膜表面开始，以 Z 轴堆栈（Z-stacks）方式记录图像（间隔 2–5 μm），深度约 100 μm。完成一侧损伤区域成像后，重复成像流程以获取其他损伤部位图像。

5. 术后操作步骤

1. 成像完成后，用无菌生理盐水冲洗成像部位，以去除颅骨上的甲基纤维素凝胶。使用无菌棉签，在表面涂抹少量三联抗生素软膏。覆盖皮瓣并用外科缝合线重新缝合头皮。可使用低致敏性缝合线（可吸收聚乳酸-羟基乙酸共聚物缝合线）和5-0规格的缝合针进行操作。注意：良好的缝合技术可最大限度减少瘢痕形成。
2. 术后48小时内，每隔12小时对所有动物进行一次腹腔注射0.05–0.1 mg/kg的布托啡诺。将动物置于温暖的恢复室中，直至其恢复足够意识。术后3至5天，重新打开缝合处，并重复活体成像步骤，以追踪骨折愈合过程中的细胞变化。

结果

稳定的长骨骨折模型在骨折研究中被广泛应用。然而，长骨或大范围骨折模型会造成多种组织损伤，因此在骨细胞功能的定量测量方面存在局限性。我们采用针钻在颅骨额骨上建立了一种微创损伤模型（直径小于1 mm，对硬脑膜的侵入极小或无侵入）图1A-1C）。我们选择颅顶额骨的顶部视图进行观察 体内 活体成像微骨折，因为这种骨具有扁平且薄的骨结构并含有骨髓，可在无其他组织干扰的情况下清晰成像受损骨组织、骨细胞及血管系统（图1C我们观察到，这种微骨折重现了大骨折损伤的许多特征，包括软性骨痂形成，随后是矿物质沉积和新骨形成（数据未显示）。

对Mx1⁺成骨干细胞前体细胞进行连续的活体成像。 接下来，我们检测了该方法是否能够追踪骨折愈合过程中特定的成骨细胞群体。此前，我们通过将Mx1-Cre小鼠与Rosa26-Tomato报告小鼠及骨钙素-GFP小...

讨论

骨骼干细胞的调控对于确立更优的骨再生方法可能具有重要意义。在细胞水平上进行定量和连续成像在技术上一直具有挑战性。尽管小鼠长骨骨折模型已被广泛用于生物力学研究¹⁷，但其深部组织位置、骨折尺寸不均、软组织损伤以及需使用稳定固定装置等因素，限制了连续的活体成像。本文提供了一种结合共聚焦/双光子活体显微镜与小鼠颅骨骨折模型的方法，以克服上述局限。该方法结合成骨干细胞/前体细胞谱系示踪，展示了其在骨折修复过程中对成骨干细胞/前体细胞进行实时、体内成像的能力。

该方法中的一个主要技术挑战是随时间获得一致且高质量的图像。最大成像深度下的高质量图像取决于荧光报告分子的亮度以及成像区域的组织状态。此外，为实现长期连续成像，减少激光暴露以避免组织损伤和光漂白至关重要。使用视频速率平台进行快速扫描有助于实现这一目标。若单个视野无法覆盖整个损伤区域，可通过采集拼接图像来绘制区域图谱，以涵盖大部分骨折部位。在整个成像过程中，需在Z轴堆叠图像的质量与所获取信息量之间进行权衡。例如，切片数量较多的Z轴堆叠（例如 1-2 μm 的步长）和高分辨率图像更易于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C57BL/6J (H-2b)	杰克逊实验室（美国缅因州巴港）	000664
盐酸氯胺酮注射液	Bionichepharma	67457-001-10	西林瓶规格：10 ml (50 mg/ml)
无菌赛拉嗪溶液	Lloyd 公司	NADA# 139-236
盐酸丁丙诺啡	BEDFORD 实验室	NDC 55390-100-10	西林瓶：0.3 mg/ml，剂量：0.05–0.1 mg/kg
DPBS, 1X	CORNING cellgro	21-031-CV
酒精消毒棉片（70% 异丙醇）	Kendall WEBCOL	5110
精细外科剪刀	F.S.T	14568-09
超细镊子	F.S.T	11150-10
VICRYL*Plus 缝合线	Ethicon	VCP490G
Qtracker 705 非靶向量子点	Invitrogen	Q21061
甲基纤维素 2%	OmmiVision
pIpC（聚肌苷酸-聚胞苷酸）	Sigma	P0913-50MG	每 10 g 小鼠给予 100 μl（PBS 中 2.5 mg/ml）
Mai Tai 可调谐超快激光器	Spectra Physics
Dual Calypso 491 + 532 nm DPSS 激光器	Cobolt AB
Radius-635 HeNe 激光器	Coherent