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方法文章

裂分与混合合成及肽类叔酰胺库的表征

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DOI：

10.3791/51299

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2014年6月20日

 , 
1Scripps Florida, The Scripps Research Institute

本文内容

摘要

肽类叔酰胺（PTAs）是一类包含但不限于肽、肽拟物和N-甲基化肽的肽模拟物超家族。本文描述了一种结合了 结合裂分-混合与单体前体策略，合成单珠单化合物的PTA库。

摘要

拟肽类化合物是蛋白质配体的重要来源。由于这类化合物具有寡聚特性，我们可以通过组合化学方法在固相上构建大规模的合成文库。其中研究最为广泛的一类拟肽化合物是肽类似物（peptoids）。肽类似物易于合成，且已被证明具有抗蛋白酶降解和细胞通透性等优点。在过去十年中，通过筛选肽类似物文库已鉴定出许多有用的蛋白质配体。然而，从肽类似物文库中鉴定出的大多数配体亲和力较低，仅有极少数例外。这可能部分归因于肽类似物分子中缺乏手性中心和构象限制。最近，我们报道了一种新的合成途径，可用于获得肽类叔酰胺（PTAs）。PTA是一类包含但不限于肽、肽类似物和N-甲基化肽的拟肽超家族。由于其侧链同时存在于α-碳原子和主链氮原子上，这些分子的构象受到空间位阻和烯丙基1,3-张力的显著限制。（图1）我们的研究表明，这些PTA分子在溶液中具有高度有序的结构，可用于识别蛋白质配体。我们认为，这类分子有望成为未来高亲和力蛋白质配体的来源。本文中，我们描述了一种结合了“分割-混合”（split-and-pool）与“亚单体”（sub-monomer）策略的合成方法，用于构建一个单珠单化合物（OBOC）PTA文库的示例。

引言

拟肽类化合物是一类模拟天然肽结构的化合物。其设计旨在保留生物活性的同时，克服天然肽存在的一些问题，如细胞通透性差以及易被蛋白酶降解等1-3。由于这类化合物具有寡聚特性，可通过单体或亚单体合成路线方便地构建大规模合成文库4-7。其中研究最为广泛的一类拟肽化合物是 肽素（peptoids）。肽素是由N-烷基化甘氨酸组成的寡聚物，可通过亚单体策略简便地合成8,9。通过针对蛋白质靶标筛选大规模合成的肽素文库，已成功鉴定出多种有用的蛋白质配体1,10-14。然而，从肽素文库中鉴定出的“命中”化合物通常难以达到对蛋白质靶标的极高亲和力1,10-14,22。肽素与天然肽之间的一个主要差异在于，大多数肽素由于缺乏手性中心和构象限制，通常无法形成二级结构。为解决这一问题，过去十年中已发展出多种策略，主要集中于修饰主链氮原子上的侧链15-22。最近，我们开发了一种新的合成路线，可将天然氨基酸侧链引入肽素骨架，从而构建肽类叔酰胺结构23。

肽类叔酰胺（PTA）是一类包含但不限于肽（R2 = H）、肽拟物（peptoids，R1 = H）和N-甲基化肽（R1 ≠ H，R2 = Me）的拟肽类化合物超家族。（见图1）我们的合成路线采用天然氨基酸作为α-碳上手性中心和侧链的来源，并使用市售的伯胺来引入N-取代基团。因此，可探索比简单肽、肽拟物或N-甲基化肽更广阔的化学空间。圆二色光谱表明，PTA分子在溶液中具有高度有序的结构。对其中一个PTA-蛋白质复合物的表征明确显示，PTA的构象限制对其与靶标结合至关重要。最近，我们还发现某些PTA分子相较于其对应的肽拟物和肽类化合物具有更优的细胞通透性。我们认为，这些PTA化合物库可作为针对蛋白质靶标的高亲和力配体的良好来源。本文将详细讨论一个单珠单化合物（OBOC）PTA库的合成方法，并介绍一些改进的偶联与裂解反应条件。

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方案

1. 分裂-混合合成的基本原理

为了高效地在固相上生成大量化合物，通常采用分割-混合合成法作为通用策略。如图所示 图4， Tentagel 树脂珠首先 分为三份，每份与不同的试剂反应，在树脂珠上生成第一个残基。第一次反应后，将三份混合并重新合并，再分成三份。每份再次与不同的试剂反应，在树脂珠上生成第二个残基。经过两次分池合并操作后，共生成九种化合物。

在亚单体合成中，首先将树脂珠分为若干份，分别在偶联试剂存在下与不同的溴代酸反应。用溶剂洗涤后，将所有树脂珠合并并混匀，再重新分为若干份，分别与不同的伯胺反应。胺化反应完成后，将所有树脂珠重新合并，并充分洗涤，从而在每颗树脂珠上完成一个完整的单体合成。此过程可重复进行，直至达到所需的多样性。

2. 从天然氨基酸制备酰溴

在亚单体合成中，每个单体的合成分为两个独立步骤：1. 酰溴的偶联；2. 与伯胺的胺化反应（图2）。为了合成肽类叔酰胺，将从天然氨基酸出发制备在α碳上带有侧链的手性酰溴。本文描述了将天然氨基酸高立体保真地转化为相应酰溴的方法。我们以丙氨酸为例进行说明；在类似条件下，丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等其他氨基酸也可转化为溴代酸。需要注意的是，含有酚羟基、胍基或氨基等功能基团的某些氨基酸在转化前需要进行保护。反应装置如图3所示。

安全注意事项：由于以下反应涉及 HBr、NaNO2 及其他腐蚀性/有毒化学品，必须使用适当的安全设备，如护目镜、实验服和耐化学手套。所有反应均应在通风橱内由经验丰富的化学研究人员操作。

  1. 将370 ml水加入630 ml 48% HBr溶液中，配制1 L的30% HBr溶液。将500 ml乙二醇加入1 L的浴槽容器中，加入干冰以维持温度在-10 °C。注意：48% HBr溶液具有强酸性和腐蚀性，操作时需小心。使用前请阅读材料安全数据表（MSDS）。
  2. 将D-丙氨酸（8.9 g，0.1 mol）和KBr（11.9 g，0.1 mol）加入带有磁力搅拌子的250 ml三颈圆底烧瓶中。加入100 ml上一步制备的30% HBr溶液。将烧瓶置于步骤2.1中准备好的乙二醇浴中，保持温度为-10 °C。通过一根长针从烧瓶底部通入氩气，持续10分钟，如图3所示。用磁力搅拌子以300 rpm的速度搅拌溶液。
  3. 将NaNO2（8.28 g，0.12 mol）溶于100 ml烧杯中的20 ml水中。将该溶液加入恒压滴液漏斗中，并用隔膜密封滴液漏斗。缓慢打开滴液漏斗的阀门，使NaNO2溶液滴入烧瓶中。调节阀门以控制滴加速度约为每秒2滴。保持300 rpm的搅拌速度，并持续从烧瓶底部通入氩气 。在全部NaNO2加入完毕前，烧瓶应始终保持在-10 °C的乙二醇浴中。注意：此步骤在加入NaNO2溶液过程中会产生热量和气体。滴加速度应严格控制，整个系统应通过氩气出口保持开放。
  4. 继续搅拌3小时 ，使温度从-10 °C逐渐升至室温。所得溶液应为无色至淡黄色； 若颜色过深，可施加真空以除去反应过程中生成的过量氮氧化物和可能产生的Br2。
  5. 使用分液漏斗，用3 × 35 ml 乙醚 从溶液中萃取产物。合并有机相，并用饱和食盐水洗涤。若有机相颜色较深，可在食盐水洗涤前用少量NaHCO3洗涤以去除颜色。将有机相在Na2SO4上干燥6小时。
  6. 过滤除去Na2SO4，并在减压下蒸发溶剂，得到无色至淡黄色油状粗产物。粗产物可通过在115 °C、3 mm Hg条件下蒸馏，或使用硅胶柱层析（洗脱剂为3:1正己烷:乙酸乙酯）进一步纯化。
  7. 纯品为无色油状物，6.6 g（产率74%），密度 = 1.69 g/ml，[α]D20 = +24°（甲醇），1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.41 (q, J = 7.0 Hz, 1H), 1.86 (d, J = 7.0 Hz, 3H)。对于(S)-2-溴丙酸-d4（由d4-L-丙氨酸制备），纯品为无色油状物，产率78%，密度 = 1.72 g/ml，[α]D20  = -19°（甲醇）。1H NMR中未观察到明显的氢信号。ESI-MS- [M-1]-  = 155.1（理论值154.97）。对于(S)-2-溴-4-甲基戊酸（由L-亮氨酸按相同方法制备），纯品为无色油状物，产率89%，[α]D20  = +37°（甲醇），1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 4.30 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 1.94 (dd, J = 10.8, 3.9 Hz, 2H), 1.81 (tt, J = 13.2, 6.5 Hz, 1H), 0.96 (dd, J = 18.2, 6.6 Hz, 7H)。对于(S)-2-溴-3-苯基丙酸（由L-苯丙氨酸按相同方法制备），纯品为淡黄色油状物，产率72%，[α]D20  = +17°（甲醇），1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 – 7.19 (m, 5H), 4.42 (dd, J = 8.1, 7.3 Hz, 1H), 3.47 (dd, J = 14.2, 8.2 Hz, 1H), 3.25 (dd, J = 14.2, 7.2 Hz, 1H)。

3. 利用转氨酶对丙氨酸进行同位素标记

在组合库合成中，特别是在单珠单化合物（OBOC）库的分割与混合合成中，从每颗微珠获得的化合物量相对较少（通常为1 pmol至10 nmol）。此外，由于质谱具有高灵敏度，常被用于最终化合物的鉴定与表征。为了利用质谱确定最终PTA产物中手性中心的绝对立体构型，应在使用前对溴代酸对映体进行同位素标记。本文描述了使用转氨酶和D2O对L-丙氨酸进行标记的方法。

  1. 在50 ml聚乙烯管中，将L-丙氨酸（300 mg，3.36 mmol）溶于10 ml D2O中。加入α-酮戊二酸（10 mg，0.068 mmol）作为共底物。将管子加热至37 °C，并用1 M NaOD溶液调节pD至8.5–8.7。注意：pD通过pH试纸测定。使用配备对H+选择性玻璃电极的传统电化学pH计可能对D+产生错误读数。
  2. 将丙氨酸转氨酶（0.1 mg，EC 2.6.1.2，来源于猪心，Roche Diagnostics，Indianapolis，IN）加入上一步制备的pD 8.5–8.7、37 °C的溶液中。将管子置于37 °C培养箱中，在轻微振荡条件下过夜孵育，推荐转速为10至30 rpm。
  3. 过夜孵育后，取0.5 ml D2O溶液，通过1H-NMR检测反应进程。丙氨酸的所有质子信号，δ 3.76（q，J = 7.2 Hz，1H）、1.46（d，J = 7.3 Hz，3H），1H NMR 400 MHz，应因氘代而显著减弱。如先前所述23，应有超过98%的质子被氘取代。注意：若反应在较大规模（>200 ml D2O）下进行，D2O可通过蒸馏部分回收。通常可从溶液中蒸馏回收60%至80%的D2O。
  4. 用液氮冷冻上述溶液，并使用冷冻干燥机进行冻干，得到白色氘代L-丙氨酸粉末。

4. 肽模拟物连接区的合成

连接区对于PTA文库的合成并非必需。然而，为了避免基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱在较低分子量范围（100–600）内出现高背景信号，并提高化合物的离子化效率，通常会使用含有多个极性残基的肽类模拟物（peptoid）连接子。该肽类模拟物连接子可通过标准的peptoid合成方法制备。本文中，我们将合成一个由五个N-甲氧基乙基甘氨酸残基组成的五聚体作为连接子（如图5所示）。

  1. 将90 μm Tentagel树脂珠（含RAM接头，1 g，0.27 mmol/g）用10 ml DMF溶胀3小时 在12 ml注射器反应器中轻轻振荡。
  2. 从反应器中排出DMF，加入10 ml 20%哌啶DMF溶液，以脱除Rink酰胺接头上的Fmoc保护基。用20%哌啶溶液震荡树脂珠30分钟，随后用DMF洗涤5次。 以去除所有哌啶。
  3. 从注射器中取出少量珠粒，用氯醌试验进行检测。若Fmoc成功脱保护，珠粒应变为深棕色（氯醌试验显示伯胺阳性）。
  4. 配制以下溶液：1. 20 ml 的 2 M 溴乙酸/DMF 溶液；2. 20 ml 的 2 M DIC/DMF 溶液；3. 10 ml 的 1 M 甲氧基乙胺/DMF 溶液。
  5. 向珠中加入5 ml 2 M 溴乙酸/DMF溶液，轻轻振荡。然后向珠中加入5 ml 2 M DIC/DMF溶液；用活塞密封注射器并置于摇床中，振荡10分钟。
  6. 用DMF充分洗涤树脂珠。向树脂珠中加入2 ml由步骤4.4制备的1 M甲氧基乙胺/DMF溶液。用推杆密封注射器，并在摇床中振荡反应30分钟。
  7. 用DMF洗涤珠子5次。取少量珠子进行氯醌测试，若结果为阳性（珠子变蓝），则继续下一步操作；若为阴性，则重复步骤4.6。
  8. 重复步骤 4.5 至 4.7，共 4 次 以完成五聚体的组装。

5. 使用 (R)- 和 (S)-2-溴丙酸进行PTA库的分池-合并合成

本文描述了使用步骤4.8中获得的1 g 树脂珠合成一个理论多样性为9,261种化合物的小型PTA化合物库。需要注意的是，每克90 µm的Tentagel树脂珠约含有290万个树脂珠；因此，该化合物库的冗余度为2.9 × 106 / 9,261 = 312个拷贝。我们将使用溴乙酸、(R)-2-溴丙酸以及同位素标记的(S)-2-溴丙酸-d4作为酰化试剂，并选用7种不同的胺（A1 ~ A7，详见图5）进行胺化反应。合成过程将采用注射器反应器和真空多通道装置进行。

  1. 从步骤4.8中向注射器加入10 ml 1:1二氯甲烷:二甲基甲酰胺（DCM:DMF）；使用带有截短吸头的1,000 μl移液器将全部1 g样品分装 将珠子均匀分配至三个5 ml注射器反应器中，标记为 B （溴乙酸）， R ((R)-2-溴丙酸) 和 S (S)-2-溴丙酸-d4用二氯甲烷（DCM）清洗所有3支注射器各3次；用无水四氢呋喃（THF）清洗标记为R和S的注射器各3次，用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）清洗标记为B的注射器3次。
  2. 注射器 R 和 S溴代丙酸的BTC偶联反应。
    1. 在通风橱中，向小瓶内加入约 200 mg BTC，盖上瓶盖密封。称量小瓶中 BTC 的实际质量。根据称量结果计算所需溶剂体积，并加入无水 THF，配制成 20 mg/ml 的 BTC/THF 溶液。
    2. 制备溴代酸/BTC 混合物。加入 (R)-2-溴丙酸（89 μl，0.95 mmol）和 (S)-2-溴丙酸-d4 （89 μl，0.95 mmol）分别加入两个小瓶中。向每个小瓶中加入5 ml上述20 mg/ml BTC/THF溶液。密封两个小瓶，置于-20 °C冰箱中反应20分钟。
    3. 向注射器中加入 1,125 μl 2:1 THF/DIPEA（750 μl THF，375 μl DIPEA，2.2 mmol） R 和 S 分别进行。用移液枪头将磁珠混匀，静置5分钟。
    4. 从步骤5.2.2中取出两个已冷却的溴代酸/BTC混合物，向每个小瓶中加入2,4,6-三甲基吡啶（356 μl，2.7 mmol）。立即有白色沉淀生成。将相应的悬浮液直接加入至碱化的珠子中（注射器 R 和 S 在步骤5.2.3中尽快操作，随后将样品置于摇床中，以120 rpm振荡2小时。
      注意：反应全程中，注射器反应器内的溶液应呈淡黄色悬浮液。若颜色变深，表明在初始加入酰氯溶液时释放了过多热量。可通过进一步冷却或稀释溴代酸/BTC混合物来解决此问题。
  3. 注射器 B溴乙酸与DIC的偶联
    1. 配制20 ml新鲜的2 M溴乙酸/DMF溶液。配制20 ml的2 M DIC/DMF溶液。
    2. 加入2 向注射器中加入2 M溴乙酸/DMF溶液1 ml B，轻轻振荡。加入2 向注射器中加入2 M DIC/DMF溶液1毫升 B，轻轻振荡。
    3. 将注射器放入 B 与注射器置于同一摇床中 R 和 S，振荡反应2小时。注意，溴乙酸/DIC的偶联反应在30分钟内即可完成；延长反应时间是为了方便进行裂分-混合合成。
  4. 2小时后，取注射器 R，S 和 B 从摇床中取出。用二氯甲烷彻底清洗所有三个注射器 5次。然后用DMF洗涤5次。注意注射器 R 和 S 在使用DMF清洗之前，必须先用DCM或THF清洗。
  5. 合并所有注射器中的珠子 R, S 和 B 将所有珠子转入一个12 ml注射器反应器中，用DMF洗涤5次。
  6. 向注射器中加入10 ml 1:1 DCM:DMF；使用带截短吸头的1,000 μl移液器将所有微珠均匀分配至7个独立的2 ml注射器中，标记为A1-A7。
  7. 胺化反应。为所列的7种伯胺中的每一种分别配制10 ml、2 M的伯胺/DMF溶液。 图5向相应的注射器 A1-A7 中各加入 5 ml 胺溶液。将全部 7 个注射器置于 60 °C 摇床培养箱中孵育过夜。
  8. 孵育后，用DMF彻底洗涤所有珠子。  从每个注射器中取出少量珠粒，用氯醌试验检测。若珠粒在3分钟内变为绿色（结果为阳性），则进行下一步。若结果为阴性，则对结果为阴性的注射器重复步骤5.7。
  9. 重复步骤 5.1 至 5.8 两次，以完成三聚体的合成。可选步骤：每个循环结束后，建议按如下所述通过质谱检测合成质量。目前所有 9,261 种化合物均已合成在 Tentagel 树脂上，构成 OBOC 组合库。
  10. PTA 的质谱确认
    PTA 是具有高度结构化的寡聚物，具备许多 N-甲基化肽的共同特征。N-甲基化肽的固相合成中一个常见问题是三氟乙酸（TFA）裂解过程中发生的酸降解。为抑制酸降解，类似环孢素等分子从固相载体上的裂解通常在低温条件下进行。我们比较了多种裂解条件对不同 PTA 分子从固相载体上裂解的效果。结果表明，通常情况下，低温和降低 TFA 浓度可有效抑制酸降解，获得纯度更高的化合物。
    1. 在15 ml离心管中配制10 ml 1:1 TFA/DCM溶液。密封管子并置于-20 °C冰箱中冷冻20分钟。
    2. 用二氯甲烷洗涤需裂解的珠子5次。将珠子在二氯甲烷中振荡15分钟，再用二氯甲烷洗涤5次。
    3. 将二氯甲烷从注射器中排出。使用光学显微镜和带有截短尖端的移液器，将每个微珠单独转移至96孔板中，每孔一个微珠。
    4. 用盖玻片覆盖96孔板，将板置于-20 °C冰箱中冷冻15分钟。
    5. 从步骤5.10.1中取出已冷却的1:1 TFA/DCM溶液，向每个含有微珠的孔中加入20 μl。重新盖上盖玻片，将96孔板置于-20 °C冰箱中的摇床上。
    6. 振荡20分钟。取出96孔板，揭去盖玻片。通过吹入空气或氩气将每个孔中的TFA/DCM吹干。若裂解的微珠超过10个，可使用真空离心浓缩仪（speedvac）对整块板进行干燥以去除TFA/DCM。需注意，此时并非所有化合物均已从微珠上完全裂解，但已裂解的化合物量应足以进行质谱分析。
    7. 加入 20 μl 6:4 乙腈:水2O溶液以溶解各孔中的裂解产物。取每种化合物溶液0.6 μl，与0.6 μl CHCA MALDI基质混合后点样于MALDI靶板上。
    8. 使用基质辅助激光解吸电离质谱法（MALDI质谱）测定各化合物的分子量及其序列（MS/MS）。

6. 氯醌试验

  1. 每次测试前需新鲜配制以下试剂。溶液A：2% 氯醌（CAS: 118-75-2）的DMF溶液。溶液B：2% 乙醛（CAS: 75-07-0）的DMF溶液。
  2. 在1.5 ml离心管中，将100 μl溶液A与100 μl溶液B混合；加入微珠后轻轻振荡。若微珠在5分钟内变为蓝色，表明微珠表面含有仲胺。伯胺则呈现深棕色，不会变蓝。

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结果

此处展示了带有连接臂的PTA三聚体的三个代表性MALDI质谱图。如图6A所示，当使用50% TFA/DCM溶液在室温下进行裂解时，观察到明显的降解现象。图6A中，质荷比为593和484的峰分别对应于连接臂和PTA三聚体，表明整个分子已在树脂上成功合成，但在裂解过程中发生了降解。如上所述，在低温条件下进行裂解时，TFA引起的降解显著减少，如图6B所示。此类裂解的机理已在先前的文献中有所描述24，被认为经过一个噁唑烷中间体。PTA分子可通过MS/MS进行测序，其裂解模式与肽和拟肽相似，如图6C所示。使用(S)-2-溴丙酸-d4合成的PTA分子在MS和MS/MS谱图中通常产生更宽的峰，这是由于存在氘代不完全的副产物，例如(S)-2-溴丙酸-d3（图7A和图7B）。这一现象可在测序过程中作为R手性中心存在（由S构型在胺化过程中发生构型翻转所致）的指示。我们还发现，PTA分子比拟肽...

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讨论

肽类叔酰胺（PTA）是一类肽模拟寡聚物的超家族。除了已被广泛研究的肽、肽拟物（peptoids）和N-甲基化肽之外，该家族中大量化合物仍缺乏深入研究，主要原因是缺乏适用于通用N-烷基化肽的合成方法。本文中，我们描述了一种利用源自氨基酸的手性构筑单元高效合成PTA的方法。此前，我们已报道过采用一种新的亚单体路线合成PTA分子库。23我们已证明，PTA 是具有高度结构的寡聚物，其骨架具有构象限制。在测试时 体内PTA分子表现出增强的细胞通透性，因而活性提高25然而，尽管PTA具有诸多优势，其合成过程也面临一些挑战，主要源于位阻位置上仲胺的酰化反应。提供构象限制的α-侧链也会对后续的偶联步骤产生空间位阻。为了克服这些合成难题，我们开展了系统的优化研究，确定BTC为该反应的最佳偶联试剂。23.

合成路线的关键步骤是由BTC促进的仲胺酰化反应。在此过程中，BTC能够促进酰氯的生成。 原位26,27大多数其他偶联试剂在连续合成PTA时，因形成活性酯或酸酐等中间体，无法实现...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨此感谢 Jumpei Morimoto 博士和 Todd Doran 博士提供的宝贵帮助。本研究工作获得了美国国家心肺血液研究所（NHLBI）合同（NO1-HV-00242）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2,4,6-三甲基吡啶ACROS161950010CAS:108-75-8
2-吗啉乙胺Sigma-Aldrich06680CAS:2038-03-1  
48% HBr 水溶液ALFA AESARAA14036ATCAS:10035-10-6
乙醛Sigma-Aldrich402788CAS:75-07-0  
乙腈FisherSR015AA-19PSCAS:75-05-8
无水四氢呋喃（THF）EMDEM-TX0277-6CAS:109-99-9
苄胺Sigma-Aldrich185701CAS:100-46-9
双(三氯甲基)碳酸酯（BTC）ACROS258950050CAS:32315-10-9
溴乙酸ACROS106570010CAS:79-08-3
四氯苯醌Sigma-Aldrich23290CAS:118-75-2
环己基甲胺Sigma-Aldrich101842CAS:3218-02-8
D2O剑桥同位素DLM-4-99.8-1000CAS:7789-20-0
D-丙氨酸Anaspec61387-100CAS:338-69-2
二氯甲烷（DCM）FisherBJ-NS300-20CAS:75-09-2
二甲基甲酰胺（DMF）FisherBJ-076-4CAS:68-12-2
乙二醇奥克伍德44710CAS:107-21-1
异戊胺Sigma-AldrichW321907CAS:107-85-7
KBrACROS424070025CAS:7758-02-3
L-丙氨酸Anaspec61385-100CAS:56-41-7
3-甲氧基丙胺Sigma-AldrichM25007CAS:5332-73-0
2-甲氧基乙胺Sigma-Aldrich143693CAS:109-85-3
N-(3-氨基丙基)-2-吡咯烷酮Sigma-Aldrich136565CAS:7663-77-6 
N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）ACROS115211000CAS:693-13-0
N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）Sigma-AldrichD125806CAS:7087-68-5
NaNO2ACROS424340010CAS:7631-99-4
NAOD 水溶液（40%）ACROS200058-506CAS:7732-18-5
哌啶ALFA AESARA12442-AECAS:110-89-4
胡椒基胺Sigma-AldrichP49503CAS:2620-50-0
丙胺Sigma-Aldrich240958CAS:107-10-8
三氟乙酸Sigma-Aldrich299537CAS:76-05-1
α-氰基-4-羟基肉桂酸Sigma-Aldrich39468CAS:28166-41-8  
αα-酮戊二酸ALFA AESARAAA10256-22CAS:328-50-7
RINK连接臂的Tentagel树脂Rapp-聚合物S30023
丙氨酸转氨酶罗氏10105589001又称：谷氨酸-丙酮酸转氨酶（GPT）
培养箱新不伦瑞克科学公司Innova44
核磁共振（NMR）Bruker400 MHz
MALDI 质谱仪应用生物系统公司4800 MALDI-TOF/TOF
冻干机SP ScientificVirTis 台式 K
注射器反应器INTAVIS反应柱3 ml、5 ml、10 ml、20 ml
真空 manifoldPromegaA7231Vac-Man

参考文献

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