裂分与混合合成及肽类叔酰胺库的表征

摘要

肽类叔酰胺（PTAs）是一类包含但不限于肽、肽拟物和N-甲基化肽的肽模拟物超家族。本文描述了一种结合了 结合裂分-混合与单体前体策略，合成单珠单化合物的PTA库。

摘要

拟肽类化合物是蛋白质配体的重要来源。由于这类化合物具有寡聚特性，我们可以通过组合化学方法在固相上构建大规模的合成文库。其中研究最为广泛的一类拟肽化合物是肽类似物（peptoids）。肽类似物易于合成，且已被证明具有抗蛋白酶降解和细胞通透性等优点。在过去十年中，通过筛选肽类似物文库已鉴定出许多有用的蛋白质配体。然而，从肽类似物文库中鉴定出的大多数配体亲和力较低，仅有极少数例外。这可能部分归因于肽类似物分子中缺乏手性中心和构象限制。最近，我们报道了一种新的合成途径，可用于获得肽类叔酰胺（PTAs）。PTA是一类包含但不限于肽、肽类似物和N-甲基化肽的拟肽超家族。由于其侧链同时存在于α-碳原子和主链氮原子上，这些分子的构象受到空间位阻和烯丙基1,3-张力的显著限制。（图1）我们的研究表明，这些PTA分子在溶液中具有高度有序的结构，可用于识别蛋白质配体。我们认为，这类分子有望成为未来高亲和力蛋白质配体的来源。本文中，我们描述了一种结合了“分割-混合”（split-and-pool）与“亚单体”（sub-monomer）策略的合成方法，用于构建一个单珠单化合物（OBOC）PTA文库的示例。

引言

拟肽类化合物是一类模拟天然肽结构的化合物。其设计旨在保留生物活性的同时，克服天然肽存在的一些问题，如细胞通透性差以及易被蛋白酶降解等^1-3。由于这类化合物具有寡聚特性，可通过单体或亚单体合成路线方便地构建大规模合成文库^4-7。其中研究最为广泛的一类拟肽化合物是 肽素（peptoids）。肽素是由N-烷基化甘氨酸组成的寡聚物，可通过亚单体策略简便地合成^8,9。通过针对蛋白质靶标筛选大规模合成的肽素文库，已成功鉴定出多种有用的蛋白质配体^1,10-14。然而，从肽素文库中鉴定出的“命中”化合物通常难以达到对蛋白质靶标的极高亲和力^1,10-14,22。肽素与天然肽之间的一个主要差异在于，大多数肽素由于缺乏手性中心和构象限制，通常无法形成二级结构。为解决这一问题，过去十年中已发展出多种策略，主要集中于修饰主链氮原子上的侧链^15-22。最近，我们开发了一种新的合成路线，可将天然氨基酸侧链引入肽素骨架，从而构建肽类叔酰胺结构²³。

肽类叔酰胺（PTA）是一类包含但不限于肽（R₂ = H）、肽拟物（peptoids，R₁ = H）和N-甲基化肽（R₁ 

方案

1. 分裂-混合合成的基本原理

为了高效地在固相上生成大量化合物，通常采用分割-混合合成法作为通用策略。如图所示 图4， Tentagel 树脂珠首先 分为三份，每份与不同的试剂反应，在树脂珠上生成第一个残基。第一次反应后，将三份混合并重新合并，再分成三份。每份再次与不同的试剂反应，在树脂珠上生成第二个残基。经过两次分池合并操作后，共生成九种化合物。

在亚单体合成中，首先将树脂珠分为若干份，分别在偶联试剂存在下与不同的溴代酸反应。用溶剂洗涤后，将所有树脂珠合并并混匀，再重新分为若干份，分别与不同的伯胺反应。胺化反应完成后，将所有树脂珠重新合并，并充分洗涤，从而在每颗树脂珠上完成一个完整的单体合成。此过程可重复进行，直至达到所需的多样性。

2. 从天然氨基酸制备酰溴

在亚单体合成中，每个单体的合成分为两个独立步骤：1. 酰溴的偶联；2. 与伯胺的胺化反应（图2）。为了合成肽类叔酰胺，将从天然氨基酸出发制备在α碳上带有侧链的手性酰溴。本文描述了将天然氨基酸高立体保真地转化为相应酰溴的方法。我们以丙氨酸为例进行说明；在类似条件下，丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等其他氨基酸也可转化为溴代酸。需....

结果

我们展示了带有连接臂的PTA三聚体的三个代表性MALDI质谱图。如图6A所示，当使用50% TFA/DCM溶液在室温下进行裂解时，观察到明显的降解现象。图6A中，峰593和峰484分别对应于连接臂和PTA三聚体，表明整个分子已在树脂上成功合成，但在裂解过程中发生了降解。如上所述，在低温条件下进行裂解时，TFA诱导的降解显著减少，如图6B所示。该裂解机制已在先前文献中有所描述²⁴，被认为经过一个噁唑啉中间体。PTA分子可通过MS/MS进行测序，其裂解模式与肽和拟肽相似，如图6C所示。使用(S)-2-溴丙酸-d₄合成的PTA分子在MS和MS/MS谱图中通常产生更宽的峰，这是由于存在不完全氘代产物，例如(S)-2-溴丙酸-d₃（图7A和7B）。这一现象可作为测序过程中存在R手性中心（由胺化反应中S构型翻转而来）的指示。我们还发现，PTA分子比拟肽/肽更容易形成钠加合物，因此建议.......

讨论

肽类叔酰胺（PTA）是一类肽模拟寡聚物的超家族。除了已被广泛研究的肽、肽拟物（peptoids）和N-甲基化肽之外，该家族中大量化合物仍缺乏深入研究，主要原因是缺乏适用于通用N-烷基化肽的合成方法。本文中，我们描述了一种利用源自氨基酸的手性构筑单元高效合成PTA的方法。此前，我们已报道过采用一种新的亚单体路线合成PTA分子库。²³我们已证明，PTA 是具有高度结构的寡聚物，其骨架具有构象限制。在测试时 体内PTA分子表现出增强的细胞通透性，因而活性提高²⁵然而，尽管PTA具有诸多优势，其合成过程也面临一些挑战，主要源于位阻位置上仲胺的酰化反应。提供构象限制的α-侧链也会对后续的偶联步骤产生空间位阻。为了克服这些合成难题，我们开展了系统的优化研究，确定BTC为该反应的最佳偶联试剂。²³.

合成路线的关键步骤是由BTC促进的仲胺酰化反应。在此过程中，BTC能够促进酰氯的生成。 原位^26,27大多数其他偶联试剂在连续合成PTA时，因形成活性酯或酸酐等中间体，无法实现.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,4,6-三甲基吡啶	ACROS	161950010	CAS:108-75-8
2-吗啉乙胺	Sigma-Aldrich	06680	CAS:2038-03-1
48% HBr 水溶液	ALFA AESAR	AA14036AT	CAS:10035-10-6
乙醛	Sigma-Aldrich	402788	CAS:75-07-0
乙腈	Fisher	SR015AA-19PS	CAS:75-05-8
无水四氢呋喃（THF）	EMD	EM-TX0277-6	CAS:109-99-9
苄胺	Sigma-Aldrich	185701	CAS:100-46-9
双(三氯甲基)碳酸酯（BTC）	ACROS	258950050	CAS:32315-10-9
溴乙酸	ACROS	106570010	CAS:79-08-3
四氯苯醌	Sigma-Aldrich	23290	CAS:118-75-2
环己基甲胺	Sigma-Aldrich	101842	CAS:3218-02-8
D2O	剑桥同位素	DLM-4-99.8-1000	CAS:7789-20-0
D-丙氨酸	Anaspec	61387-100	CAS:338-69-2
二氯甲烷（DCM）	Fisher	BJ-NS300-20	CAS:75-09-2
二甲基甲酰胺（DMF）	Fisher	BJ-076-4	CAS:68-12-2
乙二醇	奥克伍德	44710	CAS:107-21-1
异戊胺	Sigma-Aldrich	W321907	CAS:107-85-7
KBr	ACROS	424070025	CAS:7758-02-3
L-丙氨酸	Anaspec	61385-100	CAS:56-41-7
3-甲氧基丙胺	Sigma-Aldrich	M25007	CAS:5332-73-0
2-甲氧基乙胺	Sigma-Aldrich	143693	CAS:109-85-3
N-(3-氨基丙基)-2-吡咯烷酮	Sigma-Aldrich	136565	CAS:7663-77-6
N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）	ACROS	115211000	CAS:693-13-0
N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）	Sigma-Aldrich	D125806	CAS:7087-68-5
NaNO2	ACROS	424340010	CAS:7631-99-4
NAOD 水溶液（40%）	ACROS	200058-506	CAS:7732-18-5
哌啶	ALFA AESAR	A12442-AE	CAS:110-89-4
胡椒基胺	Sigma-Aldrich	P49503	CAS:2620-50-0
丙胺	Sigma-Aldrich	240958	CAS:107-10-8
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	299537	CAS:76-05-1
α-氰基-4-羟基肉桂酸	Sigma-Aldrich	39468	CAS:28166-41-8
αα-酮戊二酸	ALFA AESAR	AAA10256-22	CAS:328-50-7
RINK连接臂的Tentagel树脂	Rapp-聚合物	S30023
丙氨酸转氨酶	罗氏	10105589001	又称：谷氨酸-丙酮酸转氨酶（GPT）
培养箱	新不伦瑞克科学公司	Innova44
核磁共振（NMR）	Bruker	400 MHz
MALDI 质谱仪	应用生物系统公司	4800 MALDI-TOF/TOF
冻干机	SP Scientific	VirTis 台式 K
注射器反应器	INTAVIS	反应柱	3 ml、5 ml、10 ml、20 ml
真空 manifold	Promega	A7231	Vac-Man