评估 Mdx 小鼠模型中的功能表现

摘要

神经肌肉疾病临床试验的主要结局指标通常是改善肌肉功能。因此，在小鼠模型中对潜在治疗化合物对肌肉功能的影响进行临床前评估具有重要意义。本文将介绍几种用于实现这一目的的功能性检测方法。

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种严重且进行性的肌肉萎缩疾病，目前尚无治愈方法。然而，已有多种潜在的药物化合物和基因治疗策略进入临床试验阶段。由于肌肉功能的改善是这些试验中最重要的终点指标，因此人们高度重视建立可靠、可重复且易于操作的功能性检测方法，以在临床前阶段评估DMD的mdx小鼠模型中的肌肉功能、力量、状态和协调性。现有检测方法包括侵入性和非侵入性两类。不会加重疾病进展的检测可用于确定疾病的自然病程以及治疗干预的效果（例如：前肢抓力测试、使用金属丝或网格的两种不同悬吊测试，以及转棒实验）。此外，强制跑步机跑步可用于加速疾病进展和/或评估治疗干预对疾病病理的保护作用。本文详细描述了如何以可靠且可重复的方式执行这些最常用的功能性测试。基于标准操作程序的这些方案可实现不同实验室之间的数据比较。

引言

杜氏肌营养不良症（DMD）是最常见的神经肌肉疾病，每5000名新生男婴中就有1人患病。这种严重且进行性的肌肉萎缩疾病由DMD基因突变引起，这些突变会破坏开放阅读框，阻止功能性抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的合成。缺乏抗肌萎缩蛋白的肌纤维易受运动诱发的损伤。当肌肉的再生能力耗尽，并由于受损肌肉的慢性炎症，肌纤维逐渐被结缔组织和脂肪取代，最终导致功能丧失。通常，DMD患者在第二个十年早期即丧失下肢行走能力。随后，上肢和肩带肌肉也受到影响，患者常因支撑脊髓的肌肉不对称性减弱而出现胸腰段脊柱侧弯。一般在青少年晚期或二十岁出头时需要辅助通气。呼吸衰竭和心力衰竭导致患者在三十至四十岁之间死亡¹。

尽管致病基因在25年多前已被发现²，但目前仍无治愈杜氏肌营养不良症（DMD）的方法。然而，医疗护理的改善以及皮质类固醇的应用已延长了西方国家患者的预期寿命³。通过使用如mdx小鼠等动物模型，研究人员在发现潜在治疗策略方面取得了重大进展。mdx小鼠是最常用的DMD小鼠模型，其小鼠Dmd基因的第23号外显子存在点突变，因而无法表达抗肌萎缩蛋白（dystrophin）⁴。在最近几年中，许多提出的治疗策略已进入临床试验阶段^5-9。在这些临床试验中，肌肉功能的改善是主要终点指标，这凸显了在临床前阶段通过小鼠模型评估化合物....

方案

本研究所描述的实验已获莱顿大学医学中心（LUMC）动物伦理委员会（DEC）批准。小鼠由LUMC动物饲养设施繁育，并饲养于独立通风笼具中，光照周期为12小时明/12小时暗。小鼠可自由获取 随意摄取 可自由获取水和标准饲料。

在进行下述任何功能测试时，必须严格控制实验条件以减少变异。建议使用年龄和性别相匹配的小鼠，因为不同年龄和性别的小鼠在表现上存在差异。同窝出生的小鼠应随机分配至各实验组。实验应由同一名操作者完成，且该操作者需对实验分组情况设盲。测试应在每天相同的时间和相同的星期几、在同一个房间内进行，以保持气味、噪音等环境因素的一致性 等¹⁴ 。所有功能测试在不同个体小鼠及不同时间点之间均可能表现出较大变异，因此每个实验组应使用6–8只小鼠。不同近交系野生型品系之间的功能测试表现也可能存在显著差异。因此，实验组和对照组的野生型小鼠应具有相应的遗传背景（例如，在使用mdx小鼠时，应采用C57BL/10ScSnJ野生型品系）。本文所述所有数据均来自C57BL/10ScSnJ野生型品系，后文将此品系简称为野生型。此处描述的测试可在mdx小鼠和野生型小鼠中从至少1个月龄持续纵向应用至19个月龄。为避免小鼠失去兴趣或执行任务的意愿，测试频率不应超过每周一次。

1. 前肢抓握力测试

结果

野生型和mdx小鼠的前肢握力在4至12周龄之间逐渐增强，而在更年老的小鼠中则再次下降。mdx小鼠在幼年时期即可观察到力量的受损。图1A和1B展示了9周龄雌性小鼠的代表性数据。尽管在此年龄段，两种小鼠品系之间的疲劳程度尚无差异，但mdx小鼠比野生型小鼠更弱。目前我们尚无关于年老mdx小鼠和野生型小鼠疲劳性的数据。

为了获得可靠且可重复的结果，应由同一名实验人员进行多次评估。本文所述方法为每只动物进行15次拉力测试，但较少次数的测试（低至5次）也能提供可靠的数据。需特别注意动物足爪在网格上的位置，因为这会显著影响实验结果。在进行拉力测试时，应仅使用两只前肢，且两前肢需并排紧靠放置（图1C）。若小鼠在拉力过程中未表现出抵抗，该次测量值不应被计入。

在双肢和四肢悬挂实验中，尤其是年轻的（4-16周龄）野生型小鼠，通常能够轻松达到600秒的最大悬挂时间。相比之下，年.......

讨论

该 此处介绍的功能性测试具有可重复性，操作简便，适用于不同年龄的野生型和肌营养不良型小鼠。这些测试为临床前评估肌肉功能、力量、状态及协调性提供了有用的工具。在检测化合物对疾病自然进程的影响时，可将此处描述的非侵入性测试（前肢握力测试、两种悬吊测试以及转棒测试）有机结合，形成一个功能测试方案，并在连续数天内依次完成各项测试。这些方案不会对动物造成伤害 mdx 小鼠，且可用于纵向研究¹⁰需要注意的是，这些测试中的每一项结果均由不同或部分重叠的肌群产生，而非单一肌肉。因此，建议结合多项测试以获得更全面的信息，从而更深入地了解实验组的功能状况。 Alternatively, functional improvements of a sole muscle can be assessed using muscle physiology measurements²⁰.

与行为学测试类似，功能测试在不同小鼠之间，或同一只小鼠在不同次测试之间也可能表现出显著差异。为减少变异，所有测试应由同一名熟悉这些小鼠的实验人员完成。实验环.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠握力计	Chatillon DFE（由Columbus Instruments再销售）	# 80529
双肢悬挂金属丝装置	衣架或自制装置
四肢悬挂金属丝装置	大鼠笼盖或自制装置
转棒仪	Ugo Basil	# 47600
小鼠跑步机 Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM