评估 Mdx 小鼠模型中的功能表现

摘要

神经肌肉疾病临床试验的主要结局指标通常是改善肌肉功能。因此，在小鼠模型中对潜在治疗化合物对肌肉功能的影响进行临床前评估具有重要意义。本文将介绍几种用于实现这一目的的功能性检测方法。

摘要

杜氏肌营养不良症（DMD）是一种严重且进行性的肌肉萎缩疾病，目前尚无治愈方法。然而，已有多种潜在的药物化合物和基因治疗策略进入临床试验阶段。由于肌肉功能的改善是这些试验中最重要的终点指标，因此人们高度重视建立可靠、可重复且易于操作的功能性检测方法，以在临床前阶段评估DMD的mdx小鼠模型中的肌肉功能、力量、状态和协调性。现有检测方法包括侵入性和非侵入性两类。不会加重疾病进展的检测可用于确定疾病的自然病程以及治疗干预的效果（例如：前肢抓力测试、使用金属丝或网格的两种不同悬吊测试，以及转棒实验）。此外，强制跑步机跑步可用于加速疾病进展和/或评估治疗干预对疾病病理的保护作用。本文详细描述了如何以可靠且可重复的方式执行这些最常用的功能性测试。基于标准操作程序的这些方案可实现不同实验室之间的数据比较。

引言

杜氏肌营养不良症（DMD）是最常见的神经肌肉疾病，每5000名新生男婴中就有1人患病。这种严重且进行性的肌肉萎缩疾病由DMD基因突变引起，这些突变会破坏开放阅读框，阻止功能性抗肌萎缩蛋白（dystrophin）的合成。缺乏抗肌萎缩蛋白的肌纤维易受运动诱发的损伤。当肌肉的再生能力耗尽，并由于受损肌肉的慢性炎症，肌纤维逐渐被结缔组织和脂肪取代，最终导致功能丧失。通常，DMD患者在第二个十年早期即丧失下肢行走能力。随后，上肢和肩带肌肉也受到影响，患者常因支撑脊髓的肌肉不对称性减弱而出现胸腰段脊柱侧弯。一般在青少年晚期或二十岁出头时需要辅助通气。呼吸衰竭和心力衰竭导致患者在三十至四十岁之间死亡¹。

尽管致病基因在25年多前已被发现²，但目前仍无治愈杜氏肌营养不良症（DMD）的方法。然而，医疗护理的改善以及皮质类固醇的应用已延长了西方国家患者的预期寿命³。通过使用如mdx小鼠等动物模型，研究人员在发现潜在治疗策略方面取得了重大进展。mdx小鼠是最常用的DMD小鼠模型，其小鼠Dmd基因的第23号外显子存在点突变，因而无法表达抗肌萎缩蛋白（dystrophin）⁴。在最近几年中，许多提出的治疗策略已进入临床试验阶段^5-9。在这些临床试验中，肌肉功能的改善是主要终点指标，这凸显了在临床前阶段通过小鼠模型评估化合物对肌肉功能影响的重要性。

与杜氏肌营养不良症（DMD）患者类似，mdx 小鼠的肌营养不良蛋白阴性肌纤维也容易受到运动诱导的损伤，其肌肉功能与 C57BL/10ScSnJ 野生型小鼠相比存在损害。这种功能损害可通过多种功能学检测方法进行评估。其中部分检测方法为非侵入性，且不会干扰肌肉病理过程（例如 前肢握力测试、悬挂测试和转棒实验）。因此，这些方法可用于监测疾病的自然发展过程，或确定化合物对疾病进展的影响。为了全面评估化合物对 mdx 小鼠肌肉功能的影响，可采用包含上述所有检测项目的非干扰性功能学测试方案¹⁰。

此外，强制跑步机跑步可用于有意加剧疾病进展，并测试化合物的保护作用¹¹。跑步机也可作为结局指标，用于测量直至力竭的跑步时间¹²，或作为一种使mdx小鼠产生疲劳的工具，使其在随后的功能测试中表现更差，从而确保不同处理组之间的性能差异更加显著¹³。在选择功能测试方法时，应特别考虑其对疾病进展的影响，尤其是在测试如mdx小鼠等肌营养不良小鼠时¹⁴。

本文详细描述了如何根据TREAT-NMD网络提供的标准操作程序，以可靠且可重复的方式执行最常用的各类功能检测。点击此处访问 TREAT-NMD。

方案

本研究所描述的实验已获莱顿大学医学中心（LUMC）动物伦理委员会（DEC）批准。小鼠由LUMC动物饲养设施繁育，并饲养于独立通风笼具中，光照周期为12小时明/12小时暗。小鼠可自由获取 随意摄取 可自由获取水和标准饲料。

在进行下述任何功能测试时，必须严格控制实验条件以减少变异。建议使用年龄和性别相匹配的小鼠，因为不同年龄和性别的小鼠在表现上存在差异。同窝出生的小鼠应随机分配至各实验组。实验应由同一名操作者完成，且该操作者需对实验分组情况设盲。测试应在每天相同的时间和相同的星期几、在同一个房间内进行，以保持气味、噪音等环境因素的一致性 等¹⁴ 。所有功能测试在不同个体小鼠及不同时间点之间均可能表现出较大变异，因此每个实验组应使用6–8只小鼠。不同近交系野生型品系之间的功能测试表现也可能存在显著差异。因此，实验组和对照组的野生型小鼠应具有相应的遗传背景（例如，在使用mdx小鼠时，应采用C57BL/10ScSnJ野生型品系）。本文所述所有数据均来自C57BL/10ScSnJ野生型品系，后文将此品系简称为野生型。此处描述的测试可在mdx小鼠和野生型小鼠中从至少1个月龄持续纵向应用至19个月龄。为避免小鼠失去兴趣或执行任务的意愿，测试频率不应超过每周一次。

1. 前肢抓握力测试

使用前肢抓握力测试来测量前肢的力量。该测试基于小鼠被尾部悬吊时本能抓住网格的趋势¹⁵，并改编自 DMD_M2.2.001.pdf。

1. 仪器设置：将网格连接至力传感器，用于测量小鼠在拉拽过程中施加于网格上的最大拉力。确保设备设置为拉力峰值模式（T-PK）。力的单位可选择盎司力、克力、磅力、千克力或牛顿。
   注意：我们倾向于使用克力作为单位。市面上有多种测量仪可供选择，但只有轴向传感器能提供可靠结果，因为杠杆式力传感器会受到杠杆效应物理定律的负面影响。可使用刚性网格或三角形装置，其横杆直径为1–2 mm。
2. 测试前，测量小鼠的体重，以便进行体重归一化处理。
3. 使用克力作为单位。每次记录开始前重置测量仪。
4. 抓住小鼠尾巴，将其从笼中取出，并水平移向网格。
5. 确认小鼠用两只前爪牢固抓住网格。
6. 将小鼠从网格方向向外拉，直至其抓握松脱；此时传感器显示屏上将显示施加于网格的最大拉力，该数值可手动或自动记录。
7. 仅记录小鼠对实验操作者表现出明显抵抗的拉拽动作。若仅使用单侧前爪或后肢，或在拉拽过程中发生转身的情况，应舍弃相应数据。
8. 让小鼠连续进行三次拉拽后，将其放回笼中，休息至少一分钟。注意：每组拉拽之间需安排休息时间，以使小鼠恢复体力并避免习惯性行为形成。
9. 随后让小鼠完成四组拉拽，每组之间均安排短暂休息。如此，小鼠总共完成15次拉拽（3次/组 × 5组 = 15次）。
10. 确定最大握力，并通过取15次测量值中最高的三个数值的平均值进行体重归一化处理。
11. 可选：通过计算前两组与后两组拉拽平均值之间的下降程度来评估疲劳程度。计算方式如下：1+2+3=A，4+5+6=B，10+11+12=C，13+14+15=D。公式：(C+D)/(A+B) 的结果为1时，表示小鼠无疲劳。该值可转换为百分比形式，即无疲劳小鼠为0%，前肢完全疲劳的小鼠为100%。

2. 悬挂实验

通过悬挂实验，可以评估小鼠的平衡能力、协调性及肌肉状态。该实验基于小鼠倾向于持续悬挂在金属丝或网格上直至力竭的特性¹⁶。两种不同的悬挂实验分别在起始阶段仅使用前肢或四肢，对应使用金属丝或网格。使用金属丝和网格的悬挂实验分别为改编自DMD_M.2.1.004.pdf 和 DMD_M.2.1.005.pdf 的最长悬停时间方法。实验设定固定的悬挂时限为600秒。大多数野生型小鼠可悬挂达600秒，而肌营养不良型小鼠则不能。为减少实验耗时，设定了最大悬挂时间。若小鼠在此之前从金属丝或网格上掉落，可再给予最多两次重试机会，以确保其确实无法悬挂，而非因笨拙导致坠落。

1. 双前肢悬挂测试
   1. 装置设置：用胶带将一根厚度为 2 mm 的金属衣架牢固地固定在架子上，并使其距离垫料层约 37 cm。 注意： 也可使用一根宽 55 cm、厚 2 mm 的金属丝，将其牢固地固定在两个垂直支架之间。37 cm 的高度足以促使小鼠持续悬挂，同时又足够低，以防止小鼠跌落时受伤。测试过程中金属丝不应发生振动或位移，以免干扰小鼠的表现。
   2. 通过尾巴抓握小鼠，并将其移至金属丝附近。
   3. 让小鼠仅用两只前爪抓住金属丝，并将后肢向下放低，使小鼠仅以双前爪悬挂在金属丝上（图 2B）。
   4. 释放小鼠后立即启动计时器。释放后，强壮的小鼠会尝试用四肢及尾巴抓住金属丝，这是允许的（图 2C）。
   5. 当小鼠表现出不恰当行为时（如在金属丝上保持平衡或故意跳下，如 图 2D 和 图 2E 所示），应立即纠正，将小鼠重新放回金属丝上，且不暂停计时。
   6. 当小鼠从金属丝上掉落时，停止计时并记录悬挂时间。
   7. 若小鼠能够悬挂达 600 秒，将其从金属丝上取下并放回笼中。对于在此时限前掉落的小鼠，最多可再给予两次尝试机会。
   8. 记录最大悬挂时间（即 所有尝试中最长的一次），并用于后续分析。
2. 四肢悬挂测试
   1. 装置设置：可使用自制的方格网或大鼠或兔笼的顶盖进行本测试。将网格置于软垫料上方 25 cm 处，以防止小鼠跌落时受伤，同时避免小鼠故意跳离网格。应将网格牢固固定，使实验者在实验过程中无需手动扶持，以免人为移动干扰小鼠表现。
   2. 将小鼠放置在网格上，使其用四肢抓住网格。
   3. 将网格翻转，使小鼠呈悬挂状态，并立即启动计时器。
   4. 对于能够悬挂达 600 秒的小鼠，测试结束。对于提前掉落的小鼠，最多可再给予两次尝试机会。
   5. 使用最大悬挂时间（即 所有尝试中最长的一次）用于后续分析。

3. 转棒实验

通过转棒实验可以测定肌肉力量、协调性、平衡能力及身体状况¹⁷。

1. 仪器设置：在该实验中，小鼠需在一根旋转的滚筒上奔跑。确保初始恒定速度设定为每分钟5转（rpm），并在前15秒内速度从5 rpm匀速增加至45 rpm。 启动后，必须保持其转速。
2. 将小鼠放置在以5 rpm的缓慢恒定速度旋转的转棒仪滚筒上。可同时测试5只小鼠。
3. 所有小鼠放置到位后开始运行。在前15秒内 试管的转速从5-45 rpm逐渐加快，之后保持该速度不变。
4. 监测运行过程。软件会持续记录运行时间。当小鼠从转棒上掉落时，位于转棒下方的时间记录条被激活，运行时间将自动停止。 在小鼠奔跑过程中，若其在管内转身朝向相反方向，需重新调整小鼠位置，同时保持管体持续旋转。
5. 对于能够持续跑动500秒的小鼠，结束其测试阶段。若小鼠提前掉落，最多允许其再进行两次尝试，以改善跑动时间。 
6. 使用最长运行时间（即 最长的 用于进一步分析。 

4. 跑台运动

跑步机可在临床前研究中以三种方式作为工具使用。首先，可采用强制跑步机跑步以加重疾病病理状态，如本方案所述（另请参见：DMD_M2.1.001.pdf）。其次，可评估小鼠的最大跑步能力以及治疗措施对这一能力的影响（有关让小鼠跑步至力竭的方法，请参见 DMD_M.2.1.003.pdf）。最后，可在其他功能测试之前进行跑步机跑步，以使小鼠力竭，从而在后续的第二次测试中表现更差¹³。具体操作是按照下文所述，每周对小鼠进行两到三次锻炼，紧接着实施方案1-3中描述的功能测试之一。

1. 仪器设置：市面上有多种商用跑步机，可同时让多只小鼠一起跑步，并可调节坡度、持续时间和速度。部分跑步机配备有网格，可传递低强度电刺激以促使小鼠奔跑。然而， mdx 小鼠对压力敏感，通过用手轻轻推动使其向跑步方向移动，即可温和地激发其运动意愿。因此，强烈建议不要使用电击网格。通常情况下，仅在第一次跑步训练时需要用手进行刺激。
2. 将小鼠置于水平跑台上。
3. 以12 m/min的跑步速度启动跑步机。对于老年小鼠，必须使用较低的速度（8 m/min）。>15个月），较高的速度容易导致疲劳。
4. 在第一次训练时，当小鼠接近跑带末端时，可轻轻推动以鼓励其奔跑。
5. 当小鼠跑动持续 30 min 后，将其放回笼中。
6. 每周重复两次 例如 12 周
7. 必要时安排休息时间。例如，某些 mdx 小鼠必须停止奔跑，并允许其休息几分钟。如果发生这种情况，关闭跑带，让所有小鼠休息2分钟，然后以4 m/min的速度开启跑带运行2分钟。此后，将速度提高至12 m/min，让小鼠完成整个实验程序。重要的是，所有小鼠都必须完成全部跑步方案。
   
   注意： 如果 mdx 小鼠需要休息期，建议在30分钟运动方案前进行热身。该热身阶段包括：2分钟 分钟 以 4 m/min 的速度进行适应期，随后立即以 8 m/min 的速度进行 8 分钟的热身。
   
   
   在我们实验室中，4至16周龄的雌性 mdx 小鼠能够完成30 min 无休息间隔的运动方案。其他研究者报道，在年龄匹配的男性中 mdx 小鼠中有45%需要休息间隔才能完成运动。热身方案可减少停止次数。¹².

结果

野生型和mdx小鼠的前肢握力在4至12周龄之间逐渐增强，而在更年老的小鼠中则再次下降。mdx小鼠在幼年时期即可观察到力量的受损。图1A和1B展示了9周龄雌性小鼠的代表性数据。尽管在此年龄段，两种小鼠品系之间的疲劳程度尚无差异，但mdx小鼠比野生型小鼠更弱。目前我们尚无关于年老mdx小鼠和野生型小鼠疲劳性的数据。

为了获得可靠且可重复的结果，应由同一名实验人员进行多次评估。本文所述方法为每只动物进行15次拉力测试，但较少次数的测试（低至5次）也能提供可靠的数据。需特别注意动物足爪在网格上的位置，因为这会显著影响实验结果。在进行拉力测试时，应仅使用两只前肢，且两前肢需并排紧靠放置（图1C）。若小鼠在拉力过程中未表现出抵抗，该次测量值不应被计入。

在双肢和四肢悬挂实验中，尤其是年轻的（4-16周龄）野生型小鼠，通常能够轻松达到600秒的最大悬挂时间。相比之下，年...

讨论

该 此处介绍的功能性测试具有可重复性，操作简便，适用于不同年龄的野生型和肌营养不良型小鼠。这些测试为临床前评估肌肉功能、力量、状态及协调性提供了有用的工具。在检测化合物对疾病自然进程的影响时，可将此处描述的非侵入性测试（前肢握力测试、两种悬吊测试以及转棒测试）有机结合，形成一个功能测试方案，并在连续数天内依次完成各项测试。这些方案不会对动物造成伤害 mdx 小鼠，且可用于纵向研究¹⁰需要注意的是，这些测试中的每一项结果均由不同或部分重叠的肌群产生，而非单一肌肉。因此，建议结合多项测试以获得更全面的信息，从而更深入地了解实验组的功能状况。 Alternatively, functional improvements of a sole muscle can be assessed using muscle physiology measurements²⁰.

与行为学测试类似，功能测试在不同小鼠之间，或同一只小鼠在不同次测试之间也可能表现出显著差异。为减少变异，所有测试应由同一名熟悉这些小鼠的实验人员完成。实验环...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠握力计	Chatillon DFE（由Columbus Instruments再销售）	# 80529
双肢悬挂金属丝装置	衣架或自制装置
四肢悬挂金属丝装置	大鼠笼盖或自制装置
转棒仪	Ugo Basil	# 47600
小鼠跑步机 Exer 3/6	Columbus Instruments	# 1055SRM