利用RNA干扰技术研究小鼠巨噬细胞的先天免疫反应

摘要

在本实验方案中，我们描述了利用 Amaxa Nucleofector 96 孔 Shuttle 系统将 siRNA 高效转染小鼠巨噬细胞系的方法，随后用脂多糖刺激巨噬细胞，并检测其对炎症性细胞因子产生的影响。

摘要

巨噬细胞是关键的吞噬性天然免疫细胞。当巨噬细胞遇到病原体时，会产生产生抗菌蛋白和化合物以杀灭病原体，分泌多种细胞因子和趋化因子以招募并激活其他免疫细胞，并通过抗原呈递激活适应性免疫应答。因此，能够利用RNA干扰（RNAi）等技术高效地操控巨噬细胞，对于我们研究这一重要的天然免疫细胞至关重要。然而，巨噬细胞在转染技术上具有挑战性，常表现出RNAi诱导的基因沉默效率低下。在本实验方案中，我们描述了使用Amaxa Nucleofector 96孔Shuttle系统，将siRNA高效转染至两种小鼠巨噬细胞系（RAW264.7和J774A.1）的方法，并介绍了最大化siRNA对基因沉默效果的操作步骤。此外，所述方法适用于96孔板格式，可支持中高通量研究。为展示该方法的应用价值，我们描述了利用RNAi抑制调控脂多糖（LPS）诱导细胞因子产生的相关基因的实验。

引言

在本实验方案中，我们描述了利用siRNA抑制小鼠巨噬细胞系中基因表达的高效方法，并监测这些处理对先天免疫反应的影响。这些操作在96孔板中进行，可实现中高通量的RNA干扰筛选。

在感染发生后，人体会启动迅速的先天免疫反应以及较慢但更具特异性的适应性免疫反应。这种快速的先天免疫反应包括募集和激活吞噬性先天免疫细胞，如巨噬细胞¹。经典活化的巨噬细胞参与急性炎症反应，产生抗菌蛋白和化合物、细胞因子和趋化因子，并具有抗原呈递功能^2,3。而替代性活化的巨噬细胞则在调节免疫、维持免疫耐受、组织修复和伤口愈合过程中发挥重要作用^4-8。由于巨噬细胞具有多种功能，其在动脉粥样硬化、关节炎和癌症等多种疾病中均可能发挥关键作用⁹。因此，巨噬细胞的研究长期以来一直是多种疾病领域的重要研究方向。

尽管巨噬细胞在先天免疫反应中具有重要作用，但其实验操作往往具有挑战性。特别是，使用脂质试剂对巨噬细胞进行转染时，常常难以在不产生细胞毒性的情况下实现高效的转染效率^10,11。此外，即使小干扰RNA（siRNA）能够有效递送至巨噬细胞，RNA干扰所诱导的基因敲低效果通常也较为有限，且不同基因之间的敲低效率可能存在差异。

为了克服这些技术难题，我们优化了两种小鼠巨噬细胞系 RAW264.7¹⁷ 和 J774A.1¹⁸ 中的转染与基因沉默技术^12-16。该方法采用 Amaxa Nucleofector 96 孔 Shuttle 系统进行转染；该系统结合专用试剂和电穿孔技术，可在 96 孔板格式中实现细胞转染¹⁹。在转染之后，我们描述了最大化细胞复苏率与存活率，以及增强后续 siRNA 介导的基因敲低效果的方法。为说明该方法的应用价值，我们介绍了一项向上述巨噬细胞系递送 siRNA 的实验方案，用脂多糖（LPS）刺激这些细胞，并在多种促炎性细胞因子的产生水平上监测其先天免疫应答。我们提供了示例数据，其中以 Toll 样受体（TLR）家族为靶点，该家族成员可识别 LPS 及其他病原体相关分子模式（PAMPs），从而调控先天免疫。

方案

1. 巨噬细胞系的维持

1. 在 DMEM 培养基中培养 RAW264.7 和 J774A.1 细胞系，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS），于 37 ºC、5% CO₂ 条件下培养。为帮助维持无菌环境，可在培养基中加入 1% 青霉素/链霉素（pen/strep）（尽管此步骤并非绝对必要）。
2. 关键步骤：确保巨噬细胞处于健康生长状态，以实现高效的转染和 siRNA 介导的基因敲低。在新鲜复苏后，使用传代次数为 3 至 10 之间的细胞，因为此阶段的巨噬细胞系具有最佳的转染效率，并能维持较强的转染后存活能力；请勿使用过高传代次数（>20）的细胞，因为转染效率和基因敲低效果均会显著下降。
3. 为优化 siRNA 转染效果，将细胞以 20% 贴壁密度接种，并培养一至两天，直至细胞融合度不超过 80%。过度生长的细胞将无法实现高效转染。

2. 编程96孔电穿孔系统的转染程序

1. 在连接穿梭仪的计算机上启动96孔穿梭软件。从左上角的文件菜单中选择新建参数文件。
2. 在显示的96孔板示意图上，选中将进行转染的孔位。绿色方框将标示已选中的孔。
3. 选择与所用巨噬细胞系相对应的程序（RAW264.7细胞系使用DS-136，J774A.1细胞系使用DS-130），然后点击96孔板示意图下方的应用。注意：选择程序后，示意图上的孔位将变为深蓝色。未分配程序的孔显示为空心圆圈，这些孔将不会施加电击。

3. 准备转染所需的试剂

1. 通过将SF细胞系96孔Nucleofector™溶液与随附补充剂管中的全部内容混合，制备工作用Nucleofector™溶液。使用前让混合试剂在室温下平衡。将多余的完整Nucleofector™溶液储存于4 ºC，可保存长达3个月以供后续使用。
2. 在制备巨噬细胞进行转染前，预先将DMEM、RPMI-1640、0.25%胰蛋白酶/EDTA和磷酸盐缓冲液（PBS）在37 ºC下预热。
3. 将siRNA置于冰上解冻，以准备用于转染。为尽量减少siRNA的冻融次数，首次使用时应将新siRNA分装后冷冻保存。
4. 在初步实验中，使用相对较高浓度的siRNA（2 µM，由20 µM储备液按1:10稀释）。随后可对能有效诱导基因敲低的siRNA进行剂量滴定，降至较低浓度；但通常与其它细胞类型相比，巨噬细胞中实现高效基因敲低需要更高的剂量。
   注意：siRNA可从多个来源获得；使用siGenome SMARTPOOLs（针对每个基因的四种siRNA混合物）可获得较为显著的基因敲低效果。作为阴性对照，可使用各种非靶向siRNA混合物或单个siRNA。
5. 为监测转染效率，可与实验用siRNA平行转染pmaxGFP对照质粒（Amaxa试剂盒中提供）或荧光标记的siRNA。预期GFP质粒的转染效率为30–50%（转染后次日通过显微镜或流式细胞术检测），而荧光标记siRNA的转染效率可达>99%（转染后立即在恢复阶段通过流式细胞术检测）。

4. 转染前巨噬细胞的准备

1. 通过胰蛋白酶消化法从细胞培养皿上分离贴壁的巨噬细胞。吸除培养基，并用 10 ml PBS 洗涤细胞两次。去除 PBS 后，加入预热的 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液（每 10 cm 培养皿加 1 ml），孵育 1–2 分钟，直至细胞开始脱落。孵育期间轻轻敲击培养皿并晃动液体，以最大化胰蛋白酶消化效果。
2. 孵育结束后，加入 9 ml DMEM + FBS 培养基，轻轻吹打混匀，用移液器将细胞收集至无菌离心管中。
3. 使用血细胞计数板对分离的巨噬细胞进行计数。每 10 cm 培养皿可获得约 1000 万个巨噬细胞。根据实验需求计算所需巨噬细胞总数；96 孔电转板每孔需要 200,000 个细胞。请注意额外多准备几孔的细胞量，以补偿移液过程中的损失。
4. 将计算好的细胞数量移入离心管中，在室温下以 150 × g 离心 10 分钟。离心速度不宜过高，以免影响巨噬细胞活性和转染效率。

5. 核转染 巨噬细胞的siRNA转染

1. 使用无菌的96孔圆底板（有助于混合并最大限度减少试剂损失），向每个需要转染的孔中加入2 µl的每种siRNA。
   注意：根据siRNA的数量，此步骤可在巨噬细胞离心过程中完成。
2. 吸除离心后细胞的培养基。用Nucleofector™ SF溶液（含补充液）轻轻重悬细胞，每20万个细胞沉淀使用20 µl。重悬后应立即使用细胞以获得最佳转染效果。
3. 将重悬的细胞转移至无菌储液槽中；使用多通道移液器，将20 µl重悬细胞混合物转移至含有siRNA的96孔板的每个孔中。通过上下吹打轻轻混匀。
4. 将20 µl细胞/siRNA混合物转移至96孔Nucleocuvette™板中。关键步骤：转移过程中避免产生气泡，因为气泡可能导致电转染时出现错误。
5. 将所有实验样品放入转染板后，盖上配套的盖子，并在硬质表面上轻轻敲击，以去除样品中的任何气泡。
6. 将带盖的96孔板放入96孔Nucleofector转运装置中，然后在程序屏幕右下角选择“上传并开始”。在电转染前，请按照程序提示保存结果。
   注意：在电转染过程中，成功转染的孔将在屏幕上的96孔示意图中以带加号的绿色圆圈表示。带减号的红色圆圈表示出现错误，最可能的原因是存在气泡或移液时试剂体积不准确。

6. 巨噬细胞的回收与铺板

1. 电转染后立即使用多通道移液器，向每个孔中加入 80 µl 预热至 37 ºC 的 RPMI-1640 培养基。将培养基加至孔壁侧边，使其缓慢与转染后的细胞混合，此阶段细胞极为脆弱。切勿快速加入培养基，否则会显著降低细胞存活率。
2. 将含有转染样本和 RPMI-1640 培养基的 96 孔板置于 37 ºC、5% CO₂ 培养箱中孵育 2 分钟；此步骤至关重要，可使细胞在后续操作前充分恢复。
3. 从培养箱中取出 96 孔板，使用多通道移液器小心地将每孔中的混合液转移至新的 96 孔组织培养板中。
4. 使用多通道移液器，向每个孔中加入 100 µl 预热至 37 ºC 的 DMEM+FBS 培养基。
5. 将含有样本的 96 孔组织培养板置于 37 ºC、5% CO₂ 培养箱中孵育 24–36 小时（可根据不同 siRNA 优化具体时间，但该时间范围通常效果良好）。

7. 使用LPS刺激巨噬细胞

1. 核转染后24-36小时 孵育，用新鲜培养基配制LPS（或其他PAMPs）。为所有孔准备足够的新鲜培养基（每孔200 µl，96孔板，另加少量用于移液）。将LPS用DMEM+FBS稀释至终浓度为20 ng/ml。
2. 小心吸出96孔板中的培养基，并向细胞中加入含有LPS的新鲜培养基。
3. 在刺激后的不同时间点监测对LPS或其他PAMPs的反应。刺激6小时足以诱导IL-6或TNFα等细胞因子产生显著的炎症反应。

8. 巨噬细胞中诱导的先天免疫反应、基因敲低及细胞活力的监测

1. 为了监测LPS诱导的细胞因子产生，将细胞上清液用移液器转移至96孔储存板中。随后可通过ELISA检测细胞因子的产生水平。
2. 去除上清液后，使用乙酰丙酸荧光素（fluorescein diacetate）检测细胞活力（该化合物可被活细胞内的酯酶切割而产生荧光）。利用此方法可鉴定靶向调控细胞活力相关基因的siRNA。注意：若转染操作正确进行，转染过程本身对细胞活力的影响应较小。
   1. 向每孔中加入乙酰丙酸荧光素（5 mg/ml的丙酮储存液），终浓度为1:100（溶于PBS）。
   2. 室温孵育1至5分钟，然后使用酶标仪检测细胞荧光（激发波长460 nm，发射波长515 nm）。
   3. 可选步骤：为确保孔内荧光信号均匀，可使用RIPA等裂解缓冲液裂解细胞；这可在孔内提供均匀的荧光信号，因为某些酶标仪仅检测孔内小范围区域；若细胞铺板不均匀，乙酰丙酸荧光素可能导致读数不准确。
3. 作为检测细胞活力的替代方法，可从贴壁细胞中提取RNA，通过qPCR检测siRNA诱导的基因敲低效果。
   1. 在去除细胞上清液后（即上述步骤8.1），直接向贴壁细胞中加入RLT缓冲液（用于细胞裂解及RNA保存）以裂解细胞。
   2. 使用RNeasy mini-kit等RNA提取试剂盒提取RNA，并利用基因特异性引物进行qPCR，以对照siRNA处理组为参照检测基因敲低效率。可使用Βactin或GAPDH的引物进行数据归一化。
4. 作为另一种检测先天免疫反应其他方面的替代方法，可通过添加FITC标记的E. coli颗粒至贴壁细胞，并使用相应试剂盒检测巨噬细胞的吞噬能力。根据试剂盒制造商提供的操作流程（仅需数小时），使用酶标仪或显微镜检测吞噬摄取情况。

结果

为了验证采用该方法进行转染的效率，我们使用流式细胞仪检测了FITC标记的siRNA的摄取情况（图1）。

为了说明我们所采用的方法在监测先天免疫反应中的实用性，我们将靶向已知先天免疫调控基因的siRNA转染至RAW264.7巨噬细胞系中，用LPS刺激细胞，随后监测促炎性细胞因子IL-6和TNFα的产生。不同的TLR识别不同的病原体相关分子模式（PAMPs），其中革兰氏阴性菌的LPS由TLR4²⁰识别，脂肽（如PAM3CSK4）由TLR2²¹识别，病毒来源的双链RNA（如模拟物poly(I:C)）由TLR3^22,23识别。如图2所示，使用siRNA抑制TLR4（而非其他TLR）可显著降低LPS诱导的IL-6和TNFα的产生。此外，使用siRNA抑制IL-6可降低IL-6的产生，但不影响TNFα的产生（比较图2中的图A与图B）。

讨论

已有大量研究报道了在小鼠巨噬细胞中利用siRNA靶向单个基因的方法。尽管脂质体转染法已被用于向巨噬细胞系单独递送siRNA，但这些方法存在影响细胞活力的潜在风险、基因沉默效率有限以及不同基因间结果重复性差等问题。为了建立更可靠的检测方法，可用于中高通量方式下靶向基因，我们优化了使用Amaxa Nucleofector 96孔Shuttle系统的技术，该系统在基因沉默效果上表现出更高的一致性，且对细胞活力影响较小（尽管该系统的成本高于脂质体介导的方法）。我们测试了多种变量以优化实验流程。我们成功利用该系统高效地将siRNA递送至多种不同的原代巨噬细胞和永生化巨噬细胞系（在某些情况下需使用Amaxa 96孔细胞系优化试剂盒）。在对不同小鼠巨噬细胞系（RAW264.7、J774A.1和MH-S）及原代细胞（巯基乙酸盐诱导型巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞）进行的初步测试中，我们发现RAW264.7和J774A.1细胞表现出最强的siRNA诱导基因沉默效果（随后依次为MH-S细胞和原代细胞，数据未显示）。由于这两种永生化巨噬细胞系在研究中被广泛使用，我们进一步针对这两种细胞系优化了RNA干扰实验流程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Amaxa 96孔核转染系统	Lonza	AAM-1001S
Amaxa SF细胞系96孔核转染试剂盒	Lonza	V4SC-2096
RAW264.7 小鼠巨噬细胞系	ATCC	TIB-71
J774A.1 小鼠巨噬细胞系	ATCC	TIB-67
siGenome smartpool siRNA	Dharmacon	根据基因不同而变化
非靶向对照siRNA混合物	Dharmacon	D-001206-13-20
用于电穿孔的Block-iT荧光寡核苷酸	Invitrogen	13750062
超纯 E. coli O111:B4 LPS	List Biological Laboratories	421
DMEM，高糖	Invitrogen	11995-065
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）	Fisher	SV30010
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200072
96孔组织培养板	Fisher	07-200-89
96孔圆底无菌板（未包被）	Fisher	07-200-745
小鼠IL-6 Duoset ELISA试剂盒	R&D Biosystems	DY406
小鼠TNFα Duoset ELISA试剂盒	R&D Biosystems	DY410
二乙酸荧光素	Sigma-Aldrich	F7378
RLT缓冲液	Qiagen	79216
RNeasy小型试剂盒	Qiagen	74134
Vybrant吞噬作用检测试剂盒	Invitrogen	V-6694