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方法文章

无细胞系统中RNA加工反应的分析：前体mRNA底物的3'端切割 体外

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DOI：

10.3791/51309

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2014年5月3日

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemistry, City College of New York

本文内容

摘要

RNA聚合酶II合成的前体RNA会延伸至成熟mRNA的3'末端之外。成熟RNA的末端在转录过程中由RNA序列决定的位置通过切割复合物的核酸内切酶活性生成。本文详细描述了研究切割反应的方法 体外.

摘要

哺乳动物mRNA的3’端并非由RNA聚合酶II（RNPII）转录时突然终止形成。相反，RNPII会继续合成超出成熟RNA末端的前体mRNA，随后在特定位置通过内切核酸酶的活性进行切割。前体RNA的切割通常发生在保守多聚腺苷酸化位点（AAUAAA）下游10-30个核苷酸处，且紧随CA二核苷酸之后。切割复合物是一种多因子蛋白复合物，分子量约为800 kDa，其中的蛋白质负责执行这一特异性的核酸内切活性。多聚腺苷酸化位点上下游的特定RNA序列可调控切割复合物的募集。切割完成后，前体mRNA立即由多聚腺苷酸聚合酶（PAP）进行加尾，生成成熟的、稳定的RNA分子。

使用带有特异性放射性标记RNA底物的细胞核提取物，可对RNA转录本3’末端的加工过程进行研究。总之，一种长 32P标记的未切割前体RNA与核提取物孵育 体外，通过凝胶电泳和放射自显影评估切割情况。当发生正确切割时，可检测并定量较短的5’端切割产物。本文以HIV-1 mRNA的3’端加工为例，详细描述该切割实验方法。

引言

大多数成熟的真核生物信使RNA（mRNA）的生物合成需要多种转录后修饰，例如加帽、剪接和多聚腺苷酸化。这些修饰通常相互偶联，以确保正确的加工过程1，并显著提高mRNA的稳定性。

哺乳动物前体mRNA的3’端形成是通过内切核酸酶对新生RNA进行切割，随后由多聚腺苷酸聚合酶（PAP）在5’端切割产物上添加腺苷酸残基而实现的2-4。在哺乳动物中，切割过程由一个约800 kDa的多组分蛋白质复合物完成，该复合物在特定的前体RNA序列上组装。多聚腺苷酸信号序列是一个高度保守的经典六核苷酸序列AAUAAA，可指导切割位点位于其下游约10–30个核苷酸处。该位点被切割与多聚腺苷酸化特异性因子（CPSF）特异性识别，其中CPSF的73 kD亚基含有内切核酸酶活性。切割刺激因子（CstF）则结合于多聚腺苷酸位点下游一段更为多变的富含GU或U的序列元件。哺乳动物切割因子I（CFIm）和哺乳动物切割因子II（CFII）也是切割所必需的。CFIm结合于上游序列元件（USEs）中特定的UGUA(N)位点，这些位点已在多个基因中被鉴定，并似乎参与重要的生理过程5-8。

体外中，RNA 加工反应通常通过使用放射性标记的 RNA 底物进行分析9-12。这些底物可通过来自噬菌体 T7 或 SP6 启动子的加尾转录合成。在研究尚未表征的多聚腺苷酸化位点时，必须使用基因组 DNA 而非 cDNA 来制备 RNA 底物，因为重要的下游序列在 cDNA 中可能缺失。设计底物时应包含从成熟 mRNA 的切割位点/末端起上游至少 150 个核苷酸（nt）和下游 50 个核苷酸。切割产物的迁移速度比底物快；然而，由于非特异性核酸酶活性可能产生其他片段，因此必须通过反应对正确加工信号序列的依赖性来验证其特异性。因此，含有 AAUAAA 序列点突变（例如 AAGAAA）的 RNA 底物可作为切割反应的阴性对照。

由于切割反应中仅使用少量放射性标记的RNA，而大多数核提取物中富含核糖核酸酶（RNase），这可能会造成问题，并限制提取起始材料的选择。HeLa细胞通常内源性RNase水平较低，因此在这些检测中表现良好。

RNA底物的内切核酸酶切割 体内 和 体外 紧接着发生多聚腺苷酸化反应，因此切割产生的中间产物无法以可检测的量存在。因此，为了研究特定的RNA序列或参与切割反应的蛋白质，实验需在阻止多聚腺苷酸化发生的条件下进行。切割反应与多聚腺苷酸化之间无相互依赖关系，反之亦然，因此可以在不影响切割反应的前提下抑制多聚腺苷酸化。为此，将ATP替换为缺乏3’羟基的链终止类似物，使得在多聚(A)位点只能掺入单个核苷酸，从而仅能检测到经过切割的RNA。

鉴于此类实验的复杂性和高度特异性，我们提供了一套详细的视频实验方案，用于研究mRNA前体在切割/多聚腺苷酸化机制作用下的内切核酸酶切割过程 体外我们介绍了如何制备具有转染活性的核提取物、生成放射性标记的RNA底物、进行切割反应，以及分析和解读反应产物。 图1 显示了用于切割实验的底物RNA示例，该RNA编码HIV-1前体mRNA的3’端。HIV RNA基因组的3’端包含多个重要的调控序列，如多聚腺苷酸化位点（poly(A) site）、富含G+U的区域以及USE元件，这些序列对于病毒mRNA转录本的有效成熟均至关重要13在此示例中，预期输入的RNA底物长度为338 nt，切割后为237 nt。若发生多聚腺苷酸化，则会在237至437 nt之间观察到一条产物弥散带。

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方案

1. 贴壁细胞向悬浮状态的适应性转化

（此为可选步骤。悬浮细胞通常可制备出更好的核提取物，但培养在培养板中的细胞也可使用。）

  1. 使用添加5-10%新生小牛血清或胎牛血清以及1% L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素的Joklik改良MEM培养基，使贴壁细胞适应悬浮生长。在带有滤帽的旋转培养瓶中，于37 °C、8% CO2条件下培养细胞。
  2. 在细胞适应过程中，从500 ml旋转培养瓶中加入100 ml培养基开始。维持细胞密度不低于0.3 x 106 个细胞/ml，并每隔1-2天更换培养基，直至达到理想的生长速率（通常需要2-6周）。细胞成功适应后，悬浮培养的HeLa细胞大约每24小时增殖一倍。注意：在适应阶段，细胞需要一段时间才能恢复至正常的倍增速度。
  3. 将细胞维持在0.5-0.8 x 106 个细胞/ml的密度，并置于所需最终体积（通常为1-10 L）的培养体系中。
  4. 通常在对数生长期中期收获细胞（细胞密度约为0.5-0.65 x 106 个细胞/ml，且存活率>90%）。根据所需培养基体积选用合适规格的旋转培养瓶。

2. 核提取物

  1. 缓冲液与试剂配制
    注意： 提取操作按照改进的 Dignam 方法进行 等人 (1983)14 核提取步骤
    1. 配制1×磷酸盐缓冲液、缓冲液A、缓冲液C和缓冲液D（表1在进行提取前的前一天完成，并置于 4 °C 保存。
      注意：  通常使用新配制的缓冲液可获得更高的产量；然而，该缓冲液在数周内保持稳定。所有缓冲液、器具和设备必须预先冷却，并在整个提取过程中保持低温。尽可能在冷室中操作，和/或始终将物品置于冰上。DTT 和 PMSF 应在使用前立即加入。
  2. 收集与洗涤细胞
    1. 将细胞分装至四个 250 500 x g、4 °C 条件下，使用带摆动或固定转角转子的离心机，将细胞悬液于 50 ml 锥形瓶中离心 5 分钟。倾去上清液，每瓶中再加入 250 ml 细胞培养基。重复离心，直至所有细胞完全沉淀。
    2. 将合并后的最终沉淀物重悬于总共 250 ml 的冰冻 PBS 中，并收集至一个 250 ml 容器内 毫升锥形瓶中，于4 °C条件下，以400 × g离心10分钟，使用水平转子离心机。
    3. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于预冷的 PBS 中，总体积不得超过 50 ml。通过移液吹打使沉淀充分分散，随后转移至 50 毫升锥形离心管
    4. 再次在4 °C下，以500 × g离心6分钟，使用摆桶式离心机。倒去上清液，并尽可能准确地估计和记录细胞沉淀体积（CPV）。若沉淀体积低于管壁上的刻度线，可使用另一支匹配的试管装水进行比对。
  3. 细胞裂解
    1. 向缓冲液A中加入DTT。用相当于估计CPV体积5倍的缓冲液A重悬沉淀，用移液器吹打使沉淀分散，冰上孵育10分钟。
    2. 在4 °C条件下，使用摆桶式离心机以931 × g离心10分钟。
    3. 小心吸除上清液，避免倾倒。由于细胞膨胀，沉淀体积应大约增加至原来的两倍。
    4. 加入1个细胞体积的缓冲液A至细胞中。轻轻吹打使沉淀重悬，并取少量等分试样（约50 µl）转移至冰上的微量离心管中。将重悬的细胞转移至适当尺寸的Dounce匀浆器中（通常为15 冰上预冷的 ml 规格容器。
    5. 使用B型（紧密）研杵对细胞进行12-15次缓慢而稳定的研磨以裂解细胞。取少量裂解液，经台盼蓝染色后在显微镜下观察裂解是否完全（完整细胞表现为小而深色的细胞核，与膨胀的细胞对比；完整细胞呈透明状）。继续匀浆直至裂解率达到90%，此时即停止操作，过度研磨可能对核提取物的质量产生不利影响。
    6. 将裂解液转移至超清晰超速离心管中，并记录总体积。通过称重平衡离心管，于4 °C、1,069 × g条件下离心10分钟。
      注意： 此步骤尽管转速较低，但仍使用超速离心机，因为同一离心管将在下一步中以更高转速离心。此次离心将形成较为紧密的沉淀，覆盖管底，上层为较浑浊的上清液，可收集该上清液用于制备胞质S100提取物。若管顶存在可见的脂质层，可将其去除。
    7. 用移液器小心吸除上清液，并转移至另一支离心管中。 避免扰动细胞核沉淀. 注意： 了解上清液的最终体积对于确定核沉淀体积（PNV）至关重要。
  4. 核提取物的制备
    1. 待上清液小心移除后，将粗核提取物沉淀在相同离心管中于4 °C、25,453 x g条件下重新离心15分钟。
    2. 移除残留的上清液（应为少量澄清液体），并将其加入之前的上清液收集管中。测量上清液的最终体积。通过从先前记录的原始裂解液体积中减去该体积，计算出 PNV。或者，若沉淀物足够大，可通过在相同试管中与等体积水进行比较，估测其体积。
    3. 加入1倍PNV体积的缓冲液C（约每毫升细胞加入1毫升）。用移液器枪头小心吹起沉淀，转移至适当大小的Dounce匀浆器中。若使用与之前相同的匀浆器，需先用无菌去离子水预冲洗匀浆器。
    4. 使用 tight 研杵通过 Dounce 匀浆器将沉淀重悬，研磨约 5–10 次。
    5. 将匀浆后的核裂解液转移至预冷的离心管中，于4 °C颠倒混匀30分钟。若体积足够，可使用磁力搅拌器和搅拌子进行振荡混合。
    6. 将裂解液转移至新的超清离心管中，在 4 °C 下以 25,453 × g 离心 30 分钟。沉淀应致密。离心结束前约 5 分钟，用适当分子量截留值（MWCO）的透析盒或透析管进行水合处理。例如 7,000 kDa
    7. 使用移液管将上清液（核提取物）从管中转移至预冷的锥形管中，然后进行透析。
  5. 透析
    1. 按照制造商说明，将提取物注入已水化的透析盒中，并在500 ml缓冲液D中对核提取物进行透析50 在 4 °C 下搅拌孵育 1 小时。
    2. 用 500 ml 新鲜预冷的缓冲液 D 替换原有缓冲液50 并再透析4小时 在 4 °C 下。此 4 小时步骤可改为每 2 小时更换一次，共更换两次。
    3. 从透析盒中取出提取物并转移至预冷的离心管中。在 4 °C 条件下，以 1,500 × g 离心 5 分钟。
    4. 将提取物分装至预冷的Eppendorf管中，每份50–100 µl，液氮中速冻，-80 °C保存备用。

3. RNA 探针合成

  1. 模板制备
    注意： 用作转录的模板可以是含有T7或SP6启动子的PCR片段或质粒，其中启动子位于目标探针序列的上游且紧邻该序列。质粒模板必须在目的模板序列下游进行线性化处理。我们观察到PCR模板的产量更高。
    1. T7/SP6 启动子可在 PCR 反应过程中插入。设计正义引物时，将 T7/SP6 启动子置于目标序列的上游。
    2. 使用高保真聚合酶，按照制造商说明书通过PCR对每个模板进行2-3次反应，扩增目标序列。
    3. 合并等量反应产物，并通过凝胶回收进行纯化。
    4. 对PCR产物进行测序以验证模板的准确性。（可选）
  2. RNA转录 32P标记
    1. 执行 体外 使用市售的与启动子（SP6 或 T7）兼容的试剂盒，以 1 µg 模板进行转录，并作如下修改：加入 1 μl 新鲜的 3,000 Ci/mmol [α-32P] UTP，0.5 μl 10 mM 冷 UTP，0.1 µl 10 mM GTP 和 0.9 μl 10 mM m7G(5’)ppp(5’)G RNA 帽结构，总体积为 20 µl。
      注意： G-帽可提高核提取物中RNA转录本的稳定性（帽:GTP比例为10:1）。添加冷UTP以防止 32防止P-UTP成为限制性试剂。
    2. 如上所述合成不含G帽的RNA大小梯度标记物。可使用商业模板制备RNA大小标记物。
    3. 在37 °C下孵育转录反应1小时（若使用SP6，则为40 °C）。反应完成后，在37 °C下对模板进行DNase消化，持续15分钟。
    4. 消化完成后，加入 1 μl 的 0.5 M 向RNA底物中加入EDTA和5 μl上样缓冲液II。向标记物中加入20 μl上样缓冲液II。
    5. 将RNA标记物和探针在95 °C下加热3分钟，然后置于冰上。
  3. 聚丙烯酰胺凝胶制备/探针电泳
    1. 配制1 L的6%聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）混合液和400 ml的10% PAGE。配制6%凝胶时，将150 ml的40% 19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺、100 ml的10×Tris/硼酸/EDTA（TBE）缓冲液与460 g尿素混合，加入去离子水定容至800 ml，在加热板上低温加热（约50–80 °C）搅拌溶解，最后用去离子水补足至1 L。
      注意： 该反应为吸热反应。加热可促进尿素的溶解。尿素完全溶解后立即停止加热，并用去离子水定容至1 L。或者，可在室温下搅拌过夜；过高的温度可能引发聚合反应。
    2. 用铝箔避光保护PAGE混合液，并于室温保存。PAGE混合液可预先配制，数月内稳定。
    3. 通过混合100 ml的40% 19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺、40 ml的10×TBE和184 g尿素，制备400 ml的10% PAGE混合液。待尿素溶解后，用去离子水定容至400 ml。
      或者，配制含缓冲液和尿素的20% 19:1丙烯酰胺溶液和0%丙烯酰胺溶液；两者可按任意比例混合，以获得0%至20%之间的任意浓度丙烯酰胺溶液；尿素溶解通常较慢。
    4. 根据待制备凝胶的数量，用无菌去离子水配制10–50 ml的10%过硫酸铵（APS）溶液。
    5. 用70%乙醇（EtOH）清洗20 cm × 22 cm玻璃凝胶板，再用大张无绒布擦拭干燥。
    6. 用1 ml 5 N氢氧化钠（NaOH）清洗常规培养板，然后用70%乙醇（EtOH）再次清洗。用浸有防凝硅化液的饱和小号Kimwipe擦拭带缺口的培养板，进行包被。
    7. 将普通培养板放置于空的移液枪吸头盒或一块聚苯乙烯泡沫上，使清洁面朝上，并高于桌面，以组装培养板。放置0.4 每条长边边缘使用 mm 间隔物。
    8. 将带缺口的玻璃板小心地放在间隔条上，确保涂层面向内侧。使用刀片或其他细长工具调整间隔条，使凝胶板底部和两侧对齐，然后在凝胶板两侧的间隔条上方用长尾夹固定。
    9. 每块凝胶通过将15 ml 10%和15 ml 6%的PAGE混合液混合，制备30 ml 8%的PAGE混合液 1.5 ml 离心管中。迅速向 8% 分离胶混合液中加入 300 μl 10% 过硫酸铵（APS），随后加入 30 μl N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）。
      注意： 实验人员应根据各个探针的大小选择合适的凝胶浓度。
    10. 盖紧并倒置 2 次 将溶液倒入凝胶板的缺口区域。用手轻轻抬高凝胶板，保持均匀倾倒，直至PAGE混合液开始从底部滴出。
    11. 将制胶板放回水平位置，并立即插入用于0.4 mm × 20 cm凝胶的大号8孔矩形梳子。底部附近的小气泡不会影响电泳，但加样孔内不得有气泡。
      注意： 在凝胶底部和顶部下方的桌面上放置纸巾，以吸收灌胶过程中可能溢出的液体。
    12. 让PAGE混合液聚合至少30分钟。
    13. 将聚合好的凝胶转移至冷室，组装电泳装置。向上下电泳槽中加入预冷的TBE缓冲液至填充线。 
    14. 移除梳子，使用剃刀清除任何残留物。将凝胶放入电泳装置中，并用文件夹夹子将玻璃板固定在密封垫上。向内槽加入冷的TBE缓冲液，直至液体流入玻璃板之间。
    15. 使用30 ml注射器和21 G针头冲洗孔板 1-1/2英寸针头，在上样标记的RNA底物前用预冷的TBE填充。在玻璃板背面放置铝板，以帮助电泳过程中热量均匀分布。
    16. 在不同的加样孔中分别加入3 μl的Marker和每种RNA底物的全部25 μl转录反应产物。在大小相近的转录本之间留出空孔，以防止交叉污染。上样缓冲液中的溴酚蓝和二甲苯蓝染料可用于估计核酸在凝胶中的迁移大小。
    17. 以适合RNA探针大小的恒定功率电泳运行凝胶（例如 25 瓦，600 nt 探针处理 2 小时。
  4. 标记RNA的提取与纯化
    1. 电泳结束后，小心排空凝胶装置上层腔室中的液体。大部分放射性物质将位于凝胶和下层腔室中；然而，上层缓冲液可能仍含有少量放射性物质。
    2. 若需将凝胶转移至其他放射性物质工作区域，请使用托盘进行运输。轻轻侧向拉出突出部分，以移除凝胶周围的垫片。
    3. 轻轻分离两块玻璃板，凝胶应附着在未硅化的玻璃板上。将一块塑料膜覆盖在凝胶和玻璃板上。
    4. 在凝胶上无样品区域的塑料膜上放置一个Glogos autorad marker标签。
    5. 在暗室中，将一张放射自显影胶片覆盖在整个平板上，曝光至少1分钟。显影胶片。
    6. 将显影后的胶片置于浅色表面上，然后将凝胶的塑料面朝下放在胶片上，对齐凝胶的自显影标记与胶片上曝光的标记。对齐后，使用黑色记号笔在玻璃上标记目标条带的位置。
      注意： 或者，可通过以下方式对凝胶/胶片进行对齐以切下RNA条带。在暗室中，将包裹好的凝胶置于桌面上，将胶片覆盖其上，再将一个暗盒（或书本等）压在胶片上方。短暂打开房间电灯后立即关闭。这一操作将使胶片“预曝光”，由于上方暗盒对光线的遮挡作用，胶片上会留下所有加样孔位置的轮廓。由此可方便地将胶片与凝胶对齐，并在无需使用荧光标记的情况下准确切下目标条带。
    7. 小心移除塑料封膜，每种RNA底物均使用新的解剖刀或剃刀，从凝胶中切下条带，并分别放入1.7 mL离心管中 毫升微量离心管。洗脱过程中使用旋转混合仪进行轻柔振荡。
    8. 加入 500 μl RNA 洗脱缓冲液（0.5 M） 乙酸铵，10 mM MgCl₂2，1 mM EDTA，0.2% SDS）加入各管中。短暂离心使凝胶碎片浸入溶液。于 室温 在黑暗中孵育 3–16 小时 取决于探针大小。
    9. 将全部500 μl洗脱液转移至新离心管中。避免转移任何凝胶碎片，因其会干扰纯化过程。加入1 μl甘油（20 mg/ml）以及500 μl冰冷的酸性酚-氯仿（用于RNA）。
    10. 短暂涡旋，溶液应呈现浑浊状。室温下离心 在最高转速（约 16,000 × g）下离心 5–6 分钟。
    11. 小心将上层（水相）转移至新离心管中，尽可能收集全部液体，避免混入中间层的残渣。向转移后的水相中加入等体积的氯仿。重复步骤3.4.10，将上层（水相）转移至新的离心管中。向收集的样品中加入1 ml冰浴的95-100%乙醇。在-80 °C孵育10分钟。 注意： RNA 可在常温下保存过夜 如需要。
    12. 在 4 °C、16,000 × g 条件下离心 30 分钟，使 RNA 沉淀。小心将上清液倒入放射性废物容器中，并向每份沉淀中加入 1 ml 冰冷的 70% 分子生物学级 EtOH。
    13. 在 4 °C、16,000 × g 离心 15 分钟使 RNA 沉淀，倾去上清液，再短暂离心 1 分钟，用移液器吸除残留的乙醇，并将样品置于 室温 瓶盖打开，以使残留的乙醇充分挥发。
    14. 将沉淀重悬于 20–30 μl 无 RNase 水中。标记的 RNA 可在 -80 °C 下保存。
      注意： 在整个提取过程中，应使用放射性检测仪来确认标记的RNA在任何步骤中均未丢失。
  5. 前体mRNA 3’端mRNA切割反应中标记RNA的定量
    1. 使用以下步骤估算切割底物的摩尔浓度。
      1. 以 1 μl 的 3,000 Ci/mmol [α-32P] UTP 和 10 mCi/ml。（在标签标注的参考日期，该储备液的化学浓度为 3.3 µM UTP。在此日期之前浓度更高，一个半衰期（约 13 天）后约为 1.6 µM，依此类推。）当最终反应体系中未标记的 UTP 浓度高于 UTP 的 Km 被使用。T7 RNAP Km UTP的浓度为114 mM 15.
      2. 将1 μl稀释于39 μl水中，然后加入1 μl稀释后的[α-32将含P] UTP的样品加入适量闪烁液至闪烁瓶中。注意： 闪烁液在此特定实验活动中实际上并不需要 32P 作为切伦科夫计数也会提供可靠的每分钟计数（cpm）值。请查阅闪烁计数器使用手册，选择用于切伦科夫计数的正确通道，并对1 ml体积样品计数1分钟。
    2. 将每种标记的RNA底物各取1 μl分别稀释到不同的小瓶中，加入与前一步骤等量的闪烁液。确保设置一个仅含闪烁液的小瓶用于背景值计算。使用闪烁计数器定量放射性。
    3. 将每分钟计数相乘 （cpm）用于[α-32将UTP样品的P计数乘以40以校正初始稀释倍数，并减去仅闪烁液测得的本底值。将每个RNA探针的计数乘以用于重悬RNA探针的无RN酶水体积（20–30 μl）。由此得到纯化RNA的总cpm值。
      示例： 最大cpm =（cpm [α-32P] UTP – 背景) x 40. 标记的RNA样本1 = 20,000 cpm × 20 = 400,000 cpm（若用20 μl重悬）
    4. 如果使用的量不是1 μl的[α-32P] UTP 用于制备转录本，然后将此体积计入最终的 [α-32P] UTP 通过将 [α-32P] UTP 样品用量
      示例： 2 μl 的 [α-32P] UTP 用于制备转录本。1 µl 的计数每分钟（cpm）计算值 [α-32P] UTP 为 500,000 cpm。将 500,000 乘以 2，得到 1,000,000 cpm
    5. 将计算得到的标记RNA的cpm除以计算得到的[α-32仅使用 P] UTP。这将粗略估算掺入的标记 UTP 的百分比。
      示例： 400,000 / 1,000,000 = 0.40 或 40% 已掺入
    6. 由于酶无法区分同位素，因此在转录过程中，标记与未标记的UTP以相同比例掺入RNA中。计算加入转录反应的冷UTP的摩尔量（10 mM溶液的0.5 μl） 溶液 = 5.0 × 10-9 UTP的摩尔数
    7. 将反应中 UTP 的摩尔数乘以掺入率（由上述热 UTP 计数已知），然后除以 RNA 序列中尿苷的数量。
      示例： 5.0 × 10-9 UTP 的摩尔数 × 0.40 = 2 × 10-9 摩尔 UTP
      2 x 10-9 摩尔 UTP / 73 U 每转录本 = 2.7 × 10-11 RNA的摩尔数
    8. 将RNA的摩尔数除以回收的RNA重悬溶液的体积，换算为摩尔浓度。
      示例： 2.7 x 10-11 RNA的摩尔数 / 20 μl = 1,370 nM RNA。对于由约1 µg线性化质粒制备的T7 RNAP转录本，重悬于20 µl中 水，典型值为 200 至 1,400 nM。
      注意： RNA 的摩尔浓度用于确保剪接反应中最终 pre-mRNA 底物浓度的准确性 体外 切割反应浓度低于 5 nM 每次切割反应。若RNA浓度显著高于5 nM，切割效率可能下降。

4. 3’ mRNA 切割反应

  1. 切割反应试剂的制备
    1. 准备裂解反应所需的所有试剂。通过煮沸水并缓慢加入准确称量的聚乙烯醇（PVA）粉末配制10%聚乙烯醇溶液。10% PVA溶液黏稠，溶解需要较长时间。储存于 室温 或 -20 °C。
    2. 制备 1 M 磷酸肌酸（CP）并在 -80 °C 下保存。必须使用 1 M 小于4个月的CP。
    3. 制备 1 M DTT 并在 -20 °C 下保存。配制新鲜的 0.2 M 1 M DTT 溶液的稀释 DTT 在进行切割反应前立即加入。
    4. 制备 ETS（切割终止溶液）：10 mM Tris pH 7.8，10 mM EDTA，0.5% SDS。储存于 室温
  2. 切割反应
    1. 将标记的 RNA 在 80 °C 下加热 2 分钟，然后置于冰上。
    2. 轻轻涡旋振荡，然后以最高速度离心10% PVA溶液2-3分钟，以去除气泡。
    3. 主混合液1：单个反应体系中加入3.125 μl 10% PVA和0.625 μl 1 M CP，0.25 μl 0.5 M tRNA，0.125 μl 100 mM dATP，0.13 μl 40 U/μl RNase抑制剂，0.25 μl 0.1 M EDTA pH 8，0.1 μl 0.2 M DTT 和 0.645 μl 无 RNase 水。在冰上每管分装 5.25 μl 混合液 1。
    4. 主混合液2：使用浓度高于2 mg/ml的核提取物，每反应6.25 μl。可用缓冲液D稀释核提取物50 如有需要。
    5. 将6.25 μl核提取物与先前已分装的5.25 μl主混合液1混合。加入1 μl稀释至50 nM的标记RNA底物。或者，可在添加RNase抑制剂、DTT和tRNA之后，将RNA包含在主混合液1中。 注意： 使用 <5 nM 标记的RNA底物
    6. 轻轻涡旋并短暂离心每个样品以去除气泡。在30 °C孵育最多2小时，但为获得最佳结果，应进行时间进程实验。过长的孵育时间可能会增加背景降解。
  3. 蛋白酶K消化与纯化
    1. 从热源中取出样品，向每个反应体系中加入182.5 μl ETS终止液。再加入5 μl浓度为20 mg/ml的蛋白酶K，37 °C孵育10分钟。
    2. 加入1体积（200 μl）酸性苯酚-氯仿，再加入1/10th 3 M 醋酸钠 20 μl 和 20 mg/ml 甘油 1 μl。按照第2节所述步骤进行提取 3.4.9-3.4.14.
    3. RNA提取完成后，务必去除所有残留的EtOH。将沉淀重悬于8 μl上样缓冲液（90%甲酰胺，10 mM EDTA，含溴酚蓝（BFB）（和/或二甲苯蓝））中。样品可保存于-80 °C，或直接进行凝胶电泳。
  4. 切割反应电泳
    1. 按照前文所述步骤制备6%丙烯酰胺凝胶 3.3.1-3.3.17 进行少量修改。使用 20 cm × 42 cm 的测序凝胶板，每条长边用 2 个夹子固定。使用 32 孔梳子，制备 40 ml 凝胶混合液。
    2. 上样：每孔加入3 μl的Marker和5 μl的各样品。根据前体片段和切割产物的大小优化电泳条件。
    3. 电泳完成后，按照以下章节操作 3.4.1-3.4.3 拆卸凝胶时，不要使用塑料保鲜膜，而是裁剪一张与凝胶板大小相同的滤纸，小心地覆盖在暴露的凝胶一侧。
    4. 将滤纸用力按压在凝胶上，然后翻转玻板，使滤纸朝下，玻璃朝上。用力将玻璃压在桌面上，确保凝胶均匀地贴附在滤纸表面。
    5. 从短边一端缓慢剥离滤纸（滤纸上应附有凝胶），直至将带有凝胶的滤纸完全从玻璃板上取下。
    6. 用塑料膜覆盖暴露的凝胶面，将塑料膜用胶带固定在滤纸上。
    7. 将凝胶置于凝胶干燥器上，滤膜面朝向真空侧。干燥15分钟，或直至凝胶完全干燥。
      注意： 若无凝胶干燥仪，可使用X射线胶片显影RNA条带。曝光应在避光暗盒中加入增感屏并于-80 °C条件下进行。曝光时间需通过实验确定。注意：低浓度丙烯酰胺凝胶在冷冻时可能破裂。
    8. 凝胶现在可用于曝光胶片或与磷屏成像仪配合使用。曝光时间取决于标记RNA的强度。初次曝光可采用24小时。若使用胶片，需在-80 °C条件下配合增感屏曝光，并让其自然升温至室温 室温 在发育之前。
    9. 测量每个样本中切割与未切割RNA的比值，以定量分析切割效率。

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结果

HIV-1 RNA 多聚腺苷酸化位点（poly(A) 位点）切割实验的代表性结果（图 2）。可以看到未切割的 RNA 底物，其为凝胶中迁移最慢、位于最上方的条带。特异性切割产物为强度最高的较短片段条带，其在凝胶中的迁移速度较快，大小符合预期，并且在含有 polyA 序列点突变（mutPolyA）RNA 底物的突变对照（mutpoly(A)）切割实验中特异性缺失。有时也可观察到输入底物的降解产物。切割活性的定量可通过密度分析图确定，即以未切割 RNA 为 100% 进行归一化处理后，计算未切割与切割 RNA 条带的比值。

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讨论

在HeLa细胞核提取物中或使用从这些提取物中分离的切割因子进行的体外前体mRNA 3’端切割反应，已使得核心切割因子及其主要复合物得以鉴定16-21。近年来又发现了许多与这些因子相关的蛋白质22，而体外反应仍有望进一步揭示这些蛋白质在反应中的作用机制。可能由于该反应在体内似乎是共转录进行的23，或由于某些参与因子在提取和透析过程中可能丢失，该反应效率通常较低，很少能达到30%以上的切割率。此外，反应效率可能在不同天之间无明显原因地突然下降。因此，明确哪些步骤最为关键至关重要，尤其是在尝试将该反应体系应用于经修饰或病毒感染的HeLa细胞、其他细胞类型或新型底物时。

毫无疑问，提取物的质量和新鲜度 体外 转录的RNA至关重要，因此必须在严格无RNase的条件下操作。细胞在收获提取时的健康状态同样重要。细胞应呈现良好的生长状态，倍增时间应少于24小时，处于或接近对数生长期，且死亡细胞或其他无法解释的碎片应极少。显然，细胞不应受到支原体或其他细菌的污染。...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

S.V. 感谢美国国立卫生研究院（NIH K22AI077353）和兰登贝格基金会提供的经费支持。K.R. 感谢美国国立卫生研究院（5SC1GM083754）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 L Celstir 摇瓶Wheaton356884提供不同规格
四位置低速搅拌器VWR12621-076
摆动桶式离心机Beckman CoulterAllegra x-15R 配 SX4500 转子
超速离心机Beckman CoulterOptima L-100 XP Ultra 配 SW41 转子
台式离心机 5417REppendorf带制冷功能
Thermomixer 恒温混匀仪Eppendorf
250 ml 锥形离心管Corning430776
50 ml 锥形离心管BD Falcon352098
Ultraclear 超速离心管Beckman Coulter344059
JOKLIK 改良 MEM 培养基Lonza04-719Q
胎牛血清AtlasF-0500-A经热灭活处理
L-谷氨酰胺:青霉素:链霉素Gemini Bio-Products400-110
1 M Tris-HCl pH 8.0Mediatech46-031-CM
氯化镁FisherBP214-500
氯化钾MP Biomedicals194844
HEPESFisherBP310-500
DTTAlexis Biomedicals280-001-G-010
甘油FisherBP229-4
5 M 氯化钠溶液Mediatech46-032-CV
EDTA 0.5 M 溶液Sigma-AldrichE7889-100ml
EDTAFisherBP120-500
PMSFThermo Scientific36978
硫酸铵FisherA702-500
Complete 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合片剂Roche04 693 132 001
Slide-A-Lyzer 透析盒套装Thermo Scientific66372截留分子量 7,000，容量 0.5 ml–3 ml
15 ml Dounce 组织研磨器套装Sigma-AldrichD9938-1SET提供不同规格
Expand 高保真 PCR 试剂盒Roche11 732 650 001
10 mM dNTP 混合液InvitrogenY02256每种核苷酸浓度为 10 mM
MaxiScript SP6/T7 体外转录试剂盒AmbionAM1322
m7G(5')ppp(5')G RNA 帽结构New England BiolabsS1404S
Century Marker Template PlusAmbionAM7782
Easytides UTP [α-32P] 250 μCiPerkin ElmerBLU507H250UC
上样缓冲液 IIAmbion8546G
DEPC 处理水AmbionAM9906
10x TAE 缓冲液FisherBP13354
10x TBE 缓冲液Ameresco Life Sciences0658-4L
10x PBS 缓冲液FisherBP399-20
尿素FisherBP169-212
过硫酸铵Bio-Rad161-0700
TEMEDFisherBP150-20
乙酸铵FisherA637-500
40% 19:1 丙烯酰胺:双丙烯酰胺Bio-Rad161-0144
糖原Roche10 901 393 001
100% 绝对乙醇（200 proof）Acros61509-0040
酸性酚:氯仿Ambion9720适用于 RNA 提取
闪烁液FisherSX18-4
RNase 抑制剂PromegaN261B
聚乙烯醇 - PVASigma-AldrichP8136-250G
磷酸肌酸Calbiochem2380
100 mM dATPFisherBP2560-4
SDSAcros23042-5000
蛋白酶 KFisherBP1700-100
可调节测序装置Sigma-AldrichZ351881-1EA
文件夹夹Office Depot838-056
20 cm x 42 cm 玻璃板Sigma-AldrichZ3525431 套
20 cm x 22 cm 玻璃板Sigma-AldrichZ35252-71 套
20 cm x 42 cm 铝制冷却板Sigma-AldrichZ3526671 件
0.4 mm x 22 cm 间隔条Sigma-AldrichZ35230-61 套
0.4 mm x 42 cm 间隔条Sigma-AldrichZ352314-11 套
8 孔梳Sigma-AldrichZ35195-41 件
16 孔梳Sigma-AldrichZ3519621 件
32 孔梳Sigma-AldrichZ3519701 件
防粘胶涂层剂C.B.S. ScientificSGR-0401或 SGR-0101（单瓶装）
凝胶上样枪头RaininGT-10-40.1–10 μl
Sequencing PowerPac HV 电泳电源Bio-RadPowerPac HV5,000 V/500 mA/400 W
Gel Dryer Model 583 凝胶干燥仪Bio-RadModel 583
凝胶干燥仪用 Hydrotech 真空泵Bio-Rad
Glogos II 夜光标记物Agilent420201
8 x 10 尺寸胶片MidsciBX810
14 x 17 尺寸胶片PhenixF-BX1417
放射自显影暗盒FisherFBCA 1417提供 8 x 10 尺寸

参考文献

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