我们提供了一种详细的方案，用于在海马CA1区诱导长时程增强效应，并随后从已强化的脑片区域分离出核富集组分。该方法可用于在学习与记忆的细胞模型中确定活动依赖性的核蛋白入核过程。
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摘要
摘要
研究活性依赖性蛋白表达、亚细胞转位或磷酸化对于理解突触可塑性的细胞机制至关重要。在急性海马脑片中诱导的长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）被广泛接受为学习与记忆的细胞模型。已有大量研究采用活细胞成像或免疫组织化学方法来观察活性依赖性蛋白动态变化。然而，这些方法依赖于适用于免疫细胞化学的抗体，或在单个神经元中过表达荧光标记蛋白。蛋白质免疫印迹是一种可独立验证上述发现的替代方法。 从单个强直刺激的海马脑片制备亚细胞组分时，第一个限制因素是材料量过少；第二个关键因素是操作过程，因为即使对活体脑片进行极短暂或轻微的操作，也可能激活某些信号通路。本文中，我们描述了一种优化的工作流程，旨在从大鼠脑急性海马脑片的CA1区获得足够纯度且数量充足的核富集组分。作为代表性示例，我们显示：突触-核蛋白信使Jacob的ERK1/2磷酸化形式在LTP诱导后会主动转位至细胞核，并可在CA1神经元的核富集组分中被检测到。
引言
突触N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDARs）在突触可塑性和细胞存活信号传导中发挥关键作用，而突触外NMDARs的激活则可能引发神经退行性变和细胞死亡。这些变化依赖于严格调控的、由活动依赖的基因表达，因此需要被激活的突触或树突与细胞核之间持续进行通讯7。MAP激酶ERK1/2是突触NMDAR信号通路的下游效应分子，参与由NMDAR激活诱导的基因表达；而通过突触外NMDAR的信号传导则对ERK1/2活性无影响或具有抑制作用8,11。
已有多种蛋白质被证实可在远端树突与细胞核之间穿梭。这些蛋白质中的许多含有核定位信号，并以动力蛋白（dynein）和输入蛋白（importin）依赖的方式沿微管主动运输至细胞核6,9。有趣的是，其中一些信号蛋白仅在特定突触刺激下才会转运至细胞核。例如，环磷酸腺苷反应元件结合蛋白2（CREB2）的逆行运输可由化学性长时程抑制（LTD）诱导，但不会由长时程增强（LTP）诱导12。局部的、NMDA受体依赖性突触刺激可驱动CREB调控的转录共激活因子（CRTC1）进入细胞核，该易位过程参与海马长期可塑性4。最近研究表明，蛋白信号分子Jacob在突触和突触外NMDAR激活后均可转位至细胞核，并调控CREB依赖性基因转录5。信号来源于突触或突触外的信息由Jacob的翻译后修饰编码。突触活动可诱导ERK1/2依赖性的Jacob在第180位丝氨酸（pJacobS 180）发生磷酸化，这是其在原代海马神经元培养中后续转位至细胞核所必需的条件。此外，在急性海马脑片CA1区神经元中，pJacobS 180可在Schaffer侧支介导的LTP后转入细胞核，但在LTD后则不会1,10。pS180 Jacob可导致与可塑性相关基因的表达增加，而该基因表达又反馈调节突触功能。与此形成鲜明对比的是，由突触外NMDAR激活后转入细胞核的Jacob在Ser180位点未发生磷酸化，可能在细胞核内形成不同的蛋白复合物，导致“CREB关闭”以及突触连接的回缩10。
大多数关于突触-核蛋白信使核转运的研究均在分离的神经元原代培养物中进行。因此，若能在生理条件更接近真实情况的海马脑片（神经元连接性和功能保存更完整）中重现这些发现，将具有重要意义。本文介绍了一种通过免疫印迹法检测长时程增强（LTP）依赖性蛋白信使核转位的优化方案。该方法同样适用于分析粗核组分中蛋白质的活动依赖性磷酸化。具体而言，本方案包括急性CA1区海马脑片的制备、LTP的诱导与记录。随后，在显微镜下对CA1区进行显微解剖，以分离受刺激区域。我们结合并改进了CellLytic NuCLEAR Extraction Kit提供的核提取方案，并引入了Zhao及其同事17所提出的一些修改。优化后的步骤包括在低渗缓冲液中裂解解剖所得的CA1区组织，使细胞膨胀并释放细胞核。可通过显微镜检查确定细胞裂解情况和细胞核形态。通过短暂离心步骤实现细胞核的富集。使用针对NeuN和NSE2的抗体进行免疫印迹分析，这两种蛋白分别为核组分和胞质组分的特异性标志物，结果表明，该方法可作为快速且可重复的方案，用于分离这些亚细胞组分，并研究如蛋白质磷酸化等高度不稳定的翻译后修饰。此外，该方法特别适用于源自海马脑片CA1区解剖组织的小量样本，且可与海马脑片的免疫组织化学染色联合使用。
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方案
1. 成年大鼠脑急性海马切片的制备
- 用异氟烷麻醉大鼠。注意：操作时应使用密闭的麻醉容器，避免吸入异氟烷。确保动物已完全麻醉。
- 将大鼠断头，迅速取出脑组织，并将其浸入预先通入混合气体（95% O2 / 5% CO2）的冰冻格氏溶液中，持续30分钟1,2,10,16（溶液成分，单位为 mM：130 NaCl，4.9 KCl，1.5 CaCl2·2H2O，0.3 MgSO4·2H2O，11 MgCl2·6H2O，0.23 KH2PO4，0.8 Na2HPO4·7H2O，5 Glucose·H2O，25 HEPES，22 NaHCO3，pH 7.32）。
- 去除小脑及部分内嗅皮层。沿中线矢状面切开分离两侧大脑半球，然后将每侧半球内侧面朝下放置。随后沿每侧半球背侧边缘进行50–70°的斜切（50–70°横切）13,14。
- 将每侧脑半球的新鲜切面朝下，用胶固定在切片系统的切片平台上。平台表面应覆盖预先通入混合气体的冰冻格氏溶液。
- 使用振动切片机，从前向后方向切割350 μm厚、50–70°的横切脑片，调节切片机以最小化Z轴振荡。所获得的脑片将包含海马结构、下托皮层、内嗅皮层以及位于海马背外侧的皮层区域，用于后续实验13,14。
- 将海马脑片转移至U型浸没式孵育槽中，在32 °C条件下，用通入混合气体的人工脑脊液（ACSF，成分单位为 mM：110 NaCl，2.5 KCl，2.5 CaCl2·2H2O，1.5 MgSO4·2H2O，1.24 KH2PO4，10 Glucose·H2O，27.4 NaHCO3，pH 7.3）孵育至少2小时1,2,10,16。
2. 电极定位、基线记录和LTP诱导
- 将海马脑片转移至显微镜下安装的浸没式记录室中，以含碳合气的人工脑脊液（ACSF）以每分钟6–7毫升的速度灌流，温度维持在32 °C，至少孵育30分钟。
- 制备充满人工脑脊液（ACSF）的玻璃毛细管微电极（尖端电阻为3–5 MΩ）。
- 将一根充满ACSF的玻璃微电极置于CA1区Schaffer侧支纤维用于刺激，另一根置于CA1区辐射层用于记录场兴奋性突触后电位（fEPSP）1,2,10 （图 2）。两根电极之间的距离应约为300 μm。
- 通过双相矩形电流脉冲（每相200毫秒）刺激Schaffer侧支纤维，电压范围为3–4 V，以诱发场兴奋性突触后电位（fEPSP）。
- 通过测量输入-输出关系进行最大刺激测试，将刺激强度设定为所获最大fEPSP斜率值的40%，并在整个实验过程中保持该强度不变。
- 在完成最大刺激测试后，开始至少15分钟的基线记录。在整个实验过程中，每分钟测量一次测试刺激的反应。基线记录期间采用低频刺激。
- 基线记录至少持续30分钟。
- 为诱导晚期长时程增强（Late-LTP），采用高频强直刺激：以100 Hz频率施加3组持续1秒的刺激串，组间间隔5分钟。为扩大CA1区的刺激范围，可在强直刺激前2分钟灌流5 μM荷包牡丹碱（bicuculline），并在最后一次强直刺激结束后立即洗脱 。
3. LTP 诱导后脑片的收集与速冻
- 在给予三串强直刺激诱导晚期长时程增强（Late-LTP）后2分钟或30分钟，停止LTP记录。
- 移除电极，迅速将脑片转移至置于干冰上的预冷金属平台。对保留在U形孵育器中的对照脑片重复此操作。注意：操作干冰时需佩戴手套。
- 将每片脑片收集至1.5 ml离心管中，并于-80 °C保存。
4. 从海马体CA1区分离核富集组分
- 取1.5 ml离心管，内含来自-80 °C的冷冻脑片，置于冰上保存。
- 向管中加入0.5 ml新鲜冷的含蛋白酶抑制剂（PI）和磷酸酶抑制剂（PS）的TBS缓冲液。孵育2–3分钟，然后转移至体视显微镜下操作。注意：使用PI和PS时需佩戴防护手套和实验服。
- 使用两根细针在体视显微镜下解剖海马CA1区的锥体细胞层。一根针用于固定脑片，另一根针用于切割CA1区域。
- 将5个脑片（每组）中解剖出的CA1区组织收集到一个新的1.5 ml离心管中，管内预先加入50 μl裂解缓冲液（1x低渗裂解缓冲液，成分（mM）：10 HEPES、1.5 MgCl2、10 KCl，pH 7.9，含PI和PS）。注意：此量的样品足以进行2–3次免疫印迹实验。
- 通过轻柔吹打对收集的组织进行匀浆。使用200 μl 移液器。将裂解液置于冰上孵育5–7分钟，使细胞充分肿胀。
- 取2 μl裂解液滴加至载玻片上，在明场显微镜下观察细胞肿胀情况。当细胞充分肿胀时，细胞核呈现为圆形且完整的结构。
- 取20 μl样品转移至新的1.5 ml离心管中作为“匀浆组分”，加入8 μl变性4x SDS上样缓冲液。
- 将剩余裂解液在11,000 rpm 下离心1分钟。
- 小心吸取上清液（“胞质组分”），转移至新管，并加入20 μl 4x上样缓冲液。
- 将沉淀重悬于60 μl低渗缓冲液中，并加入20 μl 4x上样缓冲液。此组分称为“核富集组分”。
- 匀浆组分、胞质组分和核富集组分可于-20 °C或-80 °C保存，用于后续免疫印迹分析。
5. 突触-核蛋白的半定量免疫印迹
- 将样品解冻，并在 95 °C 下煮沸 5 分钟。
- 从每种组分中取 5 µl，通过氨基黑检测法或 BCA 检测法测定蛋白质浓度。
- 将来自匀浆液、胞质组分和核富集组分的等量蛋白质样品上样至 SDS-PAGE。对照组和 LTP 切片的样品应加载在同一块凝胶上，以便进行直接比较。
- 按照标准的 Western 印迹程序操作（推荐使用湿法转膜）。
- 使用目标抗体孵育膜。随后，可对同一印迹膜（或平行运行的相同样品）使用细胞质标志物——神经元特异性烯醇化酶2（NSE2）、核标志物——NeuN 以及 α-actin 抗体作为上样对照进行检测。
6. 数据分析
- 通过 Clampfit 软件分析 LTP 诱导的效率。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）比较基础记录的平均斜率与强直刺激后的斜率，当 p <0.05 时认为差异具有显著性。fEPSP 斜率值在图中表示为均值 ± 标准误（S.E.M.）。
- 对于免疫印迹结果的定量，可扫描放射自显影胶片并使用 ImageJ 分析蛋白条带的积分密度，或使用 Licor 系统分析荧光条带。免疫反应条带的数值应根据上样量和转膜对照进行归一化处理。在比较对照组与 LTP 组时，可采用非参数的 Mann-Whitney U 检验。
| 缓冲液名称 | 试剂 | 浓度 (mM) | 用量 | 备注/说明 |
| Gey’s 溶液 (pH: 7.3~7.4) | NaCl | 130 | 7.6 g | 无菌过滤 |
| 1,000 ml | KCl | 4.9 | 0.37 g | |
| CaCl2·2H2O | 1.5 | 0.22 g | ||
| MgSO4·2H2O | 0.3 | 0.0739 g | ||
| MgCl2·6H2O | 11 | 2.24 g | ||
| KH2PO4 | 0.23 | 0.0313 g | ||
| Na2HPO4·7H2O | 0.8 | 0.2145 g | ||
| Glucose·H2O | 5 | 0.9909 g | ||
| HEPES | 25 | 5.96 g | ||
| NaHCO3 | 22 | 1.85 g | ||
| ACSF (pH: 7.3~7.4) | NaCl | 110 | 6.428 g | 无菌过滤 |
| 1,000 ml | KCl | 2.5 | 0.1865 g | |
| CaCl2·2H2O | 2.5 | 0.368 g | ||
| MgSO4·2H2O | 1.5 | 0.370 g | ||
| KH2PO4 | 1.24 | 0.169 g | ||
| Glucose·H2O | 10 | 1.9817 g | ||
| NaHCO3 | 27.4 | 2.3 g | ||
| 1x 低渗缓冲液 (pH: 7.9) | HEPES | 10 | 0.23 g | |
| 100 ml | MgCl2·6H2O | 1.5 | 0.0304 g | |
| KCl | 10 | 0.07455 g |
表1. 缓冲液。
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结果
我们先前已证明，突触-核蛋白信使Jacob在诱导LTP后会在细胞核中积累，但在诱导LTD时则不会1。此外，突触刺激后Jacob的转位需要MAPK ERK1/2的激活以及Jacob在Ser180位点的磷酸化（图1）。磷酸化的Jacob以依赖importin的方式转入细胞核，并可通过与中间丝蛋白αinternexin结合而长期维持其磷酸化状态15（图1）。Jacob的磷酸化状态对于依赖性神经元活动基因的表达及细胞存活具有重要意义。有趣的是，突触外NMDAR的激活同样可驱动Jacob进入细胞核，但在此情况下，Jacob在Ser180位点未被磷酸化，其在核内的积累会导致CREB的“关闭”效应5,10。上述结果来源于我们近期研究中建立的实验方案（详见Karpova et al.10 对该模型的详细描述）。
为了证明Jacob在LTP诱导后转位至细胞核，我们在急性海马脑片中诱导并测量了Schaffer侧支fEPSP的长时程...
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讨论
上述方案中描述的步骤提供了如何制备幼年或成年大鼠海马急性脑片、诱导并记录长时程增强（LTP）、快速分离脑片中受刺激区域，并制备富含细胞核的组分以研究活动依赖性蛋白质动态变化的指导。该方法源于多种原本独立使用的技术的结合。我们优化了工作流程，并提供了充分的细节，使初学者能够建立自己的实验体系，用于研究LTP诱导后蛋白质的亚细胞重新分布。作为一个示例，我们证明了LTP的晚期形式可诱导S180磷酸化的Jacob蛋白在细胞核内积聚。为了区分特定蛋白质预先存在的核内池的磷酸化与突触活动后其磷酸化形式的转位，该方法可结合对富含核组分中目标蛋白质总量的对照检测。此外，在LTP诱导后的不同时间点检测样品，对于研究蛋白质激活/失活或核内 turnover 的时间进程可能具有重要意义。
在制备经刺激脑片的核富集组分时，存在若干需要解决的方法学问题。首先，为了增加CA1区被激活的神经元数量以及免疫印迹实验所需的材料量，我们在强直刺激过程中加入5 µM的GABAA受体阻断剂bicuculline。研究表明，bicuculline可增强兴奋性突触后电位3。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德国研究基金会（DFG）（SFB 779 TPB8，Kr1879/3-1 MRK）、DIP 基金（MRK）、欧盟第七框架计划多学科合作培训网络（EU FP7 MC-ITN NPlast）（MRK）、行为脑科学中心（CBBS，萨克森-安哈尔特州）（AK 和 SB）资助。MM 获得欧洲分子生物学组织（EMBO）长期研究员奖学金（EMBO ALTF 884-2011）和玛丽·居里国际职业发展奖学金（Marie-Curie IEF）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器 | |||
| CED 1401 AD/DA 转换器 | Cambridge Electronics Design，英国 | ||
| 体视显微镜 | Leica S4E，德国 | ||
| 振动切片机 | Leica VT1000S，德国 | ||
| 独立脉冲刺激器 | A-M Systems，美国 | 型号 2100 | |
| 离心机 | Thermo Scientific | ||
| SDS-PAGE 系统 | Biorad | ||
| 冷却器 | Julabo | ||
| 明场显微镜 | Nikon Eclipse TS100 | ||
| 细胞培养箱 | Thermo Electron Corporation | ||
| 显微操作器 | Luigs & Neumann，SM-5，德国 | ||
| 转印槽及电源 | Hoefer Scientific Instruments，加利福尼亚州旧金山 | ||
| 浸没式记录槽 | 定制 | ||
| U 形及浸没式孵育槽 | 定制 | ||
| 小型手术剪刀 | |||
| 手术刀 | |||
| 细刮勺 | |||
| 塑料移液管 | |||
| 塑料培养皿 | |||
| 烧杯 | |||
| 注射器 | |||
| 试剂 | |||
| NaCl | Roth | 货号 3957.1 | ≥99.5%，分析纯，ACS，ISO |
| KCl | Roth | 货号 6781.1 | ≥99.5%，分析纯，ACS，ISO |
| CaCl2·2H2O | Merck | 1.02382.0500 | 分析纯 |
| MgSO4·2H2O | Merck | 5886.05 | 分析纯 |
| MgCl2·6H2O | AppliChem | CAS号：7791-18-6；EC号：2320946 | 分子生物学级 |
| KH2PO4 | Merck | 12034.025 | 分子生物学级 |
| Na2HPO4·2H2O | Merck | 1.06574.1000 | 特优纯 |
| 葡萄糖·H2O | Roth | 货号 6887.1 | 分子生物学级 |
| HEPES | Roth | 货号 9105.4 | 缓冲剂，≥99.5%，分析纯 |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.1000 | 分析纯 |
| 蛋白酶抑制剂混合液 | Roche | ||
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | ||
| 荷包牡丹碱 | Tocris Bioscience | ||
| 异氟烷 | Baxter | ||
| 抗体 | |||
| 一抗 | 公司 | 货号 | 种属 |
| pJac-s180 | Biogenes | 兔源（1:100 稀释） | |
| NeuN | Milipore | MAB377 | 鼠源（1:1,000 稀释） |
| NSE | Cell Signaling | D20H2 | 兔源（1:1,000 稀释） |
| β-肌动蛋白 | Sigma | A-5441 | 鼠源（1:5,000 稀释） |
| 二抗 | 公司 | 货号 | 种属 |
| HRP 标记的 IgG | DAKO | 山羊抗小鼠（1:5,000） | |
| HRP 标记的 IgG | NEB | 山羊抗兔（1:5,000） |
参考文献
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