基于原子力显微镜的细胞壁弹性特性图谱：组织、细胞及亚细胞分辨率

摘要

我们描述了一种利用原子力显微镜（AFM）绘制植物组织机械特性的方法。重点介绍如何在宽场介观尺度上记录植物发育过程中细胞壁发生的机械性变化，从而将这些变化与生长及形态发生过程相关联。

摘要

我们介绍一种最近开发的方法，利用原子力显微镜（AFM）进行微/纳米压痕，以测量植物组织表面的力学性质，适用于JPK AFM。具体而言，在本实验方案中，我们在花分生组织、下胚轴和根部的区域上，以亚细胞分辨率测量细胞壁的表观杨氏模量，检测范围可达100 µm × 100 µm。该方法需要对样品进行精细制备，并正确选择微压头及压痕深度。为仅反映细胞壁的性质，测量需在高浓度甘露醇溶液中进行，以诱导细胞质壁分离，从而消除细胞膨压的贡献。

与其他现有技术相比，该方法通过使用不同的压头和压痕深度，可实现多尺度的同步测量， 即 在亚细胞分辨率下，对构成组织的数百个细胞进行观察。这意味着现在已有可能 在发育过程中对细胞壁力学性质的变化进行时空表征，从而将这些变化与细胞生长和分化相关联。这是理解协调性的微观细胞变化如何引发宏观形态发生事件的关键步骤。

然而，该方法仍存在一些局限性：仅适用于较小的样品（直径约100 µm），且仅限于外部组织；该方法对组织表面形貌较为敏感；且仅能测量组织复杂力学性能的某些方面。目前该技术正在快速发展，预计在不久的将来，这些局限性中的大部分将得到解决。

引言

植物的生长依赖于构成生物体每个细胞外围的刚性细胞壁的协调扩张。越来越多的证据表明，植物通过调控细胞壁化学性质来局部控制这种扩张。这种扩张被认为主要由细胞的高膨压对细胞壁施加的张力所驱动；而细胞壁的力学特性决定了其对膨压的应变响应¹。目前对这些力学特性及其在发育过程中如何变化仍知之甚少。此外，这些力学特性是如何被调控的，以及是否存在反馈机制参与调节细胞壁化学性质，从而在组织水平上实现协调变化，目前也尚不清楚。要理解植物发育过程中细胞壁化学变化与力学变化之间的关联，以及这些微观层面的相互作用最终如何决定植物宏观生长，就需要一种能够在器官发育过程中以细胞或组织尺度监测细胞壁力学特性的方法。

原子力显微镜（AFM）方法通过微米或纳米级的组织压缩或压痕，专为在亚细胞分辨率下同时测量发育器官中细胞壁的力学特性，并覆盖整个组织区域而开发。其他方法的分辨率则或过低或过高：伸长计仅能测量毫米尺度下整个组织的平均力学特性 比例尺^2-4，该尺度对于测量器官发生早期事件而言过大；微压痕仪可在纳米级实现亚细胞分辨率的测量 但其仅限于测量单个细胞，无法用于细胞群体或器官的测量^5-7利用原子力显微镜（AFM），可实现所需的组织、细胞及亚细胞水平分辨率。^8-10。最近已有几项实验方案被 专门开发用于测量植物组织力学特性，也可用于其他用途^11,12.

我们将在此介绍如何通过测量表观杨氏模量来评估组织的弹性¹³。

杨氏模量通常用于描述材料的刚度。在小变形情况下，使材料发生变形所需的力与压痕面积成正比。该比例系数即为杨氏模量。对于连续且均匀的材料而言，无论压痕类型（尺寸和形状）如何，测得的系数相同，但会随测量速度的变化而改变。然而，在植物组织这种复杂结构中，我们迄今观察到的是，作用力与变形量成正比，由此可确定一个比例系数，我们称之为“表观杨氏模量”。与连续介质不同，植物组织的表观杨氏模量对压痕尺寸敏感。它并不等同于纯细胞壁的杨氏模量，而是更准确地描述了组织细胞壁支架结构的弹性特性。

方案

1. 准备用于封片的载玻片

1. 制备包埋琼脂糖培养基：将0.7%低熔点琼脂糖溶于10%甘露醇水溶液中。
2. 使用坚固的金属工具（例如钻头、凿子），在显微镜玻片中央刻出一个0.5 × 0.5 cm的区域。或者，也可使用Araldite胶将一小片玻璃盖片 （约20 × 200 µm） 粘附到玻片表面 上 。注意：此步骤可使表面粗糙，有助于琼脂糖附着，确保琼脂糖培养基牢固固定在玻片上。该玻片可重复使用。
3. 在玻片的刻痕区域滴加约20 µl 包埋琼脂糖培养基，形成一层薄薄的琼脂糖膜。
4. 将玻片置于湿盒中，静置直至琼脂糖培养基完全凝固。

2. 分生组织样品的解剖与装片

1. 显微解剖分生组织用于共聚焦成像：使用超细镊子从茎上逐个向下拉取去除花芽。重要的是要彻底去除花芽，直至去除到不具萼片的花芽为止即 P1原基¹⁴).
2. 使用剃刀刀片或镊子尖端，将分生组织从茎上切下。切割面应与原子力显微镜（AFM）拟测量的分生组织表面区域平行。所获得的顶端组织高度应在300 µm至600 µm之间，以适配AFM探针下方的空间。
3. 将茎尖插入在步骤1.1.4中制备的琼脂糖培养基薄膜中。在载玻片/琼脂糖上选择一个位置，轻轻按压，使分生组织既直接接触载玻片，又从琼脂糖中突出。在从茎部切下分生组织后的数秒内将其置于琼脂糖中至关重要。注意：这是为了防止分生组织干燥。此时，由于施加压力导致琼脂糖破裂，分生组织将位于一条裂隙中。
4. 以相同高度将多个分生组织按此方法制备，用于批量成像，且确保它们在载玻片上的间距小于500 µm。在继续解剖其他样品时，将已制备的分生组织保存于湿润盒中。
   注意：该步骤可限制校准带来的变异。理想情况下，每种条件可制备两个样本，并随机进行测量。迄今为止，尚未观察到批次成像对测量结果产生影响（如应激诱导反应）。这可能是由于琼脂和/或封片溶液中应激信号分子被稀释所致；或者无论样本制备量多少，应激反应本身保持一致。
5. 在进入下一步之前，确保分生组织与花芽之间的边界已干燥。如有必要，用滤纸轻轻吸去多余水分。此举可防止在下一阶段因毛细作用导致熔化的琼脂糖淹没样品。
6. 20 µl 移液器，加入足量融化的封固用琼脂糖，填满步骤1.2.3中形成的裂隙，并包围每个分生组织。琼脂糖应达到已去除花芽（原基）后留下的疤痕水平。为达到此效果，可能需要在裂隙两端分别添加琼脂糖。
7. 当加入琼脂糖时，其会迅速渗入裂隙中；使用移液器吸去部分熔化的封片琼脂糖，以确保分生组织成为载玻片上的最高点。此操作可固定分生组织，使其在成像过程中不会移动。

3. 根或下胚轴样品的封片

1. 对于根和下胚轴，无需进行解剖。在已制备的载玻片上薄层琼脂糖中，于玻璃刻痕正上方或沿玻璃片边缘处切出一条沟槽。将根或下胚轴置于该沟槽中，确保其全长与玻璃表面充分接触。
2. 在进入下一步之前，确保样品表面干燥。若存在多余水分，可用滤纸轻轻吸除。
3. 围绕样品加入熔化的封片用琼脂糖，操作同步骤 1.2.6。

4. 原子力显微镜准备与灵敏度校准（适用于 JPK Nanowizard 原子力显微镜）

1. 将悬臂梁安装到原子力显微镜（AFM）上。悬臂梁应配备球形压头。压头的半径将决定x, y, z 方向的分辨率以及可实现精确测量的压痕深度。
   1. 若需在表皮表面进行介观—纳米尺度测量，请使用半径为50 nm的球形压头；若进行介观尺度测量，请使用半径为0.5 µm的球形压头；若进行微米尺度测量（跨越2-3个细胞），请使用半径为2.5 µm的球形压头。
2. 将激光对准悬臂梁的尖端。使用反射镜将激光对齐至探测器的中心位置。
3. 在AFM下方放置一块洁净的玻璃。
   注意：以下步骤旨在将激光在AFM探测器上的位置信号转换为悬臂梁的形变量，并通过评估悬臂梁的弹簧常数，进一步将其转换为作用力。
4. 以目标力“设定点”为1 V进行接近。
5. 选择“力谱模式”。通过将最大“相对设定点”设为2 V、“伸出速度”设为40 µm/sec、“z长度”设为5 µm，执行一次压痕操作。
6. 在“校准管理器”菜单中，使用“选择拟合范围”按钮选取前向曲线的线性部分，以拟合灵敏度。应将“相对设定点”从“伏特（volt）”转换为“米（meter）”。
7. 在“校准管理器”菜单中，选择“弹簧常数”，利用热波动法评估悬臂梁的弹性。点击“运行”以获得悬臂梁的频谱密度图。找到频率最低的共振峰，并使用“选择拟合范围”按钮对其进行拟合。
   注意1：有关热波动调谐的更多细节，请参阅Cook et al.¹⁵
   注意2：建议使用直接方法，通过参考悬臂梁（或已知刚度的材料）来评估悬臂梁的弹性。本实验所用参考悬臂梁由Atef Asnacios惠赠¹⁶。
8. 在悬臂梁尖端下方加入200 µl 10%的甘露醇溶液。使用反射镜重新将激光对齐至探测器的中心位置。
9. 重新校准灵敏度：在“校准管理器”菜单中点击“未知”按钮；重复步骤2.3至2.5。

5. 数据采集：表观杨氏模量图谱

1. 将固定好的样品置于原子力显微镜（AFM）下，并加入 500 µl 在样品上滴加一滴10%甘露醇溶液。该甘露醇溶液可在数分钟内使细胞发生质壁分离。
2. 以20 nN的目标力（“设定点”不应超过3 V）进行操作
3. 使用 200 nN 的“相对设定点”、40 µm/sec 的“伸展速度”以及“z”进行压痕 5 µm的长度
4. 调整“相对设定点”，使200 nm固定悬臂梁产生100 nm的压痕，或使1 µm/5 µm固定悬臂梁产生0.5 µm的压痕。
5. 在“力映射”模式下，选择扫描区域：对于分生组织，选择 70 µm x 70 µm，分辨率为64 x 64像素；对于下胚轴和根，为100 µm 100 µm，分辨率为 64 × 64。
6. 按扫描键以启动实验。保存输出结果。

6. 数据分析：表观杨氏模量计算

1. 在数据分析软件中打开数据文件。
2. 选择“批量处理”以对单幅图的所有曲线应用相同的分析。
3. 选择“校正悬臂弯曲引起的高度变化”，以提取压痕深度。
4. 选择“杨氏模量拟合函数”，该函数假设力与压痕面积成正比。将“探针形状”设置为抛物线形，以假设压痕形状为抛物线形。
5. 输入探针的半径。
6. 优先选择“ retract”曲线进行分析，因其对表面形貌的敏感性低于“extend”曲线。然而，若在“retract”过程中探针发生明显粘附，则应使用对粘附不敏感的“extend”曲线。
7. 将泊松比设为 0.5。点击分析并保存结果。

结果

在图1中，我们展示了花分生组织（图1A和图1B）、幼嫩与成熟下胚轴（图1C-F）以及根尖分生组织（图1G和图1H）典型的杨氏模量图谱。所有实验中均使用半球形压头，但其半径不同，以实现不同的空间分辨率。图1C和图1D展示了中-纳米尺度压头（50 nm半径）进行中-纳米尺度压入（50 nm深度）的典型结果；这些图谱揭示了下胚轴表皮细胞表面细胞壁的微米级异质性。图1A、1E和1G展示了中尺度压头（500 nm半径）进行中尺度压入（500 nm深度）对花分生组织、下胚轴和根所获得的典型结果；需注意，由于压头半径大于细胞壁直径，这种中尺度压入测量的是垂周细胞壁的“表观”杨氏模量（详见Peaucelle 等^9,17和Braybrook 等¹⁰

讨论

在植物中，力学性质的变化在调控生长和形态发生过程中起着重要作用。迄今为止，科学家在解析控制植物生长的遗传与化学网络方面已取得显著进展，但我们对这些网络如何影响力学性质变化以及如何受其影响的认识仍处于初级阶段。该方法有望帮助我们填补这一空白，因此对于研究植物生长或形态发生任何方面的科研人员都具有重要意义。接下来，我们总结该方法面临的挑战与局限性，并展望未来发展方向。

该方案中最困难的步骤是样品制备。样品必须用琼脂糖牢固地固定在载玻片上，但琼脂糖不能覆盖任何需要测量的样品区域。此外，制备过程必须在足够短的时间内（数分钟内）完成，以防止样品干燥，同时操作需轻柔，避免组织损伤：伤口和干旱被认为会导致细胞壁力学性质发生不可逆的变化¹⁸。另一个具有挑战性的步骤是选择正确的原子力显微镜（AFM）微压痕参数：根据不同的科学问题，可通过使用不同的压头和压痕深度，实现组织、细胞或亚细胞水平的分辨率。更多详细信息请参见^9,10。

该方法存在若干局限性。首先，该方法仅限于测量器官表面的力学性质；目前我们实验...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
原子力显微镜（AFM）	JPK	NanoWizard	所有三代设备均可完成相同的工作，性能相当。
AFM样品台	JPK	CellHesion	适用于表面形貌较低的样品（在力扫描区域内，最低点与最高点之间的高度差小于11 µm）。
AFM光学系统	JPK	Top View Optics	对样品定位至关重要。可用长工作距离双目镜或显微镜替代。
体视显微镜	Leica	M125	任意类型的体视显微镜均可使用。
150 nm固定探针悬臂梁	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	R150-NCL-10	用于仅测量表皮表面细胞壁的力学性质。
1 µm固定探针悬臂梁	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	用于测量垂直于表皮表面方向的细胞壁力学性质。
无针尖悬臂梁	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	TL-NCH-20	用于测量局部组织（约2–3个细胞宽度）的力学性质，使用5 µm固定探针悬臂梁。我们将一个5 µm的硼硅酸盐微珠连接到无针尖悬臂梁上。
5 µm硅微球	Corpuscular	C-SIO-5
Aradite胶	Bartik S.A. 77170 Coubet, France		用于将微珠固定在无针尖悬臂梁上。
低熔点琼脂糖	Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410	BP160-100	凝胶化温度为34–45 °C
D-甘露醇	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA	M4125-500G
2把不锈钢5号镊子	Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland	951199