纳米突起是从细胞的前导前端或尾随后端延伸出的纤细而脆弱的膜通道，可延伸长达100 μm，用于感知细胞环境。要观察这些细胞结构，必须在37 °C下直接固定，轻柔洗涤，并避免使用乙醇、甲醇或丙酮等有机溶剂以及高浓度的Triton X-100。
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摘要
摘要
培养中的贴壁细胞保持极化状态，以支持细胞运动和细胞间相互作用。纳米突起（nanopodia）是内皮细胞和癌细胞中细长、主要不含F-actin的膜性突起，可通过TM4SF1（跨膜-4-超家族成员1）免疫荧光染色观察到。TM4SF1在直径为100–300 μm的TMED（TM4SF1 e富集微环境d含有3至多达14个独立TM4SF1分子的结构域。TMED沿纳米突起间断排列，间距规则，每1至3个TMED为一组 μ微米并牢固地将纳米突起锚定在基质上，从而使纳米突起能够延伸超过100 μ从极化的内皮细胞或肿瘤细胞的前导前端或尾随后端延伸出的膜突起，在细胞移动后会在基质上留下膜残留物。由于TMED和纳米突起（nanopodia）具有极高的脆弱性和温度敏感性，它们长期以来被忽视。常规的洗涤和固定操作会破坏其结构。通过在37 °C下直接使用多聚甲醛（PFA）固定，随后短暂暴露于0.01% Triton X-100再进行染色，可有效保存纳米突起结构。纳米突起为细胞生物学开辟了新的研究视野：它们有望重塑我们对细胞如何感知微环境、远距离识别其他细胞、在近距离接触时启动细胞间相互作用，以及运动、增殖和细胞间通讯相关信号机制的理解。目前建立的用于研究TM4SF1来源纳米突起的方法，可能也适用于研究其他细胞类型中由经典四跨膜蛋白（尤其是广泛表达的CD9、CD81和CD151）介导形成的纳米突起。
引言
在运动极化过程中，动物细胞会从其表面延伸出多种动态的膜突起，包括丝状伪足、片状伪足、回缩纤维和皱褶1。最近新加入这一类别的还有纳米突起（nanopodia），这是一种新近被认识的膜突起类型，形态细长，直径为100-300 μm，长度可达50-100 μm，可为F-肌动蛋白结构（如丝状伪足和回缩纤维）的延伸提供膜通道，并在培养的内皮细胞和肿瘤细胞中对TM4SF1（跨膜蛋白四家族成员1）呈阳性染色2,3。
TM4SF1 是一种具有四跨膜结构域蛋白样拓扑结构的蛋白质，最初被称为肿瘤细胞抗原4，后来发现该分子是内皮细胞的生物标志物，在内皮细胞增殖和迁移中发挥关键作用2,3。免疫荧光染色显示，TM4SF1 定位于胞周囊泡和质膜，并富集于TM4SF1 enriched microdomains（TMED，TM4SF1 富集微区）。TMED 将纳米突起锚定在基质上，并以规则间隔呈带状分布，每 1–3 TMED/µm 纳米突起长度。在细胞极化运动过程中，纳米突起通常从细胞的前导边缘和尾随后端延伸而出。由于 TMED 具有牢固的黏附特性，当细胞向前移动时，纳米突起无法回缩至细胞内部，因而遗留下的纳米突起残迹可标记出细胞运动的路径。纳米突起为 F-肌动蛋白的延伸与回缩提供膜通道，同时也是细胞间相互作用与信号交流的位点2,3。这些特性表明，纳米突起为研究细胞极化过程中 F-肌动蛋白组装机制、细胞对微环境的感知、细胞运动路径与方向的确定，以及细胞间相互作用与通讯提供了独特的研究机会。
由于TMED具有高度疏水性，且纳米突起（nanopodia）具有薄而脆弱的膜状结构，因此在操作过程中需格外小心以保持TMED和纳米突起的完整性。常规实验方法可能会破坏纳米突起并去除TMED，这可能是自1986年首次发现TM4SF1以来，相关研究论文仅有63篇发表1 ，以及在2009年报道内皮细胞中TM4SF1的存在之前，一直完全缺乏关于其在细胞表面100–300 μm微区中富集现象认知的原因2。
传统的免疫染色方法通常使用乙醇、甲醇或丙酮等有机溶剂固定细胞，并使用0.1%或更高浓度的Triton X-100进行细胞通透5。本文所述的研究对传统方法进行了三项主要改进，以显示TMED和纳米突起：（i）使用37 °C的4%多聚甲醛（PFA）并在37 °C培养箱中固定细胞，（ii）采用温和的室温PBS洗涤，（iii）仅在加入一抗前短暂使用低于0.03%的Triton X-100进行细胞通透，因为高于0.03%的Triton X-100会抽提TM4SF1。
所有四跨膜蛋白均在细胞膜上形成微区6，其中一些在内皮细胞和肿瘤细胞中与TMED共定位2,3。由于CD9、CD81和CD151等四跨膜蛋白广泛表达，本文所述染色方案可推广至缺乏TM4SF1的多种不同细胞类型，用于纳米突起功能的研究。
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方案
1. 胶原蛋白包被玻璃圆片上的细胞培养
- 将玻璃圆片（直径 12 mm）放入玻璃瓶（4 oz）中，并进行高压灭菌以消毒圆片。
- 在 50 ml Falcon 管中加入 25 ml 70% 乙醇，并将其置于细胞培养超净台中。该溶液可重复使用多次，直至液面降至 20 ml。
- 在使用精细尖头镊子操作玻璃圆片前，先将其置于 70% 乙醇中浸泡 5 分钟。
- 小心将镊子从管中取出并盖上管盖，然后将经乙醇处理的镊子轻轻放置在管口上方，静置晾干 2 分钟。注意镊子尖端不得接触超净台内任何物体。
- 使用无菌镊子从玻璃瓶中取出一片无菌玻璃圆片 ，并将其放入 24 孔细胞培养板的一个孔中。重复此步骤，直至所需数量的孔中均放置了圆片。
- 向每个含有玻璃圆片 的孔中加入 500 μl 牛胶原蛋白溶液（50 ng/ml），然后将培养板置于 37 °C、5% CO2 的细胞培养箱中孵育至少 30 分钟。延长孵育时间不会产生不良影响。
- 通过胰酶消化法收获已在 150 mm 细胞培养皿中培养的 HUVEC（人脐静脉内皮细胞）或 PC3（前列腺肿瘤细胞），并用完全培养基终止胰酶活性。将细胞收集至 15 ml Falcon 管中。
- 计数细胞数量，并确保细胞活力高于 90%。
- 在 4 °C 条件下以 200 × g 离心 10 分钟使细胞沉淀，弃去上清液。
- 用培养基将细胞稀释至 105 个细胞/ml，并将细胞悬液置于冰上保存。
- 在细胞培养超净台中吸除胶原溶液，然后轻柔地向每个预先包被胶原的玻璃圆片孔中加入 500 μl 细胞悬液。在 24 孔板中，每孔接种 5 × 104 个细胞可使 HUVEC 达到约 60% 汇合度，PC3 细胞达到约 30% 汇合度。注意：如需更高细胞密度，可增加细胞悬液接种量。
- 将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养 1 小时、2 小时、4 小时、6 小时或 24 小时，以追踪纳米突起活动及细胞迁移行为。通常情况下，细胞在前 30 分钟内附着于玻璃圆片 ，随后在第一个小时内开始极化和迁移，并在接下来的数小时内进行细胞间相互作用和细胞分裂。
2. 细胞固定
- 每个孔需要加入 500 μl 的 4% 多聚甲醛（PFA）以固定细胞。可使用 commercially manufactured 或新鲜配制的 4% PFA。根据所准备的孔数计算所需 PFA 的总量，并将 PFA 置于 15 ml 离心管中。注意：多聚甲醛为疑似致癌物。
- 将离心管放入已置于 37 °C 培养箱中的泡沫塑料支架内，使管子在培养箱中预热 30 分钟，使 PFA 升温至 37 °C。
- 在细胞培养超净台内放置加热垫并开启电源。
- 从培养箱中取出 24 孔细胞培养板和预热的 PFA，并将其放置在加热垫上。
- 用一只手吸除孔中的培养基，随后立即用另一只手沿孔壁轻轻加入 500 μl PFA。为便于吸除操作，可将培养板倾斜约 45°，倚靠在泡沫塑料支架上以保持稳定。此角度有助于在不扰动培养细胞的情况下完成吸除和添加 PFA 溶液的操作。这是保持细胞原有结构和活性状态最关键的一步。
- 重复上述操作，直至所有含有玻璃圆片 的孔均加入 PFA。注意：所有需要更换孔内原有溶液的步骤均采用相同的吸除方法。
- 将培养板置于 37 °C 条件下孵育 5 分钟。
- 将培养板移回细胞培养超净台，并如步骤 2.5 所述倾斜倚靠在泡沫塑料支架上。用一只手轻轻将孔内的 PFA 转移至收集管中，另一只手立即向孔内加入至少 500 μl 室温 PBS。待所有孔完成洗涤后，重复 PBS 洗涤一次。将收集的 PFA 废液倒入有害废物容器中。
- 通过向 PBS 中加入 2% 胎牛血清配制免疫细胞化学封闭缓冲液。加入 0.04% 叠氮化钠（由 20% 储存液稀释而成）作为防腐剂。注意：叠氮化钠为有毒化合物。该缓冲液可在 4 °C 长期保存，不易发生细菌污染。
- 保持培养板倚靠在支架上倾斜状态，依次对每个孔进行吸除 PBS 操作，并立即加入 500 μl 免疫细胞化学封闭缓冲液。此时细胞已准备好进行免疫荧光染色。如有需要，固定后的细胞可在 4 °C 冰箱中保存一周，TM4SF1 蛋白无明显降解。
3. 纳米突起中TM4SF1的免疫荧光染色
- 在每个孔中，将500 μl ICC封闭缓冲液更换为含有0.01% Triton X-100的新封闭缓冲液，室温孵育1小时。Triton X-100浓度不得超过0.03%，否则会导致TM4SF1从细胞膜上脱落。若染色需立即开始，步骤2.10中经PBS洗涤的细胞可直接转移至含Triton的封闭缓冲液中。
- 将一抗抗TM4SF1（或抗CD9）抗体用免疫细胞化学封闭缓冲液稀释至0.5 μg/ml。
- 在每个孔中，移除ICC/0.01% Triton缓冲液，并加入300 μl抗TM4SF1抗体溶液。于2 hr内孵育 室温或过夜放置 4 °C下
- 每孔加入不少于 500 μl 的 PBS 洗涤，重复 3 次；每次孵育时间至少 5 分钟。
- 在ICC封闭缓冲液中配制二抗和鬼笔环肽溶液，使用Alexa 488标记的二抗按1,000倍稀释 标记的驴抗小鼠二抗（终浓度 2 μg/ml）和鬼笔环肽 1000 倍稀释液（终浓度 50 ng/ml）。
- 移除 PBS，向每孔加入 300 μl 二抗与鬼笔环肽（phalloidin）溶液，孵育 2 小时或过夜 4 °C下
- 重复 PBS 洗涤步骤，每次洗涤孵育时间至少 5 分钟。最后一次洗涤时，将每孔保留在 PBS 中 1 小时。
- 在载玻片上滴加一滴抗荧光淬灭封片剂（约10 μl）。
- 将19 G 1½英寸注射器针头的尖端在硬质表面上轻轻按压，使其弯曲90°。用一只手握住弯曲的针头，轻轻抬起玻璃圆盘 从孔中 用另一只手使用尖头镊子夹住圆盘。
- 转动玻璃圆盘 将细胞面朝下，使其接触载玻片上的封片介质。轻轻放置玻璃盖片 过夜晾干 在避光处 室温
- 继续进行免疫荧光染色的纳米突起成像，或在 -20 °C 下将载玻片存放在载玻片盒中。载玻片在 -20 °C 条件下可保存数月仍可观察。
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结果
步骤1：
如果细胞（例如本研究中使用的 HUVEC 和 PC3 细胞）能够正常生长，则在接种后 30 分钟内会附着于胶原包被的圆片上，随后迅速极化并获得移动能力，并在其移动路径前方伸出纳米突起。图 1A 和 图 1B 分别显示极化且正在增殖的 HUVEC 细胞。图 2A 显示处于可移动状态的极化 PC3 细胞。
步骤 2：
将4% PFA预热至37 °C，于37 °C条件下固定细胞20分钟，并用室温PBS轻柔洗涤，可良好保存细胞状态。通常情况下，分离的单个HUVEC（图1A，1）或PC3（图2A）细胞会呈现极化形态，除非细胞正处于分裂状态（图1B，1）。细胞间相互作用导致细胞连接形成（图1C，1）也常可观察到。纳米突起应出现在细胞周边，F-actin...
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讨论
纳米突（Nanopodia）是通过TMED牢固附着于基质的细长细胞膜通道，可从极化移动细胞延伸超过100 μm，以感知环境并介导细胞间相互作用2,3。纳米突对基质的附着非常牢固，当细胞移动离开时，会在基质上留下残留痕迹（图1和图2）。因此，纳米突使我们能够研究细胞如何感知其周围环境、决定移动路径，以及基因表达或药物处理如何改变细胞运动。然而，由于这些膜结构极为纤细脆弱（宽度为100–300 μm），在操作过程中需格外小心以保持其完整性。
为了在不干扰纳米突起的情况下准确记录细胞活动，并研究实验条件如何影响纳米突起的活动及细胞运动路径，应在开展实验前首先验证细胞在完全培养基中能否有效生长。正常健康的原代内皮细胞（如 HUVEC）在新鲜的 EGM2-MV 完全培养基中，于培养前六代的对数生长期通常每约 18 小时分裂一次。应避免使用传代次数超过第六代的 HUVEC，因为更高的传代次数会导致培养物中衰老细胞或双核细胞数量增加7，并影响细胞极化及形成纳米突起的能力2
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 Harold Dvorak 博士提供的有益讨论，包括建议尝试在 37 °C 下使用 PFA 进行固定。本工作由美国国立卫生研究院基金项目 P01 CA92644 以及美国国家癌症研究基金会的合同资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 玻璃圆盘 | Fisher Scientific | 12-545-82 | 12 mm 直径 |
| 玻璃罐 | Fisher Scientific | 02-912-310 | 经认证洁净透明玻璃直边罐，4 盎司 |
| 载玻片 | Fisher Scientific | 12-544-1 | Fisherfinest 品牌优质普通玻璃显微镜载玻片 |
| 50 ml Falcon管 | BD Falcon | 352070 | 50 ml 高透明度聚丙烯圆锥形离心管，耐受 16,000 rcf。无菌。 |
| 15 ml Falcon管配泡沫架 | 康宁 | 430790 | Corning 15 ml PP 离心管 |
| 尖头镊子 | Fisher Scientific | 13-812-42 | 解剖超细尖头镊 |
| 24孔细胞培养板 | BD Bioscience | 353047 | 24孔细胞培养板 |
| 150 mm 细胞培养皿 | BD Bioscience | 353025 | 150 mm 细胞培养皿 |
| 19 G 1 ½ 注射器针头 | BD Bioscience | 309635 | 19 G 1 ½ |
| 乙醇 | Decon Laboratories, Inc. | 2701 | Decon的纯乙醇200 proof |
| 胶原蛋白溶液 | BD Bioscience | 354249 | I 型胶原蛋白，高浓度，大鼠尾部来源，100 毫克 |
| 胰蛋白酶/EDTA | Cellgro | 25-053-CI | 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 1× |
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | DMEM高糖（1倍浓度），液体，含L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠 |
| 10x PBS | Affymetrix | 75889 5 升 | PBS，10 倍浓缩液，pH 7.4 |
| PFA（多聚甲醛） | Affymetrix | 19943 1 LT | PBS 中 4% |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | 胎牛血清 |
| EGM2-MV | Lonza | CC-3162 | EGM-2 BulletKit、EBM-2 基础培养基 500 ml 及 EGM-2 SingleQuot 试剂盒添加剂 &生长因子 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S2002-25G | 溶于水。储存液浓度为4%，工作浓度为0.4%。 |
| 小鼠抗人 TM4SF1 抗体 | 默克密理博 | MAB3127 | 表位位于胞外结构域 |
| 小鼠抗人 CD9 抗体 | BD Bioscience | 555370 | 表位位于胞外域 |
| Alexa Fluor 488 驴抗小鼠二抗 | Life Technologies | A-21202 | Alexa Fluor 488 驴抗小鼠 IgG (H+L) |
| 鬼笔环肽 | Chemicon | 90324 | 罗丹明偶联鬼笔环肽 |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Life Technologies | P-36931 | 含 DAPI 的 ProLong Gold 抗荧光淬灭试剂 |
| 70% 乙醇 | 17.5 ml 乙醇（200度） 7.5 ml 双重去离子水 | ||
| 10倍PBS（配制200 ml） | 20 ml 10倍PBS 180 ml 双蒸水 | ||
| 20% Triton X-100（配制20 ml） | 4 ml Triton X-100 16 ml 双重去离子水 | ||
| 4% NaN3 （配制 25 ml） | 1 g NaN3 25 ml 双重去离子水 | ||
| 50 ng/ml 牛胶原溶液（PBS 配制，配制 5 ml） | 50的储备液 μ微克/毫升（50 毫升） 830 μI 型胶原（3 mg）的升 50 ml PBS | ||
| ICC封闭缓冲液（50 ml） | 49 ml PBS 2% FBS（加入1 ml） 0.04% NaN3 （加入100） μ4% NaN₃ 溶液3) | ||
| ICC封闭缓冲液/0.01% Triton X-100（配制50 ml） | 50 ml 免疫细胞化学封闭缓冲液 25 μ20% Triton X-100 溶液 | ||
| HUVEC | Lonza | C2517A | www.lonza.com |
| PC3 | ATCC | CRL-1435 | www.atcc.org |
| 细胞培养罩 | NuAIRE | Nu-425-600 | NU-425（60系列）生物安全柜 |
| 37 °C，5% CO2 细胞培养箱 | CellStar | QWJ300DABA | Cellstar CO2 水套式培养箱 |
| 加热垫 | K&H Manufacturing | 1020 | K&H Lectro Kennel 加热垫配免费绒布罩（www.amazon.com) |
| 离心 | Sorvall | T6000B | Sorvall T6000 (B) 台式离心机 |
| 血细胞计数板 | Sigma-Aldrich | Z359629 | 亮线血细胞计数板 |
参考文献
- Chhabra, E. S., Higgs, H. N. The many faces of actin: matching assembly factors with cellular structures. Nat. Cell Biol. 9, 1110-1121 (2007).
- Shih, S. C., et al. The L6 protein TM4SF1 is critical for endothelial cell function and tumor angiogenesis. Cancer Res. 69, 3272-3277 (2009).
- Zukauskas, A., et al. TM4SF1: a tetraspanin-like protein necessary for nanopodia formation and endothelial cell migration. Angiogenesis. 14, 345-354 (2011).
- Hellstrom, I., Beaumier, P. L., Hellstrom, K. E. Antitumor effects of L6, an IgG2a antibody that reacts with most human carcinomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 7059-7063 (1986).
- Jang, Y. Y., Ye, Z., Cheng, L. Molecular imaging and stem cell research. Mol. Imag. 10, 111-122 (2011).
- Hemler, M. E. Tetraspanin functions and associated microdomains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 801-811 (2005).
- Vasile, E., Tomita, Y., Brown, L. F., Kocher, O., Dvorak, H. F. Differential expression of thymosin beta-10 by early passage and senescent vascular endothelium is modulated by VPF/VEGF: evidence for senescent endothelial cells in vivo at sites of atherosclerosis. FASEB. 15, 458-466 (2001).
- Itoh, T. J., Hotani, H. Microtubule dynamics and the regulation by microtubule-associated proteins (MAPs). Uchu Seibutsu Kagaku. 18, 116-117 (2004).
- Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. J. Biol. Chem. 263, 10344-10352 (1988).
- Pollice, A. A., et al. Sequential paraformaldehyde and methanol fixation for simultaneous flow cytometric analysis of DNA, cell surface proteins, and intracellular proteins. Cytometry. 13, 432-444 (1992).
- Macarulla, J. M., et al. Membrane solubilization by the non-ionic detergent triton X-100. A comparative study including model and cell membranes. Revista Espanola de Fisiologia. 45 Suppl, 1-8 (1989).
- Koley, D., Bard, A. J. Triton X-100 concentration effects on membrane permeability of a single HeLa cell by scanning electrochemical microscopy (SECM). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 16783-16787 (2010).
- Chang, Y. W., et al. CD13 (aminopeptidase N) can associate with tumor-associated antigen L6 and enhance the motility of human lung cancer cells. Int. J. Cancer. 116, 243-252 (2005).
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