一种快速且特异的微孔板法用于测定培养细胞内外的抗坏血酸

摘要

抗坏血酸在细胞代谢中发挥着多种重要作用，其中许多功能直到近年来才被揭示。本文介绍了一种中等通量、特异性强且成本低廉的微孔板检测方法，可用于测定细胞培养物中细胞内和细胞外的抗坏血酸含量。

摘要

维生素C（抗坏血酸）在细胞代谢中发挥着多种重要作用，其中许多功能直到近年来才被揭示。例如，在大脑中，抗坏血酸通过在神经元与邻近的星形胶质细胞之间循环，发挥神经保护和神经调节作用——这种相互关系似乎对维持脑内抗坏血酸的稳态至关重要。此外，越来越多的证据强烈表明，抗坏血酸在调控细胞和系统性铁代谢方面的作用远比传统认知更为广泛。随着对抗坏血酸在正常及异常调控的细胞与机体生理功能中核心作用的认识不断加深，人们迫切需要一系列中等通量、高灵敏度的分析技术，且这些技术无需依赖昂贵的专业设备即可实施。本文提供了明确的操作步骤，介绍一种中等通量、特异性强且相对经济的微孔板检测方法，用于测定细胞培养物中胞内和胞外的抗坏血酸含量。

引言

阿尔伯特·圣捷尔吉（Albert Szent-Györgyi）等人在1928年至1934年间发表的论文中，揭示了抗坏血酸（维生素C）的化学本质，并确认其为长期寻找的"抗坏血病因子"，这是生物化学史上的里程碑事件¹。这些发现促使圣捷尔吉于1937年被授予诺贝尔生理学或医学奖。目前，抗坏血酸在动物与植物生理以及人类健康中不断扩展的多种功能，仍是科学界活跃研究与争议的课题。

L-抗坏血酸是哺乳动物系统中一种丰富的生理还原剂和酶辅因子，参与多种明确的酶促反应，包括胶原蛋白羟化、肉碱和去甲肾上腺素的生物合成、酪氨酸代谢以及肽类激素的酰胺化²。引人注目的是，越来越多的证据表明，抗坏血酸可通过激活与缺氧诱导因子（HIFs）1α和2α的羟化及降解相关的脯氨酰和天冬氨酰羟化酶，从而影响其他依赖铁的双加氧酶的活性³。最近的一项研究报告指出，抗坏血酸通过作用于核内羟化酶——Jumonji C（JmjC）结构域蛋白，促进染色质去甲基化，从而在T细胞成熟过程中发挥作用；而这些JmjC结构域蛋白似乎需要抗坏血酸才能发挥完全活性⁴。事实上，抗坏血酸对这些酶的激活机制与它对HIF和胶原羟化酶的激活机制相似。除上述经典作用外，抗坏血酸还作为水溶性链断裂型自由基清除剂，在细胞抗氧化防御中发挥重要作用⁵，并通过还原α-生育酚氧自....

方案

1. 测定培养细胞内的抗坏血酸含量

1. 细胞培养与收获
   1. 悬浮培养 （例如 人红白血病细胞（K562）或贴壁细胞（例如 使用标准培养方法原代培养星形胶质细胞^19-21,32,38注意：为确保细胞内含有抗坏血酸，可通过抗坏血酸或脱氢抗坏血酸（DHA）对培养细胞进行抗坏血酸负荷处理^33,39.
2. 制备含抗坏血酸的细胞提取物
   1. 将适量经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤的悬浮细胞或贴壁细胞与450 μl预冷的细胞通透缓冲液（CPB；含0.1% (w/v) 皂苷的PBS；4 °C）共同孵育。注意：所需细胞数量应由最终使用者根据实验条件通过经验确定，以确保吸光度值处于检测方法的线性范围之内（见下文）。注意：也可使用组织提取物（详见讨论部分）。
   2. 将细胞在冰上振荡10分钟，以确保充分裂解细胞。
   3. 通过在4 °C下以16,000 × g离心5分钟（使用制冷微量离心机），从粗裂解液中去除细胞碎片，制备澄清的含抗坏血酸细胞内提取物。
   4. 从每个样品中小心吸取 4 份 100 μl 等分试样，加入 96 孔平底板中呈水平排列的孔内，每孔预先加入 25 μl PBS（磷酸盐缓冲液）/孔（"-碘乙酸钠"）或每孔25 ....

结果

培养悬浮细胞内抗坏血酸的测定

在第一个实验中（图1），通过抗坏血酸特异性方法测定细胞内抗坏血酸含量（即 AO敏感的）铁氰化物还原为亚铁氰化物，采用先前已发表方法对亚铁氰化物进行高灵敏度测定³⁷. 抗坏血酸的检测基于抗坏血酸依赖性地将铁氰化物还原为亚铁氰化物，进而由亚铁氰化物将三价铁还原为二价铁，生成的亚铁离子通过比色法与显色剂螯合进行检测。由于某些二价金属离子在超生理浓度下（例如 铜²⁺, Co²⁺ 和 Zn²⁺可能会产生干扰，推测是由于这些物质与亚铁离子竞争与ferene-S发生螯合反应，因此在此类条件下应采取适当的预防措施³⁷.

图2 显示了一条典型的抗坏血酸标准品（0–20 μM，或每孔0–2 nmole抗坏血酸，96孔板；参见“实验方案”中第6.5步）的标准曲线。尽管本图未展示，每孔抗坏血酸量高达8 nmole时仍.......

讨论

本文介绍了两种快速、特异且相对灵敏的比色微孔板检测方法，用于测定培养细胞中来自细胞内和细胞外区室的抗坏血酸。这些检测方法仅需使用常规实验室设备和试剂即可完成。检测中唯一成本相对较高的试剂是抗坏血酸氧化酶（AO），该试剂对于实现对L-抗坏血酸的高度分析物特异性至关重要。本方法适用于悬浮细胞（例如 K562）和贴壁细胞（例如 HepG2 或原代啮齿类动物星形胶质细胞），并已在先前使用这些细胞的研究中成功应用^{19,20,32,37,38}。应避免使用其他抗坏血酸氧化剂（例如 Tempol）替代AO，因为它们对L-抗坏血酸的特异性不足。此外，在抗坏血酸释放检测中使用Tempol等化合物会因其能够穿过细胞膜并氧化细胞内抗坏血酸而造成干扰⁴⁴。而在实验所用的时间范围内，AO基本不能透过细胞膜。

我们已将上述比色法抗坏血酸检测所得结果与Vislise.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nunc 96孔平底板	Thermo	269620	任何平底96孔板均可使用
制冷台式微量离心机	Eppendorf	5415D	也可使用已在冷室中平衡至相应温度的非制冷微量离心机
制冷台式离心机	Eppendorf	5810R	摆桶式转子
Bio-Rad Benchmark Plus 微孔板分光光度计	Bio-Rad		推荐使用任何能够在593 nm波长下读数的微孔板分光光度计。若使用滤光片型酶标仪，应选择最接近的波长，并采用标准曲线法
Eppendorf MixMate（微孔板轨道摇床）	Eppendorf		这是一种用途广泛且可靠的微孔板混合器，非常适合本实验
通用缓冲液
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4
MOPS缓冲盐水（MBS）；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，15 mM MOPS-Na+，pH 7.3
MBS + 5 mM D-葡萄糖（MBS/D）
HEPES缓冲盐水 + 5 mM D-葡萄糖（HBS/D）；137 mM NaCl，5.2 mM KCl，1.8 mM CaCl2•2 H2O，0.8 mM MgSO4•7 H2O，5 mM D-葡萄糖，20 mM HEPES-Na+，pH 7.3
细胞通透缓冲液（CPB；含0.1%皂苷的PBS）
通用化学品
L-抗坏血酸或L-抗坏血酸钠	Sigma-Aldrich		应选用最高纯度的试剂
脱氢-L-抗坏血酸（DHA）二聚体	Sigma-Aldrich	30790	水溶液理论上每摩尔DHA二聚体可生成2摩尔DHA单体
细胞松弛素B	Sigma-Aldrich	C6762	用DMSO或乙醇配制储备液
抗坏血酸氧化酶（AO）	Sigma-Aldrich	A0157	储备液（120 U/ml）可用PBS或MBS配制，分装后冷冻保存
铁氰化钾（FIC）	Sigma-Aldrich	455989	三水合物
Ferene-S（3-(2-吡啶基)-5,6-二(2-呋喃基)-1,2,4-三嗪-5′,5′′-二磺酸二钠盐）	Sigma-Aldrich	92940
L-谷氨酸钠	Sigma-Aldrich
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich
皂苷	Sigma-Aldrich	47036	配制0.1%储备液
细胞内抗坏血酸测定实验用储备液
3 M 醋酸钠（pH 6.0）
冰醋酸
0.2 M 柠檬酸
0.1 M 醋酸中的3.3 mM FeCl3
30 mM Ferene-S
50%（v/v）醋酸 + 30%（w/v）三氯乙酸（TCA）
抗坏血酸外排实验用储备液
AO（120 U/ml）
2.4 mM Ferene-S
0.6 mM 柠檬酸钠中的0.12 mM FeCl3