一种快速且特异的微孔板法用于测定培养细胞内外的抗坏血酸

摘要

抗坏血酸在细胞代谢中发挥着多种重要作用，其中许多功能直到近年来才被揭示。本文介绍了一种中等通量、特异性强且成本低廉的微孔板检测方法，可用于测定细胞培养物中细胞内和细胞外的抗坏血酸含量。

摘要

维生素C（抗坏血酸）在细胞代谢中发挥着多种重要作用，其中许多功能直到近年来才被揭示。例如，在大脑中，抗坏血酸通过在神经元与邻近的星形胶质细胞之间循环，发挥神经保护和神经调节作用——这种相互关系似乎对维持脑内抗坏血酸的稳态至关重要。此外，越来越多的证据强烈表明，抗坏血酸在调控细胞和系统性铁代谢方面的作用远比传统认知更为广泛。随着对抗坏血酸在正常及异常调控的细胞与机体生理功能中核心作用的认识不断加深，人们迫切需要一系列中等通量、高灵敏度的分析技术，且这些技术无需依赖昂贵的专业设备即可实施。本文提供了明确的操作步骤，介绍一种中等通量、特异性强且相对经济的微孔板检测方法，用于测定细胞培养物中胞内和胞外的抗坏血酸含量。

引言

阿尔伯特·圣捷尔吉（Albert Szent-Györgyi）等人在1928年至1934年间发表的论文中，揭示了抗坏血酸（维生素C）的化学本质，并确认其为长期寻找的"抗坏血病因子"，这是生物化学史上的里程碑事件¹。这些发现促使圣捷尔吉于1937年被授予诺贝尔生理学或医学奖。目前，抗坏血酸在动物与植物生理以及人类健康中不断扩展的多种功能，仍是科学界活跃研究与争议的课题。

L-抗坏血酸是哺乳动物系统中一种丰富的生理还原剂和酶辅因子，参与多种明确的酶促反应，包括胶原蛋白羟化、肉碱和去甲肾上腺素的生物合成、酪氨酸代谢以及肽类激素的酰胺化²。引人注目的是，越来越多的证据表明，抗坏血酸可通过激活与缺氧诱导因子（HIFs）1α和2α的羟化及降解相关的脯氨酰和天冬氨酰羟化酶，从而影响其他依赖铁的双加氧酶的活性³。最近的一项研究报告指出，抗坏血酸通过作用于核内羟化酶——Jumonji C（JmjC）结构域蛋白，促进染色质去甲基化，从而在T细胞成熟过程中发挥作用；而这些JmjC结构域蛋白似乎需要抗坏血酸才能发挥完全活性⁴。事实上，抗坏血酸对这些酶的激活机制与它对HIF和胶原羟化酶的激活机制相似。除上述经典作用外，抗坏血酸还作为水溶性链断裂型自由基清除剂，在细胞抗氧化防御中发挥重要作用⁵，并通过还原α-生育酚氧自由基来再生细胞膜上的α-生育酚（维生素E）⁶，这对于防止膜脂质过氧化具有重要意义⁷。值得注意的是，尽管大多数哺乳动物能够在肝脏中从D-葡萄糖从头合成抗坏血酸，但高等灵长类动物、豚鼠以及某些蝙蝠则依赖膳食来源获取该维生素⁸。这是由于GULO基因失活所致，该基因在不受影响的哺乳动物中的同源基因编码γ-古洛糖酸内酯氧化酶^9-13，此酶是葡萄糖合成抗坏血酸过程中最后一步反应所必需的¹³。

在人体内，抗坏血酸经肠道腔内由转运蛋白介导吸收后，通过循环系统分布至全身。该维生素通常以还原形式存在于细胞内，浓度达毫摩尔水平（红细胞是一个显著例外，其浓度通常与当前血浆浓度相近），而在大多数细胞外液中则为微摩尔浓度（例如 50–200 μM）^14,15。

在生理条件下，抗坏血酸通常经历可逆的单电子氧化，生成抗坏血酸自由基（AFR；也称为单脱氢抗坏血酸或半脱氢抗坏血酸）。尽管AFR是一种相对稳定的自由基¹⁶，但在缺乏将其迅速通过单电子酶促还原回抗坏血酸的情况下，两个AFR可进一步歧化生成一个抗坏血酸和一个脱氢抗坏血酸（DHA）^9,13,17。在细胞内，抗坏血酸的双电子氧化产物DHA可通过依赖谷胱甘肽和NAD(P)H的酶促及非酶促反应迅速被还原为抗坏血酸¹³。

尽管传统观点认为抗坏血酸在铁代谢中的唯一重要作用是促进非血红素铁的膳食吸收¹⁸，但我们及其他研究者已提供强有力的证据，表明抗坏血酸在该金属的代谢中具有更为广泛的功能。首先，由富含抗坏血酸的细胞释放的抗坏血酸似乎在调控细胞对非转铁蛋白结合铁的摄取过程中发挥重要作用^19,20，而最新的证据表明，抗坏血酸也能调控细胞对转铁蛋白结合铁的摄取²¹，后者正是主要的生理铁摄取途径²²。

抗坏血酸对哺乳动物中枢神经系统的正常功能至关重要^23,24。大脑与肾上腺皮质、垂体、胸腺、视网膜以及黄体一样，其抗坏血酸浓度较其他组织更高^23,25-27。此外，星形胶质细胞^28,29和类神经元细胞³⁰在暴露于谷氨酸时，会触发抗坏血酸向细胞外空间的释放；人们认为，释放出的抗坏血酸有助于保护神经元免受谷氨酸诱导的神经功能障碍³¹。尽管谷氨酸诱导星形胶质细胞释放抗坏血酸的确切机制尚不清楚，但我们最近的研究提供了证据，表明该过程涉及星形胶质细胞通过谷氨酸/天冬氨酸转运体（GLAST；在人类中也称为兴奋性氨基酸转运体亚型1 [EAAT1]）摄取谷氨酸后引起的细胞肿胀，进而激活容积敏感性渗透物和阴离子通道（VSOACs），这些通道可允许抗坏血酸等小分子有机阴离子通过³²。参与形成VSOAC的质膜通道的分子身份仍有待鉴定^33,34。

尽管已开发出多种用于测定生物样品中抗坏血酸含量的分析方法，包括分光光度法、荧光法和色谱法^35,36，但这些方法在特异性、灵敏度、化学污染物的干扰、有效线性范围以及终点分析物的稳定性方面存在较大差异。此外，影响分析方法选择的其他重要因素还包括检测速度、操作便捷性，以及是否能够获得高效液相色谱（HPLC）仪等相对专用的设备。

本文介绍了一种简单且高特异性的比色微孔板法，用于测定培养细胞内的抗坏血酸含量，以及另一种独立的检测方法，用于测定培养细胞中抗坏血酸的外流。后一种检测方法旨在克服由于钠依赖性抗坏血酸转运蛋白（SVCTs）快速重摄取已释放的抗坏血酸而导致细胞抗坏血酸释放量被低估的问题。尽管这两种方法此前已在我们的一些出版物中出现过^{19,20,32,37,38}，但本论文提供了其有效实施的明确操作步骤和指导规范。

方案

1. 测定培养细胞内的抗坏血酸含量

1. 细胞培养与收获
   1. 悬浮培养 （例如 人红白血病细胞（K562）或贴壁细胞（例如 使用标准培养方法原代培养星形胶质细胞^19-21,32,38注意：为确保细胞内含有抗坏血酸，可通过抗坏血酸或脱氢抗坏血酸（DHA）对培养细胞进行抗坏血酸负荷处理^33,39.
2. 制备含抗坏血酸的细胞提取物
   1. 将适量经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤的悬浮细胞或贴壁细胞与450 μl预冷的细胞通透缓冲液（CPB；含0.1% (w/v) 皂苷的PBS；4 °C）共同孵育。注意：所需细胞数量应由最终使用者根据实验条件通过经验确定，以确保吸光度值处于检测方法的线性范围之内（见下文）。注意：也可使用组织提取物（详见讨论部分）。
   2. 将细胞在冰上振荡10分钟，以确保充分裂解细胞。
   3. 通过在4 °C下以16,000 × g离心5分钟（使用制冷微量离心机），从粗裂解液中去除细胞碎片，制备澄清的含抗坏血酸细胞内提取物。
   4. 从每个样品中小心吸取 4 份 100 μl 等分试样，加入 96 孔平底板中呈水平排列的孔内，每孔预先加入 25 μl PBS（磷酸盐缓冲液）/孔（"-碘乙酸钠"）或每孔25 μl的45.5 U/ml储存液 L-抗坏血酸氧化酶（AO）在 PBS 中（"+AO"）。注意：此步骤应与标准品的制备同时进行（见下文）。
3. 抗坏血酸标准曲线构建（每次检测均需重新构建）
   1. 配制10 mM抗坏血酸的储备液于预冷的PBS中。注意：使用光程为1 cm的石英比色皿，在265 nm处通过分光光度法测定抗坏血酸浓度（消光系数 = 14.5 mM⁻¹cm⁻¹）。^-1 cm^-1)⁴⁰.
   2. 仔细配制一系列浓度在 0 到 20 μM 之间的抗坏血酸标准品。
   3. 与步骤1.2.4同时进行，小心从每个标准品中移取4 × 100 μl等分试样，加入至96孔平底板中呈水平排列的各孔中，每孔预先加入25 μl PBS"-AO"）或 PBS 中 45.5 U/ml 的 AO 储存液（"+AO"）。注意：上述抗坏血酸标准品各取100 μl，其中含抗坏血酸0–2 nmol。请注意，添加AO的目的是为了校正非抗坏血酸还原物质对铁氰化物还原的贡献。
4. 测定细胞内抗坏血酸——步骤1：选择性去除抗坏血酸，并用铁氰化物定量氧化抗坏血酸
   1. 用铝箔包裹96孔板，在室温下避光以550 rpm转速振荡混匀5分钟。注意：此步骤应使所有抗坏血酸完全氧化 "+ AO" 孔加入DHA。 "-AO" 孔应不受影响。
   2. 加入50 μl 3.5 mM 铁氰化钾（下文中简称 "铁氰化物"在 PBS 中将铁氰化物加入所有孔中，终浓度 [ferricyanide] = 1 mM。注意：使用多通道移液器。
   3. 在室温下避光，以550 rpm的速度轨道振荡混匀平板，持续5分钟。注意：此步骤中，抗坏血酸应按化学计量比将铁氰化物还原为亚铁氰化物，每氧化1分子抗坏血酸可还原2分子铁氰化物。
   4. 立即加入25 μl新配制的溶液，该溶液含有50%（v/v）乙酸和30%（w/v）三氯乙酸（TCA）。注意：使用多通道移液器。
5. 测定细胞内抗坏血酸——步骤2：定量生成的亚铁氰化物含量³⁷
   1. 加入100 μl亚铁氰化物测定溶液³⁷ 向每个孔中加入。注意：工作液应在使用前立即配制：2 ml 3 M 醋酸钠（pH 6.0）；0.5 ml 冰醋酸（约17.4 M 醋酸）；2 ml 0.2 M 柠檬酸；2 ml 3.3 mM FeCl₃。₃ 在0.1 M乙酸中；1 ml 30 mM Ferene-S。该工作液的最终体积应为7.5 ml。
   2. 在室温下，于暗处以550 rpm转速振荡混匀平板30分钟。
   3. 在 593 nm 处读取各孔的吸光度值即 Fe(II)(ferene-S) 的最大吸收波长₃ 复合物。
   4. 通过从A值中减去初始值，计算每百万细胞内抗坏血酸的含量，单位为nmol抗坏血酸/百万细胞_{593 nm} 从每个样本的“+ AO”孔中减去相应“- AO”孔的数值，然后根据抗坏血酸标准曲线进行插值（参见步骤1.3）。绘制标准曲线时，绘制此 "差值" 以每孔抗坏血酸含量为基准绘制各标准品的标准曲线。

2. 培养细胞中抗坏血酸外流的测定

1. 细胞培养与收获
   1. 按照上述方法（参见步骤 1.1）培养悬浮或贴壁细胞。注意：为获得最佳结果，建议在 24 孔板中对悬浮细胞和贴壁细胞进行以下检测。
   2. 用 400 μl 预热的含或不含钙、镁的 HEPES 缓冲盐溶液，并添加 5 mM D-葡萄糖（HBS/D；pH 7.3，37 °C），重悬悬浮细胞或覆盖贴壁细胞，加入 24 孔板的孔中。向每块 24 孔板中指定的无细胞孔加入等体积的 HBS/D。注意：后者将作为无细胞对照，用于测定基础反应（见下文）。

3. 测定抗坏血酸的释放量

1. 应预先配制以下储备液：120 U/ml AO 溶于 HBS/D 中（现配现用）；2.4 mM Ferene-S 溶于 HBS/D 中；120 μM FeCl₃ 和 600 μM Na-柠檬酸盐溶于 HBS/D 中（需立即从更高浓度的储备液稀释配制）。
2. 启动铁还原反应（每孔终体积应为 600 μl），向已含有 400 μl HBS/D 的各孔中加入以下体积的试剂：
   1. 向三复孔中的配对孔分别加入 50 μl AO（120 U/ml）或 HBS/D。AO 的终浓度应为 10 U/ml。注意：将配对孔标记为 "- AO" 和 "+ AO"。
   2. 在 37 °C 下轻轻振荡混匀 5 分钟。
   3. 向所有孔中加入 50 μl 2.4 mM Ferene-S。Ferene-S 的终浓度应为 200 μM。按上述条件在 37 °C 下继续振荡混匀 5 分钟。
   4. 加入 50 μl 新鲜配制的 120 μM 柠檬酸铁。铁和柠檬酸盐的终浓度分别为 10 μM 和 50 μM。充分混匀。
3. 在三组三复孔对照孔中，吸除上清液，并加入含 0.1% 皂苷的 600 μl HBS/D。注意：这些孔将作为平行进行的乳酸脱氢酶（LDH）释放实验的 "100% 细胞裂解" 对照（见下文）。
4. 在 37 °C 避光孵育 60 分钟。
5. 抗坏血酸外排实验结束后，迅速从每孔中吸出 500 μl 液体，转移至已做好相应标记的 24 孔板中的各孔。注意：对于悬浮细胞，应先在 4 °C 下离心去除细胞。
6. 取 300 μl 上清液分装至 96 孔板，于 593 nm 处测定吸光度。

4. 细胞外抗坏血酸的测定

1. 在 593 nm 处读取各孔的吸光度值。
2. 按照步骤 1.5.4 中所述的细胞内抗坏血酸测定方法，计算细胞外抗坏血酸含量，单位为每毫克蛋白质（或每百万个细胞）所含抗坏血酸的纳米摩尔数（nmoles ascorbate per mg protein 或 per million cells）。注意：最终使用者应优化实验条件，以确保抗坏血酸的释放不受细胞内抗坏血酸含量的限制。

5. 乳酸脱氢酶释放量的测定

1. 使用每个样本剩余的 200 μl 细胞外溶液进行乳酸脱氢酶（LDH）释放实验^32,41，以确定细胞裂解的程度。注意：以总可释放 LDH 的百分比形式计算。通过经 0.1% 皂苷处理的样本确定可释放的 LDH 水平。

结果

培养悬浮细胞中细胞内抗坏血酸的测定

在第一个实验中（图1），通过抗坏血酸特异性（即 AO敏感性）利用先前发表的高灵敏度方法检测亚铁氰化物，测定铁氰化物还原为亚铁氰化物的反应³⁷抗坏血酸的检测基于抗坏血酸依赖性地将铁氰化物还原为亚铁氰化物，进而由亚铁氰化物将三价铁还原为二价铁，生成的亚铁离子通过比色法与显色剂螯合而被检测。由于某些二价金属离子在超生理浓度下（例如 铜²⁺, Co²⁺ 和 Zn²⁺可能会产生干扰，可能是由于与亚铁离子竞争与ferene-S的螯合，因此在此类条件下应采取适当的预防措施³⁷.

图2显示了一组抗坏血酸标准品（0–20 μM，或每孔96孔板中含0–2 nmole抗坏血酸；参见“实验方案”中步骤6.5）的典型标准曲线。尽管本图未显示，但每孔抗坏血酸含量达8 nmole时线性关系仍可保持...

讨论

本文介绍了两种快速、特异且相对灵敏的比色微孔板检测方法，用于测定培养细胞中来自细胞内和细胞外区室的抗坏血酸。这些检测方法仅需使用常规实验室设备和试剂即可完成。检测中唯一成本相对较高的试剂是抗坏血酸氧化酶（AO），该试剂对于实现对L-抗坏血酸的高度分析物特异性至关重要。本方法适用于悬浮细胞（例如 K562）和贴壁细胞（例如 HepG2 或原代啮齿类动物星形胶质细胞），并已在先前使用这些细胞的研究中成功应用^{19,20,32,37,38}。应避免使用其他抗坏血酸氧化剂（例如 Tempol）替代AO，因为它们对L-抗坏血酸的特异性不足。此外，在抗坏血酸释放检测中使用Tempol等化合物会因其能够穿过细胞膜并氧化细胞内抗坏血酸而造成干扰⁴⁴。而在实验所用的时间范围内，AO基本不能透过细胞膜。

我们已将上述比色法抗坏血酸检测所得结果与Vislise...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nunc 96孔平底板	Thermo	269620	任何平底96孔板均可使用
制冷台式微量离心机	Eppendorf	5415D	也可使用已在冷室中平衡至相应温度的非制冷微量离心机
制冷台式离心机	Eppendorf	5810R	摆桶式转子
Bio-Rad Benchmark Plus 微孔板分光光度计	Bio-Rad		推荐使用任何能够在593 nm波长下读数的微孔板分光光度计。若使用滤光片型酶标仪，应选择最接近的波长，并采用标准曲线法
Eppendorf MixMate（微孔板轨道摇床）	Eppendorf		这是一种用途广泛且可靠的微孔板混合器，非常适合本实验
通用缓冲液
磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4
MOPS缓冲盐水（MBS）；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，15 mM MOPS-Na+，pH 7.3
MBS + 5 mM D-葡萄糖（MBS/D）
HEPES缓冲盐水 + 5 mM D-葡萄糖（HBS/D）；137 mM NaCl，5.2 mM KCl，1.8 mM CaCl2•2 H2O，0.8 mM MgSO4•7 H2O，5 mM D-葡萄糖，20 mM HEPES-Na+，pH 7.3
细胞通透缓冲液（CPB；含0.1%皂苷的PBS）
通用化学品
L-抗坏血酸或L-抗坏血酸钠	Sigma-Aldrich		应选用最高纯度的试剂
脱氢-L-抗坏血酸（DHA）二聚体	Sigma-Aldrich	30790	水溶液理论上每摩尔DHA二聚体可生成2摩尔DHA单体
细胞松弛素B	Sigma-Aldrich	C6762	用DMSO或乙醇配制储备液
抗坏血酸氧化酶（AO）	Sigma-Aldrich	A0157	储备液（120 U/ml）可用PBS或MBS配制，分装后冷冻保存
铁氰化钾（FIC）	Sigma-Aldrich	455989	三水合物
Ferene-S（3-(2-吡啶基)-5,6-二(2-呋喃基)-1,2,4-三嗪-5′,5′′-二磺酸二钠盐）	Sigma-Aldrich	92940
L-谷氨酸钠	Sigma-Aldrich
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich
皂苷	Sigma-Aldrich	47036	配制0.1%储备液
细胞内抗坏血酸测定实验用储备液
3 M 醋酸钠（pH 6.0）
冰醋酸
0.2 M 柠檬酸
0.1 M 醋酸中的3.3 mM FeCl3
30 mM Ferene-S
50%（v/v）醋酸 + 30%（w/v）三氯乙酸（TCA）
抗坏血酸外排实验用储备液
AO（120 U/ml）
2.4 mM Ferene-S
0.6 mM 柠檬酸钠中的0.12 mM FeCl3