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方法文章

DNA交联聚丙烯酰胺凝胶的制备

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DOI：

10.3791/51323

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2014年8月27日

 , 
1New Jersey Neuroscience Institute, JFK Medical Center, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University, 3Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Rutgers University

本文内容

摘要

本实验室开发了DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶，这是一种动态水凝胶系统，旨在更深入地理解调控组织刚度对细胞功能的影响。本文提供了制备此类水凝胶的示意图、说明及操作方案。

摘要

机械生物学是一个新兴的科学领域，致力于研究物理信号在调控细胞形态和功能中的关键作用。例如，组织弹性对细胞功能的影响是机械生物学研究的一个重要方向，因为组织刚度会随着疾病、发育和损伤而发生变化。目前主要使用静态的模拟组织材料，即细胞接种后无法改变其刚度的材料，来研究组织刚度对细胞功能的影响。尽管静态研究获得的信息具有重要价值，但这些研究并不能反映细胞微环境的动态特性。 体内为了更好地研究动态刚度对细胞功能的影响，我们开发了一种DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶系统（DNA凝胶）。与其他动态基质不同，DNA凝胶在制备完成后无需外界刺激即可实现刚度的降低或增加。DNA凝胶由嵌入聚丙烯酰胺骨架中的DNA交联结构组成。通过递送单链DNA来添加或移除交联点，可实现对凝胶弹性在时间、空间上的可逆调控。我们先前的研究已表明，DNA凝胶弹性的动态调节可影响成纤维细胞和神经元的行为。在本报告及视频中，我们提供了描述DNA凝胶交联机制的示意图，以及制备DNA凝胶的分步操作指南。

引言

静态和动态基底是为研究组织弹性或刚度对细胞功能影响而开发的两类生物材料。静态基底在制备完成和/或细胞接种后，无法改变其物理特性。聚丙烯酰胺（PA）凝胶是用于力学生物学研究的首批二维静态基底5,17。PA凝胶易于制备、成本低廉、用途广泛，且可制备出具有广泛弹性模量范围的材料。尽管这些技术优势使PA凝胶成为常用的基底材料，但静态基底并不能反映体内细胞外基质（ECM）及周围细胞环境的动态特性。例如，ECM会因损伤、发育或疾病而发生刚度变化。因此，在力学生物学研究中，动态基底更受青睐，被视为更接近组织特性的模拟模型22,24,25。

已开发出多种合成的、天然的、二维的、三维的、静态的和动态的生物材料，以模拟组织刚度1,3,6,16,23,26。一些动态基质需要通过热、紫外光、电流、离子或pH变化来改变其力学性能2,4,7,8,12,15,16，但这些刺激可能限制水凝胶的生物应用。DNA交联的聚丙烯酰胺水凝胶（DNA凝胶）是一种动态二维弹性基质。通过向培养基或缓冲液中添加单链DNA（ssDNA），可实现对DNA凝胶刚度的时间、空间及可逆性调控9-11,13,14,18,21。与上述需施加刺激以调节弹性的动态凝胶不同，DNA凝胶依赖于所加ssDNA的扩散来改变弹性。因此，由于弹性调节速率依赖于凝胶厚度，细胞生长的上层凝胶表面成为最先被调控的区域。

DNA 凝胶与聚丙烯酰胺（PA）凝胶类似，均具有聚丙烯酰胺骨架，但其双丙烯酰胺交联结构被由 DNA 组成的交联结构所取代（图1）。两条单链 DNA（SA1 和 SA2）与一条交联链（L2）杂交，形成凝胶中的 DNA 交联结构。SA1 和 SA2 具有不同的序列，且在 5´ 端均含有 Acrydite 修饰，以有效整合到 PA 网络中。制备凝胶时，SA1 和 SA2 分别聚合进入 PA 骨架，随后将聚合后的 SA1 和 SA2 混合。再向 SA1 与 SA2 的混合物中加入交联链 L2。L2 的碱基序列与 SA1 和 SA2 的序列互补，可与 SA1 和 SA2 杂交，从而形成 DNA 交联结构。初始状态下，DNA 凝胶的弹性由 L2 的浓度和交联程度共同决定（表1 和 表2）。当 L2、SA1 和 SA2 含有等化学计量比时，所形成的凝胶最坚硬，因为此时 SA1 和 SA2 被 L2 完全交联（定义为 100% 凝胶）。较低浓度的 L2 会导致 DNA 交联比例降低，因此形成较软的 DNA 凝胶。目前已成功构建交联度低至 50% 的凝胶（定义为 50% 凝胶）9-11。

DNA连续编辑过程；示意图；使用SA1、SA2、R2的步骤；涉及光谱分析。
图1. DNA凝胶交联与去交联示意图9-11,13,14,18,21。 步骤1：SA1（红色）和SA2（蓝色）分别聚合到聚丙烯酰胺主链（黑色）中。聚合完成后，将SA1和SA2的聚合溶液混合。步骤2：加入L2（绿色），并与SA1及SA2杂交，形成凝胶的交联结构。步骤3：R2与L2的黏性末端发生杂交。步骤4：R2的黏性末端杂交推动L2从SA1和SA2上解链。

与PA凝胶不同，DNA凝胶在合成后可发生硬化或软化。因此，生长在DNA凝胶上的细胞可经历动态的刚度变化。为了使细胞附着的凝胶硬化，可在低交联度凝胶的培养基中加入L2，以增加交联比例。为了使细胞附着的凝胶软化，可去除L2以降低交联比例10,13,21。L2在3´端具有一段额外的趾端序列，使其能够从SA1和SA2上解离（表1）。L2的去除通过加入一条称为R2的逆转链实现。R2与L2全长互补，并首先与L2的趾端序列杂交。趾端杂交促使L2从SA1和SA2上逐步解链，从而消除交联，降低凝胶刚度。

本报告及视频中提供了制备硬化和软化 DNA 凝胶的逐步操作说明。尽管文中描述了 100% 和 80% 凝胶的制备方法，但该方案可进行调整，以制备其他初始和最终交联百分比的 DNA 凝胶。通常，制备 100% 和 80% 凝胶后，将其固定在玻璃盖玻片上，进行功能化处理，并接种细胞。接种细胞 48 小时后，向 80% 凝胶的培养基中加入 L2，向 100% 凝胶的培养基中加入 R2。向培养基中添加 L2 可使 80% 凝胶硬化至 100% 交联状态，而添加 R2 则可使 100% 凝胶软化至 80% 交联状态。在文中，硬化后的凝胶记为 80→100% 凝胶，软化后的凝胶记为 100→80% 凝胶。对于对照组或静态凝胶，向另一组 100% 和 80% 凝胶中加入由 T 或 A 组成的 ssDNA。在弹性调控至少两天后，可对细胞进行处理和分析。

DNA 交联碱基数序列（启动区）修饰熔解温度 (Tm, °C)备注
5'→3'
设计 1SA110GCA CCT TTG C5' Acrydite34.9
SA210GTC AGA ATG A5' Acrydite23.6
L230TCA TTC TGA CGC AAA GGT GCG CTA CAC TTG56包含一个 10 bp 的启动区序列。
R230CAA GTG TAG CGC ACC TTT GCG TCA GAA TGAR2 与 L2 互补
设计 2SA114CGT GGC ATA GGA CT5' Acrydite46.9
SA214GTT TCC CAA TCA GA5' Acrydite40.2
L240TCT GAT TGG GAA ACA GTC CTA TGC CAC GGT TAC CTT CAT C65.9包含一个 12 bp 的启动区序列。
R240GAT GAA GGT AAC CGT GGC ATA GGA CTG TTT CCC AAT CAG A65.9R2 与 L2 互补
设计 3SA120ACG GAG GTG TAT GCA ATG TC5' Acrydite55
SA220CAT GCT TAG GGA CGA CTG GA5' Acrydite56.6
L240TCC AGT CGT CCC TAA GCA TGG ACA TTG CAT ACA CCT CCG T68.8未包含启动区。
对照对照20-40AAA AAA (等等) 或
TTT TTT (等等)

表1. 单链DNA的碱基序列9-11,13,14,18,21。 细胞和力学研究已采用多种不同的交联设计，以生成具有不同静态和动态力学性能的DNA凝胶。交联设计中可调节的参数包括碱基序列、序列长度或交联长度。加粗且斜体的字体分别表示SA1与L2之间以及SA2与L2之间的碱基配对。

设计
123
丙烯酰胺浓度 (%)1010104
SA1 与 SA2 杂交至 L2 的比例 (% 交联)50801005080100100100
弹性模量 (kPa, 均值±标准误)6.6 ± 0.617.1 ± 0.829.8 ± 2.55.85± 0.6212.67 ± 1.3322.88 ± 2.7725.2 ± 0.510.4 ± 0.6

表2. DNA凝胶的杨氏模量（E）9-11,13,14,18,21。 DNA凝胶中的丙烯酰胺浓度、交联百分比和交联长度均可调节。设计1、2和3的交联长度分别为20、28和40个碱基对（bp）。所有设计的100%凝胶具有相似的模量，表明交联长度不影响凝胶的弹性。然而，丙烯酰胺浓度的变化会改变DNA凝胶的弹性。

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方案

注意：从凝胶制备到细胞处理的整个实验流程至少需要六天。凝胶制备预计需要8小时，另加一次过夜孵育。凝胶固定化与DNA退火预计需要8小时，另加一次过夜冲洗步骤。凝胶功能化预计需要2小时。细胞接种与培养时间取决于培养类型和具体应用，但至少需要四天。

1. DNA 凝胶的制备

注意：DNA 凝胶的制备分为三个独立步骤。第一步，将 SA1 和 SA2 单链 DNA 分别聚合到 PA 骨架中。这两种溶液分别称为 SA1 聚合溶液和 SA2 聚合溶液（§1.1）。第二步，溶解交联剂、可逆链和对照单链 DNA。将冻干的 L2 单链 DNA（交联剂）溶解，所得溶液称为 100% L2 溶液，用于制备 100% 凝胶（§1.2）。取部分 100% L2 溶液稀释至 80%，称为 80% L2 溶液，用于制备 80% 凝胶。将冻干的 R2（可逆链）和对照单链 DNA 溶解，用于 §4。第三步，按 10:10:6（SA1:SA2:L2）的比例混合 SA1 聚合溶液、SA2 聚合溶液与 100% 或 80% L2 溶液，分别形成 100% 和 80% 凝胶（§1.3）。

1. SA1 和 SA2 聚合溶液的制备

  1. 从表1和2中选择并订购合适的SA1、SA2、L2和R2碱基序列。碱基序列及序列长度已在先前的研究中优化9-11,13,14。
  2. 计算所有溶液的配制方案（表3-4）。注意：为便于故障排查，需仔细记录所有计算过程。建议建立Excel模板，可重复用于DNA凝胶的制备。有关设计2的表格示例，请参见表3和4（对应表1和2）。本方案中将使用表4中指定的体积，但具体体积会因每批冻干单链DNA的不同而有所变化。
溶液溶液的储存浓度SA1 或 SA2 聚合溶液中储存溶液所占比例 (v/v)溶液在 SA1 或 SA2 聚合溶液中的终浓度
丙烯酰胺（无双丙烯酰胺）40%2510%
SA1 或 SA2 溶液100%6060%
TBE 缓冲液10x101x
TEMED20%2.50.50%
APS2%2.50.05%

表3. 制备SA1或SA2聚合溶液所需各组分的百分比。 第一列为用于配制DNA凝胶的溶液；第二列为这些溶液的储备浓度；第三列为储备溶液在SA1或SA2聚合溶液中所占的体积百分比（v/v）；最后一列显示SA1和SA2溶液中的终浓度。

溶液组分
溶液储存浓度 终溶液浓度计算方法需添加量备注
ssDNA 溶液（§1.1）
SA1 溶液320.7 nmol 冻干 SA1 ssDNA3.00 mM320.7 nmol / 3.00 nmol μl-1 = 107 µl向冻干 ssDNA 中加入 107 µl TE 缓冲液SA1 溶液占 SA1 聚合溶液的 60%。
107 µl / 0.600 = 178 µl
178 µl 为 SA1 聚合溶液的总体积（表 3）。
SA2 溶液324.4 nmol 冻干 SA2 ssDNA3.00 mM324.4 nmol / 3.00 nmol μl-1 = 108 µl向冻干 ssDNA 中加入 108 µl TE 缓冲液SA2 溶液占 SA2 聚合溶液的 60%。
108 µl / 0.600 = 180 µl
180 µl 为 SA2 聚合溶液的总体积（表 3）。
100% L2 溶液657.4 nmol 冻干 L2 ssDNA3.00 mM657.4 nmol / 3.00 nmol μl-1 = 219 µl向冻干 ssDNA 中加入 219 µl TE 缓冲液将一份 100% L2 溶液稀释为 80% L2 溶液
80% L2 溶液80 µl 的 100% L2 ssDNA80%—向 80 µl 的 100% L2 溶液中加入 20 µl TE 缓冲液
对照溶液332.6 nmol 冻干 poly T 或 A ssDNA3.00 mM332.6 nmol / 3.00 nmol μl-1 = 111 µl向冻干 ssDNA 中加入 111 µl TE 缓冲液
R2 溶液193.8 nmol 冻干 R2 ssDNA3.00 mM193.8 nmol / 3.00 nmol μl-1 = 64.6 µl向冻干 ssDNA 中加入 64.6 µl TE 缓冲液
聚合溶液（§1.2）
SA1 聚合溶液40% 丙烯酰胺10%178 µl x 0.25 = 44.5 µl45 µl根据 178 µl 的总体积计算丙烯酰胺、TBE、APS 和 TEMED 的用量（见上文及 表 3）。
10x TBE1x178 µl x 0.10 = 17.8 µl18 µl
100% SA1 溶液60%—107 µlSA1 溶液占 SA1 聚合溶液的 60%（见上文及 表 3）。
2% APS0.05%178 µl x 0.025 = 4.45 µl4.5 µl在加入 TEMED 前先加入并混匀 APS。
20% TEMED0.50%178 µl x 0.025 = 4.45 µl4.5 µl
SA2 聚合溶液40% 丙烯酰胺10%180 µl x 0.25 = 45 µl45 µl根据 180 µl 的总体积计算丙烯酰胺、TBE、APS 和 TEMED 的用量（见上文及 表 3）。
10x TBE1x180 µl x 0.10 = 18 µl18 µl
100% SA2 溶液60%—108 µlSA2 溶液占 SA2 聚合溶液的 60%（见上文及 表 3）。
2% APS0.05%180 µl x 0.025 = 4.5 µl4.5 µl在加入 TEMED 前先加入并混匀 APS。
20% TEMED0.50%180 µl x 0.025 = 4.5 µl4.5 µl
凝胶溶液（§1.3）
100% 凝胶溶液100% SA1 聚合溶液10 份—10 µl以 SA1:SA2:L2 = 10:10:6 的比例配制 100% 凝胶。
100% SA2 聚合溶液10 份—10 µl
100% L2 溶液6 份—6 µl
80% 凝胶溶液100% SA1 聚合溶液10 份—10 µl以 SA1:SA2:L2 = 10:10:6 的比例配制 80% 凝胶。
100% SA2 聚合溶液10 份—10 µl
80% L2 溶液6 份—6 µl
动态凝胶（§3-4）
80→100% 凝胶80% 凝胶100% 凝胶计算 1：向培养基中加入 1 µl 的 100% L2 溶液计算基于盖玻片上 20 µl 的凝胶。首先，将 20 µl 凝胶中 100% L2 溶液的份数换算为 µl；其次，计算为实现额外 20% 交联所需的 100% L2 溶液量（以 µl 计）。将此量的 100% L2 溶液加入凝胶中。
(20 µl / 26 份) x 6 份 = 4.6 µl
计算 2：
5 µl x 0.2 = 1 µl
100→80% 凝胶100% 凝胶80% 凝胶计算 1：向培养基中加入 1 µl 的 100% R2 溶液计算基于盖玻片上 20 µl 的凝胶。首先，将 20 µl 凝胶中 100% L2 溶液的份数换算为 µl；其次，计算为构成 20% 凝胶所需移除的 100% L2 溶液量（以 µl 计）。将此量的 R2 溶液加入凝胶中。
(20 µl / 26 份) x 6 份 = 4.6 µl
计算 2：
5 µl x 0.2 = 1 µl
100% 凝胶（对照）100% 凝胶100% 凝胶—向培养基中加入 1 µl 对照溶液对照溶液的用量与所加 R2 溶液的量相等。
80% 凝胶（对照）80% 凝胶80% 凝胶—向培养基中加入 1 µl 对照溶液对照溶液的用量与所加 100% L2 溶液的量相等。

表4. DNA凝胶制备的计算示例。 提供了模拟数值，用于说明制备80%、100%、100→80%和80→100%凝胶的计算方法。DNA凝胶对应表1中的设计2。

  1. 将冻干的 SA1 ssDNA 在 2,000 × g 条件下离心 15 秒，以确保所有 ssDNA 沉至离心管底部。注意：SA1 溶液的正确浓度对 DNA 凝胶合成至关重要。
  2. 通过向管中加入 107 µl 的 1× Tris-EDTA（pH 8.0）缓冲液（TE 缓冲液）来制备 3 mM 的 SA1 溶液（表 3-4）。
  3. 将 SA1 在 TE 缓冲液中于 70 °C 加热 5 分钟，或直至 ssDNA 沉淀完全溶解。注意：加热温度应至少高于熔解温度（Tm）5 °C，以确保 DNA 处于单链状态。
  4. 通过加入指定百分比的 40% 丙烯酰胺和 10× Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液来制备 SA1 聚合溶液（表 3）。在此示例中，分别向 107 µl SA1 溶液中加入 45 µl 和 18 µl（表 4）。
  5. 用氮气脱气 3 分钟以促进混合。将连接至氮气源的 p200 吸头插入溶液中，缓慢使氮气通过溶液。在对 SA1 溶液脱气前，应先在水中测试氮气流速，以防止溅出。
  6. 在 2,000 × g 条件下离心 15 秒，收集溶液。
  7. 加入 4.5 µl 的 2% 过硫酸铵（APS，表 3-4），以启动凝胶聚合。
  8. 反复倒置试管数次以混匀。
  9. 在 2,000 × g 条件下离心 15 秒，收集溶液以实现均匀聚合。
  10. 加入 4.5 µl 的 20% 四甲基乙二胺（TEMED，表 3-4），以催化聚合反应。
  11. 反复倒置试管数次以混匀。
  12. 在 2,000 × g 条件下离心 15 秒，收集溶液以实现均匀聚合。
  13. 用氮气脱气 3–5 分钟，以完成聚合并减少未反应的单体。
  14. 在室温下孵育 10 分钟以完成聚合。注意：此溶液称为 SA1 聚合溶液。
  15. 对冻干的 SA2 ssDNA 重复步骤 1.1.3–1.1.16，但分别向 108 µl SA2 溶液中加入 45、18、4.5 和 4.5 µl 的丙烯酰胺、TBE、APS 和 TEMED（表 3-4）。注意：SA1 和 SA2 聚合溶液可在 4 °C 下保存长达一个月。

2. L2、R2 和对照溶液的制备

  1. 使用冻干的 R2 单链 DNA 重复步骤 1.1.3–1.1.5，但加入 64.4 µl 的 TE 缓冲液（表 4）。
  2. 使用冻干的对照单链 DNA 重复步骤 1.1.3–1.1.5，但加入 111 µl 的 TE 缓冲液（表 4）。
  3. 使用冻干的 L2 单链 DNA 重复步骤 1.1.3–1.1.5，但加入 219 µl 的 TE 缓冲液（表 4）。注意：此为 100% L2 溶液。将 100% L2 溶液加入 SA1 和 SA2 聚合溶液中（见 §1.3）将形成 100% 交联的 DNA 凝胶（100% 凝胶），因为 SA1、SA2 和 L2 的化学计量比相等。
  4. 取一份 100% L2 溶液，加入 20 µl 1× TE 缓冲液至 80 µl 的 100% L2 溶液中，将其稀释为 80% 溶液（表 4）。注意：此溶液为 80% L2 溶液。将 80% L2 溶液加入 SA1 和 SA2 聚合溶液中（见 §1.3）将形成 80% 交联的 DNA 凝胶（80% 凝胶），因为仅有 80% 的 SA1 和 SA2 会与 L2 交联。溶液可在 4 °C 下保存最多一个月。

3. 凝胶溶液的制备

  1. 将SA1和SA2聚合溶液在70 °C下加热，直至溶液黏度降低（约1分钟）。若溶液仍过于黏稠而难以移液，则将温度升至80 °C。
  2. 将10 µl或10份SA1聚合溶液加入10 µl或10份SA2聚合溶液中（表4）。注意：SA1和SA2聚合溶液极为黏稠，难以移液。由于浓度对凝胶形成至关重要，从此时起应使用正位移移液器，或参见讨论部分了解其他操作技术。此外，应分多次小体积（>20 µl）移取，而非一次性移取大体积。
  3. 通过交替加热（70 °C下15秒）和搅拌（用移液枪头搅拌15秒）的方式混合SA1和SA2聚合溶液，总时长为1分钟。
  4. 加入6 µl或6份100% L2溶液以形成100%凝胶（表4）。
  5. 按照步骤1.3.3所述方法，通过交替加热和搅拌进行混合。
  6. 在最佳退火温度（35 °C）下加热凝胶1小时。退火温度的计算方法为：从ssDNA序列中最低熔解温度减去5 °C（表1）。
  7. 将100%凝胶移液至60 mm培养皿中。
  8. 在室温下孵育凝胶4小时，使DNA交联继续复性杂交。
  9. 用含钙和镁的PBS覆盖凝胶，并在室温下过夜孵育。注意：凝胶体积将膨胀至初始体积的约3倍。此外，凝胶将与缓冲液达到平衡，过量的丙烯酰胺将从凝胶中扩散出来。PBS中的钙和镁可稳定DNA杂交结构，并防止凝胶破裂（参见讨论部分了解凝胶破裂的故障排除方法）。
  10. 从培养皿中移除剩余缓冲液。
  11. 为制备80%凝胶，重复步骤1.3.1–1.3.10，但在步骤1.3.4中将100% L2溶液替换为80% L2溶液。100%和80%凝胶可在4 °C下保存长达一个月。注意：80%与100%凝胶之间的硬度差异在物理上可区分。

2. 凝胶在玻璃上的固定

注意：将100%或80%凝胶的等分试样固定在玻璃盖玻片上（图2）。

  1. 将100%凝胶在70 °C加热约30秒，或直至凝胶黏度降低，便于移液。
  2. 将玻璃盖玻片放置于70 °C的加热块上，加热1-2分钟。
  3. 向每片玻璃盖玻片上添加一滴光学胶黏剂。
  4. 向每片玻璃盖玻片上加入20 µl的100%凝胶（表4）。注意：每片盖玻片可点样10-30 µl。
  5. 让凝胶融化并覆盖整个玻璃盖玻片。注意：若凝胶融化后表面不平整，可用硅化处理的玻璃盖玻片压平。然而，在后续步骤中凝胶会进一步溶胀，可能导致表面不平整。
  6. 将带有凝胶的玻璃盖玻片从加热块上取下，放入24孔组织培养板中。
  7. 对80%凝胶重复步骤2.1-2.6。
  8. 在最佳退火温度（35 °C）下加热凝胶1小时。注意：凝胶在加热过程中变干是正常现象，后续在PBS中孵育时可恢复。
  9. 将含有80%和100%凝胶的培养板暴露于紫外光（UV，365 nm）下照射15分钟。注意：紫外照射可同时固化胶黏剂并对凝胶进行灭菌。若无紫外交联仪，可将凝胶置于生物安全柜内配备的紫外灯下照射。紫外照射后，本实验方案的后续操作均应在生物安全柜内进行，以保持凝胶无菌状态。此外，此后应使用无菌溶液。
  10. 在室温下让DNA交联结构复性4小时。
  11. 加入PBS，并在4 °C下孵育过夜。注意：PBS孵育可清洗、平衡并再次溶胀凝胶，因为反复加热可能导致凝胶脱水。

胶原蛋白包被过程示意图；凝胶圆片在紫外光照射下用于细胞外基质的固定。
图 2. 凝胶固定化与功能化的示意图。 在制备DNA凝胶（灰色）后，通过光学胶（绿色）将凝胶固定在玻璃盖玻片（白色）上。凝胶通过紫外光同时完成固化和灭菌。溶胀后，凝胶厚度约为1 mm。随后，凝胶通过两步法进行功能化（红色框线标示）。第一步，通过紫外光照射将磺基-SANPAH与凝胶表面的丙烯酰胺偶联；第二步，将凝胶与胶原蛋白或多聚-D-赖氨酸孵育，使其连接至磺基-SANPAH中的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。该图已根据文献10进行修改。

3. 凝胶功能化

注意：由于聚丙烯酰胺凝胶为惰性材料，因此需要对DNA凝胶进行功能化处理以实现细胞黏附（图2）。本节将通过两个步骤对凝胶进行功能化处理。首先，通过硝基苯基叠氮基团的光解作用，将N-磺基琥珀酰亚胺-6-(4'-叠氮-2'-硝基苯氨基)己酸酯（sulfo-SANPAH）共价连接至DNA凝胶的聚丙烯酰胺骨架上。其次，胶原蛋白或聚-D-赖氨酸中的伯胺基团将与sulfo-SANPAH中的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯结合，从而将蛋白质固定在凝胶表面。

  1. 使用移液器移除孔中的缓冲液，并注意不要吸出凝胶。注意：请勿进行真空抽吸，以降低吸出凝胶的风险。
  2. （可选）在室温下用 PBS 洗涤凝胶三次，每次 15 分钟，以去除多余的丙烯酰胺单体、TEMED 和 APS。
  3. 每块凝胶加入约 300 µl 的 sulfo-SANPAH，确保完全覆盖凝胶表面。
  4. 将凝胶置于 365 nm 紫外光下照射 5 分钟。
  5. 移除 sulfo-SANPAH 溶液。
  6. 用 PBS 冲洗凝胶一次，以去除残留的 sulfo-SANPAH。
  7. 重复步骤 3.3–3.6。
  8. 将凝胶在约 300 µl 的 0.2 mg/ml 多聚-D-赖氨酸溶液中孵育 1 小时（室温）或过夜（4 °C）。注意：也可选择在 4 °C 下用 0.2 mg/ml I 型胶原蛋白溶液过夜孵育凝胶。
  9. 用 PBS 洗涤凝胶两次，每次 5 分钟，以去除多余的多聚-D-赖氨酸。
  10. 将凝胶在约 300 µl 培养基中孵育 30 分钟，以平衡凝胶状态。
  11. 在接种细胞前立即移除培养基。

4. 细胞培养与成像

注意：本节提供细胞接种后凝胶软化或硬化现象的详细说明。由于以下多个原因，本文未提供详细的细胞培养方案。首先，多种细胞类型均可黏附于DNA凝胶上，而每种细胞类型在接种时均需研究人员进行特定的调整。其次，这些实验所采用的均为标准的细胞与组织培养技术，相关内容可在大量原始研究论文、技术文章及参考书籍中找到。有关成纤维细胞和神经元在DNA凝胶上接种的具体技术，可参见以往的出版文献9-11,19-21。

  1. 接种细胞。有关本文中提到的神经元或成纤维细胞的分离和/或培养方案，请参考以下出版物之一9-11,19-21。
  2. 至少48小时后，通过移液将1 µl的对照液、L2或R2溶液滴加至凝胶附近，以调节凝胶硬度（表4）。
    1. 为使凝胶交联度从80%增加至100%（80→100%凝胶），在80%凝胶附近加入1 µl的100% L2溶液，以补足剩余20%的L2。
    2. 为使凝胶交联度从100%降低至80%（100→80%凝胶），在100%凝胶附近加入1 µl的100% R2溶液，通过添加R2去除20%的交联。
    3. 对照组处理：在部分80%和100%凝胶附近分别加入1 µl对照溶液，确保加入体积相等。
  3. 在至少48小时后，进行所需的细胞处理和数据分析。

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结果

在本研究之前，细胞-细胞外基质（ECM）相互作用通常在静态且力学性能恒定的生物材料上，或在不可逆且单向变化的动态基底上进行观察。这些基底无法准确反映细胞微环境的动态特性。我们的工作通过提供一种更接近生理条件的模型，推动了现有技术范式的转变，使细胞-ECM相互作用能够在发生软化和硬化变化的动态生物材料上进行研究。在先前的研究中，我们通过分析细胞在这些凝胶上的多种形态和表型，评估了动态基底对细胞的影响。其中一个例子中，我们通过在动态DNA凝胶上评估成纤维细胞的形态，确定了基底硬化对成纤维细胞的影响。将来源于小鼠的L929成纤维细胞接种于80%和100%交联度的凝胶上（图3）11。接种后两天，向80%凝胶的培养基中加入20%额外的L2溶液，使凝胶硬化至100%交联状态（80→100%，中图）。100%凝胶和另一组80%凝胶则加入对照单链DNA（ssDNA），以维持其静态状态（右图和左图分别对应）。在向培养基中加入DNA两天后采集明场显微图像。如图3所示，图像模糊是由于凝胶表面不平整所致，属于典型且不可避免的现象。缓冲液和L2的加入引起的凝胶溶胀与收缩

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讨论

DNA凝胶在细胞黏附前后能够发生软化或硬化，这一特性使其成为研究动态组织刚度对细胞功能影响的理想模型。这三种设计均已用于力学和生物学研究中。然而，在不同交联百分比下，这三种设计的弹性相似，表明DNA凝胶的弹性不受交联长度的影响（表2）。相比之下，丙烯酰胺浓度会影响凝胶的弹性。这些设计在交联动力学方面可能存在差异，因为凝胶破裂倾向（即凝胶在培养基或缓冲液中溶解的趋势）随交联长度的增加而降低。然而，目前关于DNA凝胶的动力学信息仍然有限，但我们已知在L2递送至50% DNA凝胶后两天，还会额外发生约30%的交联11。尽管如此，凝胶软化和硬化分别产生扩张力和收缩力的现象不可避免，且无法分离18,21。100→70%的凝胶可产生约0.5 Pa的应力21，而50→100%的凝胶仅产生约0.04 Pa的应力，因为三条单链DNA之间形成化学键需要消耗更多能量18。因此，对实验结果的解读必须考虑凝胶硬化和软化所引起的应力与应变。

在制备DNA凝胶时可能会遇到技术挑战。最常见的技...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此致谢：Frank Jiang 博士、David Lin 博士、Bernard Yurke 博士和 Uday Chippada 博士在开发 DNA 凝胶技术方面的贡献；Norell Hadzimichalis 博士、Smit Shah、Kimberly Peterman 和 Robert Arter 对本稿件提出的评论与修改意见；资助机构包括新泽西州脊髓研究委员会（资助号 #07A-019-SCR1，N.A.L.）和新泽西神经科学研究所（M.L.P.）；以及《组织工程，A 部分》（Tissue Engineering, Part A）出版社授权重印图 2和图 4，以及《生物材料》（Biomaterials）出版社授权重印图 3。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
单链DNA（ssDNA）Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)
idtdna.com		切勿涡旋混匀ssDNA。应轻柔颠倒管体和/或使用移液器轻轻吹打混匀。
含钙和镁的PBS任何品牌均可。
100倍浓度Tris-EDTA缓冲液（TE缓冲液）Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)
sigmaldrich.com		T9285
10倍浓度Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE缓冲液）Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)93290TBE为生殖毒性物质。
40%丙烯酰胺溶液Fisher Scientific (Pittsburg, PA)BP14021丙烯酰胺为有毒物质。
过硫酸铵（APS）Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)A3678用TE缓冲液配制2%溶液。APS为有毒且具刺激性的物质。
四甲基乙二胺（TEMED）Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)T9281用TE缓冲液配制20%溶液。TEMED易燃、具腐蚀性且为有毒物质。
直径12 mm圆形盖玻片Fisher Scientific (Pittsburg, PA)
fishersci.com		12-545-82
Norland光学胶72（Norland optical adhesive 72）Norland Products (Cranbury, NJ)
norlandprod.com		NOA72
24孔组织培养板任何品牌均可。
微量离心管任何品牌均可。
磺基-SANPAH（Sulfo-SANPAH）ProteoChem 或 Thermo Fisher (Rockland, IL)
proteochem.com 或 thermofisher.com		C111 或 22589使用前立即用水配制0.315 mg/ml溶液。在37 °C下溶解并过滤除菌。滤膜上残留未溶解的磺基-SANPAH属正常现象。磺基-SANPAH对光敏感，因此溶液在紫外照射前应避光保存。
多聚-D-赖氨酸（PDL）Sigma-Aldrich (St. Loius, MO)P6407用水配制0.2 mg/ml溶液，并过滤除菌。
I型胶原蛋白（Collagen Type I）Affymetrix (Santa Clara, CA)
affymetrix.com		13813用0.2 N乙酸配制0.2 mg/ml溶液。溶液必须始终保持低温，以防止聚合。乙酸为易燃、有毒且具腐蚀性的物质。
22 × 60 盖玻片Fisher Scientific (Pittsburg, PA)12-544-G
正向置换移液器Gilson, Inc (Middletown, WI)
gilson.com		F148504
加热金属块（Heat block）Fisher Scientific (Pittsburg, PA)11-718
紫外光源（UV light source）将凝胶尽可能靠近紫外光源放置。紫外光可能造成皮肤或眼睛损伤。
温度计任何品牌均可。
氮气GTS-Welco (Flemington, NJ)
www.praxairmidatlantic.com/		NI 5.0UH-R

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