白细胞向肝脏的募集发生在由独特的肝窦内皮细胞衬覆的肝窦特殊通道中。在生理剪切应力条件下，通过相差显微镜观察白细胞跨越人肝窦内皮的过程，有助于阐明该过程背后的分子机制。
本文内容
摘要
摘要
白细胞浸润人肝组织是所有成人炎症性肝病中的常见过程。慢性浸润可促进肝纤维化的发展并推动疾病进展为肝硬化。了解介导白细胞向肝脏募集的分子机制，有助于发现肝病的重要治疗靶点。白细胞募集过程中的关键相互作用是炎症细胞在剪切应力条件下与内皮细胞的相互作用。肝脏内的募集发生在肝窦内低剪切力的通道中，这些通道由肝窦内皮细胞（HSEC）所衬覆。通过以特定流速将白细胞灌注过由人HSEC单层细胞衬覆的通道，可模拟肝窦内的微环境条件。在此条件下，白细胞首先经历短暂的黏附（tethering），随后被激活并牢固黏附，继而爬行并最终穿过内皮层发生跨内皮迁移。利用相差显微镜，可对这一“黏附级联”过程的每一步进行可视化观察和录像，之后进行离线分析。可通过在实验前用抑制剂预处理内皮细胞或白细胞，以确定特定分子在此过程中的作用。
引言
目前已有充分证据表明，白细胞的募集过程通常遵循多步骤黏附级联反应的范式1。该过程首先由血管壁内皮细胞捕获流动血液中的白细胞。初始阶段，白细胞通过选择素受体或免疫球蛋白超家族成员介导的相互作用发生滚动。这一过程使得白细胞表面表达的G蛋白偶联受体（GPCRs）可被内皮细胞糖萼上呈递的趋化因子所激活。随后，白细胞表面的整合素构象发生改变，转变为“高亲和力”状态，从而导致白细胞停滞并牢固黏附于内皮细胞。牢固黏附之后，白细胞发生形态改变并在血管内皮表面爬行。最后一步是白细胞穿过内皮单层，即跨内皮迁移，该过程可通过细胞间途径或跨细胞途径实现。
尽管多步骤黏附级联反应描述了白细胞在体内募集的普遍机制，但不同器官之间存在特异性差异。在肝脏中，大多数白细胞的募集发生在肝窦内，而其他器官的白细胞募集通常发生在毛细血管后微静脉中2。肝窦是一个低剪切力环境，白细胞在发生牢固黏附之前会经历短暂的黏附捕获阶段，该过程不依赖于选择素2。这些通道由肝窦内皮细胞衬覆，后者具有不连续结构，含有直径为100–200 nm的开放性窗孔，且缺乏基底膜3。阐明介导白细胞穿越人肝窦内皮分子机制，可能有助于发现针对炎症性肝病的器官特异性治疗靶点。
流式黏附实验是研究白细胞募集的关键工具。该实验可在剪切应力存在的条件下重建白细胞募集过程，从而在明确定义的力学条件下分析细胞黏附行为。该实验最常见的用途是研究白细胞对培养的内皮单层细胞或纯化基质的黏附。 commercially available flow chambers 可用于在两层平面之间以层流条件灌注细胞，并在显微镜下观察黏附的动态过程4。先前的研究团队已证明，某些黏附相互作用仅在流动条件下发生，无法通过静态实验进行研究5,6。
我们已采用该技术重建肝窦结构，并在低剪切应力条件下研究白细胞的募集过程。将原代人肝窦内皮细胞（HSEC）培养于微流控载片中，随后以计算好的流速将白细胞灌注于该单层细胞上，以模拟肝窦内的剪切应力环境。剪切应力是指平行或切向作用于表面的应力，与垂直作用的正应力相对。任何沿边界流动的流体都会对该边界施加剪切应力。已有研究表明，剪切应力是淋巴细胞跨内皮迁移过程中必不可少的因素7。在此条件下，可通过相差显微镜观察黏附级联反应的每一个步骤。该方法为深入理解肝脏内白细胞的募集机制提供了重要见解，包括对传统黏附分子8、趋化因子及其受体作用的研究9-11， 以及血管黏附蛋白-1（VAP-1）8,12和共同淋巴管及血管内皮受体-1（CLEVER-1）13等非典型黏附分子的研究。尽管本实验方法已在我们课题组的多篇论文中被提及，但此前描述较为简略。借此机会，我们提供一份详细的分步操作指南，以帮助解决实验中的技术问题并避免操作错误。此外，我们近期更换了微流控载片的来源，使得剪切应力的精确调控成为可能。我们认为这将拓宽该实验方法在其他内皮细胞和免疫细胞研究中的应用范围。以下方法详细描述了利用人肝窦内皮细胞与外周血淋巴细胞进行基于流动的黏附实验的准备步骤与操作技术。
方案
1. 微型载玻片制备
- 使用大鼠尾部I型胶原蛋白（RTC，用PBS按1:100稀释，得到工作浓度为220 µg/ml）预包被六通道显微载片。操作方法为：将30 µl稀释后的RTC溶液直接注入通道中，在37 °C孵育2小时，随后用PBS洗涤三次。
2. 在微载玻片中接种细胞
- 用胰蛋白酶-EDTA 消化一个汇合的 T75 培养瓶中培养的人肝窦内皮细胞（HSEC）（细胞自肝组织分离，方法如前所述13），在 PBS 中洗涤，并以 3 × 106 个细胞/ml 的浓度重悬于完全培养基中（人内皮基础培养基添加 2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素和 100 µg/ml 链霉素、10% 热灭活 AB 型人血清、10 ng/ml 血管内皮生长因子和 10 ng/ml 肝细胞生长因子）。将 30 µl 细胞悬液直接注入每个通道中。
- 将载玻片架置于 37 °C、5% CO2 的湿化培养箱中，使细胞贴壁 1 小时。待细胞贴壁后，向每个通道两侧的加样口加入完全培养基（图 1）。
3. 细胞因子刺激细胞
- 将细胞置于培养箱中孵育 24 小时。使用倒置相差显微镜评估细胞生长情况。在进行黏附实验前 24 小时，通过更换培养基为添加了肿瘤坏死因子 α 和干扰素 γ（两者浓度均为 10 ng/ml）的完全培养基，刺激内皮单层细胞。
4. 外周血淋巴细胞的分离
- 通过密度梯度离心法，使用适当的细胞分离介质在800 × g 条件下离心25分钟，从全血中分离单个核细胞组分，从而获得外周血淋巴细胞。将细胞在塑料培养皿中孵育1小时，使单核细胞贴壁。
- 单核细胞贴壁后，吸除富含淋巴细胞的上清液。洗涤淋巴ocytes，并将其重悬于流式培养基中（内皮基础培养基含0.1% (v/v) 牛血清白蛋白（BSA）），通常浓度为1 × 106 个细胞/ml。
5. 使用抑制剂对内皮细胞或白细胞进行预处理
- 在内皮细胞培养基/0.1% (v/v) BSA 中配制推荐稀释浓度的功能阻断抗体或小分子抑制剂。在流动实验开始前30分钟，用阻断抗体/抑制剂溶液替换选定微载玻片通道中的完全培养基。
- 若计划对淋巴细胞上的趋化因子受体进行预处理，将分离的白细胞重悬于含有0.1% (v/v) BSA的RPMI溶液中，并加入200 ng/ml百日咳毒素孵育，以阻断趋化因子受体的G蛋白偶联受体活性；或者，按推荐稀释比例稀释特异性趋化因子受体功能阻断抗体或小分子抑制剂。将白细胞在37 °C孵育30分钟，然后洗涤并重悬于流动培养基中。
6. 流式分析系统的设置
- 将一个带有温控功能的透明腔室预热至 37 °C。该腔室应设有硅胶管插入孔和电子接口，用于连接电磁阀，从而实现细胞与培养基之间的切换，且几乎无死体积。将腔室安装在倒置显微镜上，以便进行相差显微观察。图2展示了流动实验腔室、显微镜以及放置在显微镜载物台上的微流通道载片。
- 用带有鲁尔锁扣的 50 ml 玻璃注射器预先抽取 10 ml 无菌蒸馏水，并在注射器接口上连接一段 25 cm 长的硅胶管，然后将注射器安装到注射泵中。根据微流通道载片制造商的说明调节注射泵的抽吸速率，以维持 0.05 Pa（0.5 dyne/cm2）的剪切应力，图3。
- 取两个 5 ml 注射器，移除活塞，将筒体通过硅胶管连接至电磁阀的两个进流口。
- 在出流阀端连接一段 12 cm 长的硅胶管。该阀可交替通入无细胞的洗涤缓冲液（内皮细胞培养基/0.1% (v/v) BSA）和淋巴细胞悬液。
- 通过向两个注射器筒体内注入洗涤缓冲液，冲洗电磁阀，确保缓冲液从一个筒体经阀门流入出流硅胶管。
- 使用阀门开关切换至另一筒体，确认缓冲液正常流动并排除系统内所有气泡。从其中一个筒体中移除洗涤缓冲液，替换为淋巴细胞悬液，图4a。
- 通过微流通道载片适配器，将注射泵的硅胶管连接至选定微流通道载片的一个端口；再通过另一个适配器，将出流阀的硅胶管连接至载片的对侧端口。连接前务必确保硅胶管和适配器内部充满洗涤缓冲液，以防止气泡进入系统，图4b。
- 将微流通道载片连接至流动系统后，将其放置在显微镜载物台上，并用夹子或胶带固定以防止移动。将显微镜调至 10X 物镜并设置相应的相差模式。通过目镜观察，确保内皮单层细胞清晰成像并处于焦点。确认可通过连接在显微镜上的相机采集图像，并将图像传输至显示器进行记录。
7. 流动实验技术及黏附分析的记录
- 启动注射泵回抽，以清洗缓冲液灌注内皮层2分钟，去除碎片或未结合的封闭抗体，然后切换阀门，使白细胞溶液在0.05 Pa的恒定管壁剪切应力下持续5分钟的脉冲灌注。
- 在白细胞脉冲灌注的最后2分钟内，沿微流室长度方向随机选取10个视野进行记录。这有助于后续对淋巴细胞在内皮单层上的滚动/捕获行为进行离线分析。每个视野记录约10秒，然后移动至下一个视野，并确保记录方向与流动方向相反，以避免在短时间内重复记录同一个滚动细胞。
- 将阀门恢复至初始位置，用清洗缓冲液再进行5分钟的脉冲灌注。在此脉冲灌注的最后2分钟内，进入第二阶段记录，沿微流室长度方向随机选取至少10个视野。每个视野记录约5秒，然后移动至下一个视野，并确保内皮单层及黏附的白细胞处于清晰对焦状态。这有助于后续对黏附模式进行离线分析。
结果
该实验能够通过比较对照实验结果与分子抑制剂实验结果，来观察多步骤流动黏附级联反应并阐明其潜在的分子机制。通过使用特定的内皮细胞并改变剪切应力条件，可模拟多种血管床环境。
可通过遵循本方案中所述的录像方法，对黏附级联反应的每一步进行离线分析。黏附级联反应的第一步是白细胞的滚动，该过程可表示为黏附细胞总数的百分比。离线分析可在白细胞团注期间，对每个录像视野中的黏附细胞数量进行计数。通过回放图像，可比较牢固黏附的细胞与在内皮表面发生滚动运动的细胞。利用该技术可观察到滚动现象，每个视野至少记录10秒。滚动细胞通过其在内皮表面的移动速度明显慢于流动中的细胞而被识别，且该行为必须持续至少5秒而不发生脱离。肝窦内的黏附级联反应发生在低剪切力环境中，in vivo 研究已证实，在该环境下滚动现象极少，仅存在短暂的锚定步骤。我们通过实验证实，在本检测体系中，黏附的白细胞中持续在活化的肝窦内皮细胞（HSEC）上滚动的比例不足10%，表明该流动实验能够真实反映肝窦内的微环境。
黏附级联反应的下一步是牢固黏附。总黏附量可通过冲洗缓冲液团注期间记录的第二阶段（步骤7.3）进行计算。离线分析可统计每个视野中牢固黏附的细胞总数（图5）。牢固黏附的细胞定义为静止或发生形态改变并表现出缓慢爬行行为的细胞。随后可计算每个视野中的平均细胞数。结合视野的总表面积（使用网格目镜或其他等效方法测定）、淋巴细胞浓度（通常为1 × 106 个细胞/ml）以及流速，可将淋巴细胞黏附程度表示为每平方毫米每百万灌注细胞中的黏附细胞数（adherent cells/mm2/106 cells perfused）。
研究黏附模式涉及黏附级联反应最后两个步骤的分析，包括细胞形态改变、爬行以及跨内皮迁移。黏附在肝窦内皮细胞（HSEC）单层上表面的白细胞在相差显微镜下呈相位明亮，而已经迁移穿过单层的细胞则呈相位暗（图6）。随后可将细胞分类为表现出“静态”黏附（未迁移/圆形）、“形态改变”或“已迁移”状态，各分类以总黏附细胞群体的百分比表示。
图1. 流动腔室内原代人肝窦内皮细胞的单层培养。A) 在启动流动黏附实验前，已加入含内皮细胞单层的培养基的微载玻片。 B) 汇合的内皮细胞单层的相差显微图像；应将内皮细胞接种于预先包被的微载玻片中（对于人肝内皮细胞，应使用大鼠尾胶原I型包被），且内皮细胞在培养过程中必须保持健康并达到汇合状态。 点击此处查看高分辨率图像。
图 2. 流式分析室。 此处显示的是一个流式分析室的装置，它由一个透明的腔室组成，安装在倒置显微镜上。腔室内放置有一个加热器，应通过恒温控制以维持 37 °C 的温度。腔室上应设有接口，用于连接腔室内微滑片（microslide）的硅胶管路至位于外部的注射泵。微滑片直接放置在显微镜载物台上。 点击此处查看大图。
图 3. 注射泵。通过硅胶管将注射泵连接至流室。根据实验所需剪切应力，将泵设定为特定的抽吸速率。点击此处查看大图。
图 4. 将阀门连接至流动室。 A) 电子电磁阀可实现在两个注射器筒之间切换，分别用于装载细胞或培养基，且几乎无死体积。 B) 阀门冲洗完毕并设置好两个注射器筒后，需将阀门端的硅胶管连接至流动室。在将硅胶管上的接头与流动室的接口连接时，必须确保形成液-液界面。 点击此处查看高清图像。
图 5. 总白细胞黏附的测定。 在冲洗缓冲液推注步骤的最后两分钟内（如实验方案所述），应至少记录十个随机视野。这些图像可离线分析，并在每个视野中计数牢固黏附的细胞总数。可在对照腔室与经阻断抗体预处理的腔室之间比较白细胞的总黏附情况；此处展示了一个对照玻片和一个经细胞间黏附分子-1（ICAM-1）阻断抗体预处理玻片的代表性视野。已添加箭头以标示黏附的白细胞，在对照玻片的代表性视野中共识别出 25 个白细胞，而在 ICAM-1 阻断玻片的视野中共识别出 13 个白细胞。比例尺 = 100 µm。 点击此处查看高分辨率图像。
图6. 通过相差显微镜分析白细胞在内皮单层上的黏附模式。 对记录视野的离线分析也可用于研究白细胞黏附的方向和速度。可利用相差成像技术对黏附级联反应的特定步骤进行可视化观察和定量分析。牢固黏附但未被激活、呈相差明亮的细胞可称为“圆形”黏附；已被激活且呈相差明亮的细胞可称为“形态改变”；而呈相差暗淡的细胞则是已完成跨内皮迁移的细胞，可称为“已迁移”。该图像展示了每种黏附模式的示例。点击此处查看高分辨率图像。
讨论
成功进行流式实验最关键的一步是确保在进行流体黏附实验前，已准备好一层健康且融合良好的内皮细胞单层。原代内皮细胞的培养可能较为困难，并对培养方法的改变较为敏感。重要的是：1）流式腔室必须被内皮细胞均匀且充分地以单层形式覆盖；对于肝窦内皮细胞（HSEC），我们使用大鼠尾胶原I型进行包被，但其他内皮细胞群体可能有所不同；2）培养基必须适合相应的细胞类型，对于HSEC，本实验方案部分已描述了我们所用的完全培养基。其他关键步骤还包括将注射泵设定在适当的流速，以模拟生理水平的剪切应力。
在流式实验过程中，必须防止流路中产生气泡，因为气泡可能损伤内皮单层细胞，或使免疫细胞从内皮表面脱落。为避免此问题，应在连接前确保所有硅胶管路和接头均用洗涤缓冲液充分灌注，彻底排除所有气泡，并在使用前将培养基预热。将接头连接至微流小室（microslide）端口时，必须确保连接过程中形成液-液界面；若存在空气，则系统内会形成气隙，进而在注射器撤出步骤中破坏内皮单层结构。注射器筒内的白细胞悬液需定期轻轻混匀，以防止细胞沉降，从而在整个实验过程中维持恒定的细胞密度。
在记录过程中，必须确保内皮层图像充分聚焦且清晰，以便进行准确的离线分析；在流式实验的第二步（白细胞团注后），重新开始记录前，洗脱缓冲液阶段需留出足够时间，以确保所有非黏附性白细胞均被清除。同样，使用适当密度的单层内皮细胞至关重要，以避免细胞脱落，否则可能干扰狭窄毛细血管中的流动模式，并且在相差显微镜下难以与较大的黏附性白细胞区分。我们已描述了人肝窦内皮细胞的最佳接种密度，但不同内皮细胞群体及物种间的最佳密度可能有所差异。
利用活体显微镜在动物模型中研究白细胞募集已取得显著进展。流动黏附实验方法的主要优势在于，可在原代人源内皮细胞构成的二元系统中研究白细胞的募集过程。此外，这些相互作用可在生理相关的剪切应力水平下进行研究。由于不同物种间内皮特性可能存在差异，因此使用人类细胞系统验证动物活体研究的结果至关重要。流动实验的局限性之一是，白细胞募集过程仅在内皮单层细胞构成的单细胞环境中进行研究。此外，一旦白细胞黏附并穿越内皮层后，其数量可能不足以被有效分离并用于后续分析。
尽管存在这些局限性，但一旦掌握了流体黏附实验技术，便可进一步开发用于分析白细胞黏附级联反应，并可进行调整以模拟多细胞环境。通过长时间记录单个视野并结合轨迹追踪软件，可用于分析白细胞的爬行行为。此外，在流体实验完成后，可利用激光共聚焦显微镜结合免疫荧光标记技术对微载玻片进行检测，从而更深入地研究细胞黏附与跨内皮迁移过程。另外，我们此前已建立了一种体外模型，使流动的白细胞能够与由肝细胞存在条件下所诱导的肝窦内皮细胞相互作用。该实验体系还可进一步开发用于研究白细胞的不同亚群：本课题组已开展了针对调节性T细胞、B细胞以及肝组织浸润性白细胞等亚群的研究。
这些研究证明，流动黏附实验是研究人类系统中一般性和器官特异性白细胞募集的有力工具。
披露
作者声明 无竞争性财务利益
致谢
S.S. 获惠康信托中级临床研究员项目资助，C.W. 获惠康信托项目基金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 六通道微载玻片 VI 0.4 流动室 | Ibidi | 80601 | 根据实验要求，可提供其他尺寸的通道和预包被载玻片。 |
| 流量适配器 微载玻片 VI 0.4 | Ibidi | 80646 | |
| 流式实验腔室 | Solent Scientific | 33-3322 | 这些培养室由公司根据显微镜型号及配件定制生产。 |
| 倒置显微镜 IX2 | 英国奥林巴斯 | Model IX50 | |
| 哈佛注射泵 | 哈佛仪器公司，英国 | 702101 | |
| 电子电磁阀 | 英国 Lee 产品有限公司 | 货号 LFYA1226032H | |
| 大号硅胶管 | Fisher Scientific | FB50855 | 内径2 mm，外径4 mm |
| 硅胶管-小型 | Fisher Scientific | FB50853 | 内径1 mm，外径3 mm |
| 哈佛玻璃注射器 | 哈佛大学仪器公司，英国 | 55-0962 | |
| 细胞分离介质/Lympholyte | VH Bio | CL-5020 | |
| 大鼠尾胶原 | Sigma Aldrich | C3867-1VL |
参考文献
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重印与许可
