从人前列腺癌样本中分离癌干细胞

摘要

直接从人体组织中分离癌症干细胞（CSCs）是对其进行生物学表征的必要步骤。本文描述了一种从人体组织中分离前列腺癌症干细胞的方法，同时提供了针对困难步骤的故障排除建议。

摘要

在过去二十年中，癌症干细胞（CSC）模型得到了广泛重新审视。在此期间，CSC 已从人体组织中被识别并直接分离，并在免疫缺陷小鼠体内连续传代，通常通过亚群细胞的抗体标记及流式细胞术分选实现。然而，前列腺癌独特的临床特征在很大程度上限制了从新鲜人源肿瘤样本中研究前列腺癌症干细胞。我们近期报道了基于 HLA I 类分子（HLAI）阴性表型，直接从人体组织中分离前列腺 CSC 的方法。前列腺癌细胞取自手术标本，并通过机械法解离。制备单细胞悬液后，使用荧光标记的 HLAI 和间质细胞抗体进行染色。最后利用流式细胞仪分离出 HLAI 阴性的细胞亚群。该实验方案的主要局限在于，根治性前列腺切除标本中常存在原发癌病灶微小且呈多灶性分布的特点。尽管如此，所分离的活体前列腺 CSC 仍适用于在免疫缺陷小鼠体内进行移植，以开展分子特征分析和功能验证。

引言

肿瘤内异质性被认为是癌症的一个标志性特征¹。事实上，已有多种导致肿瘤内异质性的机制被描述，包括基因突变以及与微环境的相互作用。此外，某些癌症可能具有细胞层级结构，其中包含一群具备肿瘤起始能力和在连续移植实验中自我更新特性的癌症干细胞（CSCs）^2-5。癌症干细胞最初在血液系统⁶、乳腺⁷和脑部⁸恶性肿瘤中被发现，随后也在前列腺癌^9-12及其他类型的肿瘤中得到研究^2-5。

肿瘤干细胞（CSCs）通常被认为是在异质性细胞群体中的一个细胞组分^2-5。因此，对CSCs的功能和分子特征进行表征，依赖于从大量细胞群体中富集这些细胞。为此，在过去二十年中，研究人员已开发出多种CSC富集方法，通常涉及通过流式细胞术分离标记的细胞群体。此外，在CSC研究中一个重要的考虑因素是：人体组织的层级结构可能因实验操作（如体外连续传代培养或移植到免疫缺陷小鼠体内）而被破坏。因此，直接从人体组织中分离CSCs已成为CSC研究领域中一种重要的方法学策略。

前列腺癌是美国及全球癌症发病率和死亡率的主要原因之一¹³。因此，前列腺癌干细胞（CSCs）的分离及其生物学特性研究具有重要意义。既往已从细胞系、患者来源的异种移植模型以及低代次患者来源的悬浮培养物中富集得到前....

方案

1. 从手术标本中获取和处理人前列腺癌组织

1. 准备两个50 ml 聚苯乙烯锥形管，每管中加入15 ml 含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基。
2. 病理科工作人员根据经机构审查委员会批准的方案，分别从前列腺切除术和姑息性手术标本中获取原发性和转移性前列腺癌样本。转移性样本可来源于初次手术期间的淋巴结清扫、姑息性手术（如脊髓减压术）期间的椎体组织，或诊断性切除单发转移病灶时的肺组织等。
   1. 将无需用于临床诊断的多余大块组织收集至第1.1步中的第一个50-ml 聚苯乙烯锥形管中，并立即在4 °C保存。所采集的组织面积应至少为4-5 cm²，厚度为1-2 cm。
3. 实验室人员对病理科提供的大块组织进行处理，以备组织学检查和制备单细胞悬液。
   1. 为确保细胞活性最大化，大块组织的处理应在手术切除后24 hr 内完成。
   2. 在生物安全柜中使用无菌手术刀和镊子，从肉眼可见的肿瘤结节中切取2-4 mm 厚的水平组织切片，并立即将切片放入第1.1步中的第二个50 ml 聚苯乙烯锥形管中。
   3. 若前列腺切除术样本中未观察到肉眼可见的结节，则从后叶和移行带随机采集2-4 mm 厚的水....

结果

图 1. 人前列腺癌肿瘤组织的获取及流式细胞术图示人前列腺癌中特定细胞群体的分析。（A）获取肿瘤结节以制备单细胞悬液。通过常规苏木精-伊红染色确认处理后样本中的肿瘤成分。（B）排除DAPI染色阳性的细胞，以分离出活细胞。（C）基于使用同型对照IgG₁κ-FITC和IgG_2aκ-PE抗体染色的细胞设定HLAI阴性门控。图中显示了HLAI阴性和HLAI阳性细胞在门.......

讨论

本方案描述了从新鲜的人类前列腺癌组织中分离肿瘤干细胞（CSCs）的方法。多个关键因素会影响本方案的成功实施。

高数量可存活前列腺癌细胞的回收依赖于对手术样本的细致大体评估。根据我们的经验，当观察到大体可见的肿瘤结节并对其进行处理时，最有可能成功分离出具有致瘤性的前列腺细胞¹⁰。

然而，如今源自前列腺切除术标本的主要病变常表现为多灶性和显微镜下病灶。在此类情况下，应尽可能根据先前的临床穿刺活检结果来指导样本处理，以提高获取前列腺癌细胞的几率。根据我们的经验，必须由训练有素的实验人员频繁执行该实验方案，以确保从多个临床前列腺切除术样本中成功分离出前列腺肿瘤干细胞（CSCs）。

此外，由于本文描述的是一种涉及细胞表面HLAI表达的阴性筛选方案，因此在通过FACS处理前列腺癌细胞悬液时，必须去除可能存在的HLAI阴性污染物。尤其需要注意使用红细胞裂解缓冲液以及通过DAPI染色排除非活细胞。尽管这些措施不能完全确保非前列腺癌细胞不会污染HLAI阴性细胞群，但我.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
胎牛血清	Gibco Life Technologies	10437-028
青霉素-链霉素	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning Cell Gro	21-031-CM
60 mm，15 mm 细胞培养皿	Corning	3295
35 µm 细胞滤筛	BD Falcon	352340
50 ml 圆锥形离心管	Crystalgen	23-2263
15 ml 圆锥形离心管	Crystalgen	23-2265
红细胞裂解缓冲液	Sigma	R7757
HLA I 类分子（W6/32）PE 抗体	Abcam	ab43545
CD31 FITC 抗体	eBioscience	11-0319-42
CD45 FITC 抗体	Abcam	ab27287
IgG2aκ PE 抗体	BD Pharminogen	555574
IgG1κ FITC 抗体	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
带细胞滤筛帽的 12 mm × 75 mm 聚苯乙烯管	BD Falcon	352235
涡旋混合器	Crystalgen	CG-BV1000
10% 中性缓冲福尔马林	Fisher	RBBP-0480