直接从人体组织中分离癌症干细胞（CSCs）是对其进行生物学表征的必要步骤。本文描述了一种从人体组织中分离前列腺癌症干细胞的方法，同时提供了针对困难步骤的故障排除建议。
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摘要
摘要
在过去二十年中，癌症干细胞（CSC）模型得到了广泛重新审视。在此期间，CSC 已从人体组织中被识别并直接分离，并在免疫缺陷小鼠体内连续传代，通常通过亚群细胞的抗体标记及流式细胞术分选实现。然而，前列腺癌独特的临床特征在很大程度上限制了从新鲜人源肿瘤样本中研究前列腺癌症干细胞。我们近期报道了基于 HLA I 类分子（HLAI）阴性表型，直接从人体组织中分离前列腺 CSC 的方法。前列腺癌细胞取自手术标本，并通过机械法解离。制备单细胞悬液后，使用荧光标记的 HLAI 和间质细胞抗体进行染色。最后利用流式细胞仪分离出 HLAI 阴性的细胞亚群。该实验方案的主要局限在于，根治性前列腺切除标本中常存在原发癌病灶微小且呈多灶性分布的特点。尽管如此，所分离的活体前列腺 CSC 仍适用于在免疫缺陷小鼠体内进行移植，以开展分子特征分析和功能验证。
引言
肿瘤内异质性被认为是癌症的一个标志性特征1。事实上，已有多种导致肿瘤内异质性的机制被描述，包括基因突变以及与微环境的相互作用。此外，某些癌症可能具有细胞层级结构，其中包含一群具备肿瘤起始能力和在连续移植实验中自我更新特性的癌症干细胞（CSCs）2-5。癌症干细胞最初在血液系统6、乳腺7和脑部8恶性肿瘤中被发现，随后也在前列腺癌9-12及其他类型的肿瘤中得到研究2-5。
肿瘤干细胞（CSCs）通常被认为是在异质性细胞群体中的一个细胞组分2-5。因此，对CSCs的功能和分子特征进行表征，依赖于从大量细胞群体中富集这些细胞。为此，在过去二十年中，研究人员已开发出多种CSC富集方法，通常涉及通过流式细胞术分离标记的细胞群体。此外，在CSC研究中一个重要的考虑因素是：人体组织的层级结构可能因实验操作（如体外连续传代培养或移植到免疫缺陷小鼠体内）而被破坏。因此，直接从人体组织中分离CSCs已成为CSC研究领域中一种重要的方法学策略。
前列腺癌是美国及全球癌症发病率和死亡率的主要原因之一13。因此，前列腺癌干细胞（CSCs）的分离及其生物学特性研究具有重要意义。既往已从细胞系、患者来源的异种移植模型以及低代次患者来源的悬浮培养物中富集得到前列腺癌干细胞9,10,12,14。
我们近期报道了通过HLAI阴性细胞表面表型直接从人类手术样本中分离前列腺肿瘤干细胞（CSCs）的方法10。本文详细描述了分离这些细胞所采用的操作步骤。前列腺肿瘤组织取自手术标本，并制备成单细胞悬液。随后使用针对HLAI以及间质细胞和活细胞标记物的抗体对细胞进行染色，再通过荧光激活细胞分选（FACS）技术分离出CSCs。分离得到的CSCs可用于需要活细胞的各种实验分析。
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方案
1. 从手术标本中获取和处理人前列腺癌组织
- 准备两个50 ml 聚苯乙烯锥形管，每管中加入15 ml 含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基。
- 病理科工作人员根据经机构审查委员会批准的方案，分别从前列腺切除术和姑息性手术标本中获取原发性和转移性前列腺癌样本。转移性样本可来源于初次手术期间的淋巴结清扫、姑息性手术（如脊髓减压术）期间的椎体组织，或诊断性切除单发转移病灶时的肺组织等。
- 将无需用于临床诊断的多余大块组织收集至第1.1步中的第一个50-ml 聚苯乙烯锥形管中，并立即在4 °C保存。所采集的组织面积应至少为4-5 cm2，厚度为1-2 cm。
- 实验室人员对病理科提供的大块组织进行处理，以备组织学检查和制备单细胞悬液。
- 为确保细胞活性最大化，大块组织的处理应在手术切除后24 hr 内完成。
- 在生物安全柜中使用无菌手术刀和镊子，从肉眼可见的肿瘤结节中切取2-4 mm 厚的水平组织切片，并立即将切片放入第1.1步中的第二个50 ml 聚苯乙烯锥形管中。
- 若前列腺切除术样本中未观察到肉眼可见的结节，则从后叶和移行带随机采集2-4 mm 厚的水平组织切片。
- 使用无菌手术刀和镊子分离部分手术组织，在制备细胞悬液前将其固定于10%福尔马林中。对该材料进行归档并进行组织学分析，以确认前列腺癌组织的存在。
2. 从组织切片制备细胞悬液
- 在无菌生物安全柜中操作，将一块组织样本转移至含有 1 ml 无菌 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）的 60 × 15 mm 培养皿中。
- 使用无菌手术刀和镊子对样本进行机械性吹打处理。
- 本方案中不涉及酶消化步骤。
- 将 1 ml 悬液转移至一个无菌的 50 ml 锥形离心管中。
- 向培养皿中再加入 1 ml PBS，重复吹打步骤，直至组织完全解离，通常需重复 3–4 次。
- 依次重复此操作，直至所有组织样本均被解离。
- 使用 5 ml 移液管重悬 50 ml 聚苯乙烯锥形离心管中的内容物，并在最大转速（约 3,200 rpm）下涡旋振荡 1 分钟。
- 将所得悬液通过 35-μm 细胞滤网过滤，并收集至另一个无菌的 50 ml 聚苯乙烯锥形离心管中。
- 在 450 × g 条件下离心 10 分钟，形成细胞沉淀。
- 弃去上清液，用 5 ml 红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，并在室温下孵育 5 分钟 。随后在室温下以 450 × g 离心 5 分钟 ，去除红细胞裂解缓冲液。
- 弃去上清液，将沉淀重悬于含 5% FBS 的 1× PBS 中，使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定活细胞（台盼蓝阴性）数量。配制成浓度为 1×106 个细胞/ml 的细胞悬液，并置于冰上保存，保存时间不超过 1 小时。
- 不同肿瘤样本之间的细胞活力和得率可能存在显著差异。在前列腺切除术样本中，细胞活力通常介于 45–70% 之间，一个肉眼可见的肿瘤结节切取五片厚度为 2–4 mm 的水平组织切片，预计可获得约 3×106 个活细胞。
3. 用于FACS的细胞抗体染色
- 按下述方式标记五个15 ml 聚苯乙烯圆锥形管。使用CD45和CD31抗原标记分别排除造血细胞和内皮细胞成分。
- 未染色
- IgG2aκ-PE + IgG1κ-FITC
- HLAI-PE + IgG1κ-FITC
- IgG2aκ-PE + CD31-FITC + CD45-FITC
- HLAI-PE + CD45-FITC + CD31-FITC
- 将上一部分（步骤2.7）中定量的细胞悬液分装至步骤3.1中的五个试管中。按1:250稀释比例加入抗体，并将细胞悬液置于冰上孵育30分钟。
- 在4 °C条件下，以450 × g离心3 min ，弃去上清液。
- 用含10%胎牛血清（FBS）的无菌1×PBS重悬各管细胞沉淀进行洗涤，随后在4 °C条件下以450 × g离心3 min 。
- 将细胞重悬于1 ml 含10 μg/ml浓度4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的1×PBS溶液中。
- 将最终溶液经35 μm滤网帽过滤至12 mm × 75 mm聚苯乙烯管中。
4. 通过流式细胞术分离前列腺肿瘤干细胞
- 使用流式细胞仪进行细胞分选。
- 使用第1、2、3和4管中的细胞设置补偿对照。
- 利用前向散射和侧向散射参数设置门控，排除碎片和细胞聚集体。
- 分别使用第3管和第4管的悬液建立FITC和PE的门控。
- 通过Pacific Blue-A通道对活细胞（DAPI阴性）进行门控。
- 使用第5管，去除CD31阳性与CD45阳性细胞，并将HLAI阴性和HLAI阳性细胞群体分别收集至含有2 ml 添加10% FBS的RPMI培养基的无菌15 ml 聚苯乙烯圆锥形管中。
- 将分选后的细胞悬液以450 × g离心5分钟，然后将沉淀重悬于200–500 μl 添加10% FBS的RPMI培养基中。
- 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对活细胞（台盼蓝阴性）进行定量。
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结果
图 1. 人前列腺癌肿瘤组织的获取及流式细胞术图示人前列腺癌中特定细胞群体的分析。（A）获取肿瘤结节以制备单细胞悬液。通过常规苏木精-伊红染色确认处理后样本中的肿瘤成分。（B）排除DAPI染色阳性的细胞，以分离出活细胞。（C）基于使用同型对照IgG1κ-FITC和IgG2aκ-PE抗体染色的细胞设定HLAI阴性门控。图中显示了HLAI阴性和HLAI阳性细胞在门...
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讨论
本方案描述了从新鲜的人类前列腺癌组织中分离肿瘤干细胞（CSCs）的方法。多个关键因素会影响本方案的成功实施。
高数量可存活前列腺癌细胞的回收依赖于对手术样本的细致大体评估。根据我们的经验，当观察到大体可见的肿瘤结节并对其进行处理时，最有可能成功分离出具有致瘤性的前列腺细胞10。
然而，如今源自前列腺切除术标本的主要病变常表现为多灶性和显微镜下病灶。在此类情况下，应尽可能根据先前的临床穿刺活检结果来指导样本处理，以提高获取前列腺癌细胞的几率。根据我们的经验，必须由训练有素的实验人员频繁执行该实验方案，以确保从多个临床前列腺切除术样本中成功分离出前列腺肿瘤干细胞（CSCs）。
此外，由于本文描述的是一种涉及细胞表面HLAI表达的阴性筛选方案，因此在通过FACS处理前列腺癌细胞悬液时，必须去除可能存在的HLAI阴性污染物。尤其需要注意使用红细胞裂解缓冲液以及通过DAPI染色排除非活细胞。尽管这些措施不能完全确保非前列腺癌细胞不会污染HLAI阴性细胞群，但我...
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致谢
本工作由哈里里家族基金会和TJ马特尔基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| 胎牛血清 | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
| 60 mm，15 mm 细胞培养皿 | Corning | 3295 | |
| 35 µm 细胞滤筛 | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml 圆锥形离心管 | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml 圆锥形离心管 | Crystalgen | 23-2265 | |
| 红细胞裂解缓冲液 | Sigma | R7757 | |
| HLA I 类分子（W6/32）PE 抗体 | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC 抗体 | eBioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC 抗体 | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE 抗体 | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC 抗体 | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 带细胞滤筛帽的 12 mm × 75 mm 聚苯乙烯管 | BD Falcon | 352235 | |
| 涡旋混合器 | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Fisher | RBBP-0480 |
参考文献
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重印与许可
