使用pTIRFM成像质膜形变

摘要

基于偏振的全内反射荧光显微镜（pTIRFM）可实现对细胞膜动态的实时检测。本文介绍了pTIRFM在研究调控性胞吐过程中膜重塑的应用。该技术可推广至细胞生物学中其他直接或间接涉及膜形态变化的过程。

摘要

为了深入理解胞吐作用的动力学机制，我们的研究团队聚焦于囊泡膜与质膜融合过程中脂质双分子层形状的动态变化，这些变化必须受到精确调控。此类快速且局部的形态改变依赖于脂质与特定蛋白质之间的动态相互作用，这些蛋白质能够调控膜曲率。若缺乏此类相互作用，不仅会对囊泡融合造成严重后果，还会影响众多其他依赖膜形态调控的细胞功能。近年来，已鉴定出多种具有膜塑形功能的蛋白质。然而，目前仍缺乏一份系统性的路线图，阐明这些蛋白质在膜融合及内容物释放过程中何时、何地以及如何发挥作用。

长期以来，由于缺乏对膜曲率敏感或具有足够时间分辨率以追踪快速变化的分析方法，人们对介导膜重塑的分子事件的理解一直受到限制。全内反射荧光显微术（pTIRFM）满足了这两项要求。本文讨论了如何利用pTIRFM来可视化并解析嗜铬细胞膜在致密核心囊泡（DCV）融合过程中发生的快速、亚微米级别的取向变化。我们所使用的嗜铬细胞来源于牛肾上腺。细胞膜使用一种亲脂性碳菁染料——1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁-4-氯苯磺酸盐（diD）进行染色。 diD以"固定"的方向嵌入膜平面，因此其荧光信号对隐逝场的偏振状态敏感。使用波长为561 nm的激光依次以正交偏振方向（p偏振光和s偏振光）激发diD标记的细胞膜。同时使用488 nm激光来观察囊泡内容物并确定融合发生的时刻。通过局部灌注去极化KCl溶液诱导细胞发生胞吐作用。随后使用自主编写的软件进行离线分析，以理解diD荧光强度变化与融合孔扩张之间的关系。

引言

胞吐作用的正确执行需要精确协调细胞膜双层结构的剧烈形态变化。在膜融合之前，囊泡下方的质膜会发生局部弯曲，部分原因是为了降低双层膜相互作用的能量势垒。随后，在膜融合过程中，会产生高曲率区域，这些区域必须保持稳定。最后，融合后的膜必须从初始形态发生弯曲，以扩张融合孔并实现内容物的释放¹。由于膜自身难以完成如此剧烈且协调的变化，因此需要蛋白质来介导这些事件。然而，这些蛋白质如何在融合过程中影响膜拓扑结构的变化，目前仍是一个尚未完全解决的问题。

优秀 体外 已有多种模型可用于观察膜曲率。例如，负染电镜技术（negative-stain EM）在构建两种主要运输蛋白——突触结合蛋白（synaptotagmin）和动力蛋白（dynamin）作用机制的分子模型方面发挥了重要作用（相关综述见 Chapman）² 和 Henshaw³）。大多数关于胞吐作用的实时检测并不能直接检测曲率，而是通过检测腔内货物释放的动力学来间接推断曲率^4-8 或膜面积的变化^9-11PTIRFM 弥合了两者之间的差距 体内 和 体外 通过实现对膜微形态变化的直接、实时测量，推动了相关研究。

在非成像模式下，PTIRFM 由 Axelrod 及其同事首创，用于测量模型膜中掺入的 NPD-PE 的取向¹²。随后，该技术被应用于可视化标记了 diI 和 FM1-43 的活细胞中的动态变化^13-18。在 pTIRFM 中，使用两种倏逝场偏振光依次激发膜嵌入型探针：p 偏振光（位于入射平面内）和 s 偏振光（垂直于入射平面）。在成像前，将探针（本实验中为 diD）短暂加入细胞外培养基中，使其嵌入待研究细胞的质膜。在膜与盖玻片不平行的区域（如膜皱褶或凹陷处），diD 的取向也将不平行于盖玻片，因此这些区域可被 p 偏振光有效激发；而在与盖玻片基本平行的膜区域，p 偏振光对 diD 的激发效率较低。因此，通过逐像素计算 diD 在 p 偏振和 s 偏振激发下发射信号的比值图像（P/S），可特异性地突出显示膜形变区域。理论上，P/S 比值图像对质膜相对于盖玻片的微小倾斜角度也具有敏感性，其变化幅度可通过计算机模拟预测¹⁸。此外，P/S 图像不受荧光团与盖玻片表面距离及局部荧光团浓度的影响。而局部荧光团浓度则由反映 P 发射信号与 2 倍 S 发射信号之和的逐像素图像（P+2S）提供。P+2S 测量值对凹陷的精确几何结构敏感，可能表现出显著、微弱或无明显变化。这一点可通过计算机模拟展示，例如模拟融合孔从早期（即 具有狭窄颈部）到后期状态的转变过程^16,18。例如，通过狭窄颈部连接至质膜的融合囊泡（其周围有更多 diD 靠近界面）的 P+2S 值预计高于具有更宽孔道的融合囊泡（此时 diD 位于倏逝场最弱区域）。

本文讨论了全内反射荧光显微镜（pTIRFM）的实现方式及其在研究融合孔扩张过程中膜形态快速、局部变化的应用。尽管文中仅明确讨论了一种应用，但这些方法可推广至多种其他细胞生物学过程，这些过程直接或间接涉及膜重塑。

方案

1. PTIRF 系统设置

pTIRFM 技术基于倒置显微镜平台构建。激光束通过侧面照明端口和一个非偏振侧向滤光立方体，随后聚焦到 60 倍、数值孔径 1.49 的 TIRF 物镜的后焦平面。在显微镜与 EMCCD 相机之间的发射光路中设有两个附加透镜（1.6 倍和 2 倍），最终实现约 80 nm 的像素尺寸。激光束通过软件控制的检流计镜进行引导，以在落射照明和全内反射（TIR）照明之间快速切换。以下所述方案假设 TIRF 光学组件已安装在隔振光学平台上，并处于荧光团激发与成像的最佳位置。该方案描述了如何在现有的 TIRF 显微镜系统中添加偏振光学元件，以实现细胞膜形变的成像。本实验室用于生成 TIR 和基于偏振的 TIR 的光学系统示意图见图 1A。本方案假设使用 488 nm 激光激发荧光囊泡蛋白，以及使用 561 nm 激光对羰花青染料 diD 进行成像。

1. 开启所有显微镜组件、激光器和计算机。
2. 将 488 nm 激光束引导至 1.49 NA 物镜的后焦平面（BFP），如图 1A所示。如果激光束聚焦在 BFP 上，则其将准直射出，并在物镜正上方的天花板上呈现为一个微小且轮廓清晰的光斑。
3. 调节 X 向检流计镜（位于等效样品平面的镜片），使激光束偏离光轴，并以相对于物镜法线逐渐增大的角度从物镜射出。
4. 接下来，验证全内反射（TIR）是否实现。在玻璃底培养皿中，向 1 ml PSS 溶液加入 10 μl 荧光微球。仅应检测到来自紧贴TIR界面的培养皿底部的微球荧光。若检测到悬浮微球的荧光，表明入射光与物镜法线之间的角度不足。
   
   下文描述了基于偏振成像所需光学组件的设置方法。
5. 以已对准的 488 nm 激光束为参考，调节原始 561 nm 激光束的位置，使其沿完全相同的光路传播。561 nm 激光将用于羰花青染料 diD 的成像。
6. 在 561 nm 激光器下游插入一个发散透镜和若干反射镜。利用这些反射镜调节光束，使其与 488 nm 光束共线，并且当检流计镜处于"0"位置时，光斑在天花板上聚焦清晰。
7. 在激光出射孔径下游的光路中居中放置一个四分之一波片（QW）。使用针对激发波长调谐的或消色差的四分之一波片。当线偏振光以 45° 角入射至波片的光轴时，四分之一波片可将其转换为圆偏振光。某些光学元件（如偏振分光立方体）对某一偏振轴具有衰减偏好。可通过旋转 QW 补偿这种偏振偏差，从而获得椭圆偏振光束。由于激光束从孔径射出时本身具有高度线偏振性（垂直方向），因此必须使用 QW。
8. 在椭圆偏振光束的下游放置一个偏振分光立方体（PC1）。该偏振分光立方体反射电场的垂直（y）分量，而使水平（x）分量透射。将偏振分光立方体安装在小型平移台上，以便后续对偏振光路进行对准调节。
9. 使用第二个偏振分光立方体（PC2）和反射镜（图 1A）将两束光重新合并。
10. 在第一个偏振分光立方体（PC1）与垂直分量反射镜之间放置一个快门；在水平分量反射镜与第二个偏振分光立方体（PC2）之间放置第二个快门。这些快门由成像软件控制，使用户能够快速切换不同偏振态的光束。
11. 使用偏振滤光片验证每条光路中电场的方向。偏振滤光片仅允许与其轴向一致的偏振光通过。
12. 验证激光束的垂直分量和水平分量彼此对齐，并与 488 nm 光束对齐。根据需要进行调节。三条光束均应聚焦于后焦平面（BFP），并从物镜准直射出，在天花板上汇聚于同一点。可通过标记“X”来标定该点，以便未来对准。
13. 在物镜上滴加一滴浸油。将含有荧光微球的培养皿（见上述第 4 步）放置在物镜上。
14. 通过移动 X 向检流计镜进入全内反射状态。在全内反射条件下，光束的垂直分量为 s 偏振光（s-pol），水平分量则为 p 偏振光（p-pol）。通过旋转四分之一波片调节两束光之间的相对强度。使用罗丹明样品观察每种偏振态的倏逝场，该样品的分子取向预计为随机分布。旋转 QW 板以匹配两偏振通道的平均像素强度。如有必要，可在其中一条偏振光路中加入中性密度滤光片以衰减其强度。

2. 嗜铬细胞的分离

以下提供了一种从牛肾上腺中分离健康嗜铬细胞的实验步骤。该方法改编自Wick、Senter等人先前发表的实验方案。 等.¹⁹ 和 O'Connor，Mahata 等.²⁰ 分离后，使用电穿孔系统将目的质粒转入细胞。该系统可使20%-30%的细胞表达目标荧光蛋白。通常情况下，70%的细胞可在电穿孔过程中存活。PSS及培养基成分的详细信息见于 表 2、表 3 和 4.

1. 在细胞准备前两天，用1 ml聚-D-赖氨酸（0.1 mg/ml）处理35 mm光学级玻璃底培养皿（0.17 mm厚），随后加入1.25 ml牛胶原蛋白。将培养皿置于组织培养超净台中自然晾干。
2. 从屠宰场获取牛肾上腺组织，运输过程中保持组织置于冰上。牛肾上腺可能包裹在较厚的脂肪层中，使用手术剪去除多余脂肪，暴露肾上腺静脉开口。用预处理PSS缓冲液反复灌注静脉，直至腺体血液完全清除。
3. 随后，缓慢将2 ml TH-PSS溶液通过静脉开口注入，直至腺体膨胀。将膨胀后的腺体在37 °C孵育15分钟。重复一次TH-PSS处理，并再次孵育。
4. 用剪刀沿腺体边缘切开外层肾上腺皮质，将腺体剥离以暴露髓质。使用解剖刀轻轻刮取并分离髓质与皮质组织。
5. 用两把解剖刀片将髓质组织切碎5–10分钟。
6. 需要进行最终消化步骤以分离单个嗜铬细胞。将切碎的细胞悬液倒入旋转烧瓶中，加入TH-PSS（30 ml）与TL-PSS（15 ml）按2:1比例混合的消化液至半满，在37 °C、约100 rpm转速下旋转孵育30分钟。
7. 通过400 μm孔径滤网过滤，以分离未消化组织与单个嗜铬细胞。收集滤液，以200 × g离心沉淀细胞，并用预冷的PSS缓冲液重悬。
8. 将细胞通过250 μm孔径滤网过滤，离心收集细胞沉淀，最后重悬于电穿孔缓冲液中（见步骤2.9）。
9. 使用血细胞计数板计数细胞，并准备进行转染。
10. 根据电穿孔系统的制造商推荐条件进行细胞转染。电穿孔的具体参数需通过实验确定。注意：针对本实验所制备的牛嗜铬细胞，最佳转染效率与细胞存活率平衡的电穿孔条件为1,100 V、40毫秒、1次脉冲。估计在此条件下，20–30%的细胞可成功转染，约30%的细胞无法存活通过电穿孔过程。
11. 将细胞轻柔地接种至经聚-D-赖氨酸和胶原蛋白处理的培养皿中，加入1 ml预温的电穿孔培养基。
12. 将培养皿置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。6小时后，向每皿中加入1 ml 2倍浓度的抗生素培养基。次日更换为常规培养基。
13. 嗜铬细胞通常在电穿孔后2–5天进行成像观察。

3. pTIRF 图像采集

1. 开启成像系统并启动采集软件。
2. 验证激光是否已对准。使用微球检查衰逝场的分布情况。
3. 准备全局和局部灌流系统。用过滤后的去离子 H₂O 清洗溶液储液罐，并装入基础性和刺激性 PSS 溶液。
4. 在对嗜铬细胞成像前，需确认 p-偏振光和 s-偏振光激发能够照射到视野中的相同区域，且照明强度大致相等。为此，将含有 10 mM 罗丹明（终浓度）的 2 ml PSS 溶液加入玻璃底培养皿中。依次使用 p-偏振光和 s-偏振光激发罗丹明样品并采集图像。实际操作中，diD 的 P 和 S 发射信号将归一化至罗丹明 P 和 S 发射信号的平均值。详见图像分析与讨论部分。
5. 接下来对牛嗜铬细胞进行 diD 染色。用基础性 PSS 溶液冲洗含有嗜铬细胞的培养皿以去除培养基，然后加入 2 ml 基础性 PSS 溶液。直接向含有细胞的培养皿中加入 10 μl 的 10 mM diD（溶于乙醇中）。轻轻振荡培养皿 2–10 秒 ，随后移除含 diD 的 PSS 溶液。
6. 用基础性 PSS 溶液洗涤培养皿 3–4 次，以去除残留的 diD。此时细胞已完成染色，可进行后续实验。
7. 在物镜上滴加一滴浸油。将含有 diD 染色嗜铬细胞的培养皿置于物镜上方。
8. 通过物镜或相机观察培养皿，寻找一个已转染目标蛋白且被 diD 染色的细胞。染色良好的细胞其 P 发射信号应能清晰勾勒出细胞边缘；S 发射信号在细胞贴附区域（即细胞与玻璃接触并在 TIRF 下成像的区域）应大致均匀分布（i.e. ）。
9. 调整局部灌流针的位置，使其距离细胞约 100 μm。
10. 聚焦于细胞膜，并在细胞刺激/图像采集前立即启用自动对焦硬件。
11. 开始图像采集。先用基础性溶液对细胞灌流 10 秒，随后用 56 mM KCl 去极化溶液灌流 60 秒。在采集过程中快速切换 561 nm p-偏振光、561 nm s-偏振光（用于监测 diD 的 P 和 S 发射变化）以及 488 nm 激光（用于成像转染的囊泡探针）。实验过程中采集的图像示例如 图 2 和 图 3 所示。

4. 图像分析

图像处理的计算可以使用 ImageJ 完成，但利用 IDL 或 Matlab 等灵活编程语言中的脚本可通过自动化任务显著提高分析通量。为了从原始发射图像中获取拓扑信息，必须计算两种类型的图像——P/S 和 P+2S。P/S 反映局部膜形变，而 P+2S 的求和值则反映视场中特定区域内的总膜染料量。

1. 所有图像均应进行背景扣除。选择一个无细胞区域的感兴趣区域（ROI），测量该区域内像素的平均强度，然后从图像堆栈的所有像素中减去该值。
2. 为计算 P/S，将每个 "P" 发射帧除以随后的 "S" 发射帧（逐像素相除）。P/S 会随 p 偏振和 s 偏振激发光的相对强度、光学系统的偏差以及干涉条纹而变化。为减少这些影响，需将由 diD 发射获得的 P/S 比值归一化至含有 10 mM 罗丹明¹⁸溶液所测得的比值。
3. 单个致密核心囊泡（DCV）的胞吐可通过荧光囊泡蛋白（如 Synaptotagmin-1 pHluorin）强度的突然变化来识别（图 2B）。通过在胞吐位点处 P/S 比值局部升高区域为中心、半径为 240 nm 的 ROI 内对像素取平均，来确定 P/S 和 P+2S 的变化。当融合发生但未出现明显的 P/S 升高时，应将 ROI 中心置于正在融合的 DCV 区域。
4. 可通过计算机模拟将 P/S 和 P+2S 膜强度变化解释为融合孔扩张的简单几何模型。有关模拟的详细信息，请参见 Anantharam et al.¹⁸

结果

常规和偏振全内反射荧光显微成像技术在同一光学平台上实现。光学元件的配置相似，主要区别在于激发光经过偏振处理（图1A）。偏振光优先激发其吸收偶极矩方向与偏振方向一致的荧光分子。因此，为了使偏振全内反射荧光显微镜（pTIRFM）能够有效监测膜拓扑结构的变化，所使用的探针必须以固定取向插入膜中。荧光碳菁染料（diI、diD）以定向方式插入脂双层，其跃迁偶极矩位于膜平面内（图1B）。对diD标记的膜采用P偏振照明（图1C）可选择性地激发靠近盖玻片且呈倾斜取向的荧光分子（图1B和图1D中的红色部分）。

嗜铬细胞在与diD短暂孵育后可实现强烈的膜标记。图2A展示了一个细胞膜染色良好的示例。健康的贴壁细胞在P光和S光发射图像中表现出明显的差异。P发射图像中，细胞边界相对于细胞其他区域更亮；S发射图像中，细胞投影区域的荧光大致均匀。计算得到的逐像素P/S比值图像和P+2S图像分别对膜曲率和染料浓度敏感。所示嗜铬细胞还转染了突触结合蛋白-1 pHluorin（Syt-1），用于标记分泌囊泡（图2B）。

使用56 mM KCl刺激嗜铬细胞，使其细胞膜去极化并触发胞吐作用。当致密核心囊泡融合时，多个明亮的Syt-1 pHluorin斑点突然显现（图2B，右侧面板）。在其中一个融合事件周围标出了白色方框（图2B，右侧面板）。该融合事件在图2C和2D中进行了分析。图2C展示了Syt-1-pHluorin、P/S和P+2S图像强度的逐帧变化。随着Syt-1蛋白从融合位点扩散开来，其荧光强度迅速减弱（图2D）。代表融合囊泡与质膜复合体的凹陷结构则以相对较慢的速率减小（见图2D中的曲线图）。示意图（图2E）展示了一种对这些测量结果的解释。

所示的快速且局部的膜变形 图2 是由刺激诱发的 Ca²⁺ 内流。这体现在 图3A. 一种嗜铬细胞被转染了遗传性 Ca²⁺ 指示剂 GCaMP5G^21,22 并用 56 mM KCl 刺激。膜去极化导致 GCaMP5G 荧光显著增强（图3A 和 3B）表明亚质膜区 Ca²⁺ 浓度升高²⁺ 水平。选择细胞的一个 30 x 20 像素区域，逐帧分析 GCaMP5G 的变化， P/S，以及 P+2S 图像中显示了像素强度（图3B）和图表（图3C）。时间“0”指变化发生前的帧 P/S 是显而易见的（即 胞吐作用前的帧）。白色箭头指示膜变形（增加） P/S) 伴随有下降 P+2S 发射。融合的DCV将细胞质中的GCaMP5G蛋白排除在该区域之外。同时注意GCaMP5G荧光强度在0时刻的突然下降 图3C，左侧面板。长期升高的 P/S 减少 P+2S 提示一个缓慢扩张的融合孔（图3D).

图1. pTIRFM技术示意图。A） 显示了将传统成像与基于偏振的全内反射荧光（TIRF）成像相结合的示意图。在561 nm蓝宝石激光器前放置一个四分之一波片（QW），使激光束呈椭圆偏振。使用一个偏振立方体（PC1）将偏振光分离为线性垂直（v）和水平（h）分量。垂直和水平分量分别成为在TIR界面上的p偏振（p-pol）和s偏振（s-pol）激发光束。p-pol和s-pol光路分别由快门（S1和S2）独立控制。它们通过反射镜和第二个偏振立方体（PC2）重新合并。通过由反射镜和非偏振二向色镜（DC）组成的光束转向元件，与488 nm光束（同样由快门S3独立控制）合并。透镜（L）用于扩展和聚焦光束。合并后的488 nm和561 nm光束通过检流计镜（GM）被引导至显微镜的侧向照明端口，并聚焦到物镜的后焦平面（BFP）。荧光团发射的光子被连接至计算机的EMCCD相机捕获。B） diD标记通过将细胞短暂孵育于染料中并反复洗涤以去除过量染料完成。diD插入膜中，其跃迁偶极矩大致位于膜平面内。C） 在入射面内偏振的入射光（p-pol）产生一个主要垂直于界面偏振的衰逝场，如图所示。D） 使用p偏振光照射diD标记的膜将选择性激发那些相对于盖玻片呈倾斜取向的荧光团（红色）。若为s偏振的衰逝场，则会激发那些平行于盖玻片的荧光团（黑色）。

图2. 使用pTIRFM监测细胞膜形变。A） 显示原始的P和S发射图像，以及计算得到的P/S和P+2S发射图像。比例尺，3.2 μm。B） 表达Syt-1 pHluorin的嗜铬细胞用KCl去极化。多个明亮的荧光点（右侧面板）表明单个致密核心囊泡（DCV）的融合。比例尺，3.2 μm。C） 一个正在融合的Syt-1 pHluorin标记的DCV的逐帧图像。时间（图像上方）单位为秒。时间0表示DCV融合前的一帧。相应的P/S和P+2S发射图像也一并显示。比例尺为1 μm。D） 对应C中图像的数据图。虚线位于时间0——即融合帧。E） 显示了对C和D中结果的一种可能解释。请点击此处查看该图的高清版本。

图3. 变形是刺激诱发的 Ca²⁺ 内流。A) 转染了GCaMP5G的嗜铬细胞用56 mM KCl去极化。GCaMP5G荧光的相应增强表明细胞膜下Ca²⁺浓度升高²⁺ 水平 B) A图中细胞30 × 20像素区域的逐帧图像。图像上方的时间单位为秒。白色箭头指示P/S升高且P+2S降低的区域。融合中的DCV将细胞质中的GCaMP5G蛋白排出该区域。比例尺，1 μm。 C) 所展示图像的图表 B. D) 结果的一种可能解释是 B 和 C 如图所示。 请点击此处查看该图的放大版本。

iXon3 EMMCD 相机	Andor	897
IX81 倒置显微镜	Olympus		侧置滤光立方体组件
43 系列 Ar-Ion 激光器	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	可调至 488 nm
Sapphire 561 LP 二极管激光器	Coherent		561 nm
扫描振镜系统	Thorlabs	GVS102
VC3 通道焦点灌流系统	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM 石英微流控 manifold	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 psi 压力调节器	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
操纵器	Burleigh	TS 5000-150
安装式消色差四分之一波片	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680 nm 偏振分光立方体	Thorlabs	PBS201
六位中性密度滤光轮	Thorlabs	FW1AND
步进电机驱动智能快门	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp 二向色滤光片	Chroma	NC255583	合并 488 nm 和 561 nm 光束
镀膜平凹透镜	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	发散 488 nm 光束
镀膜平凹透镜	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	发散 561 nm 光束
镀膜平凸透镜	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	聚焦两束光
镀膜平凸透镜	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	粘合至滤光立方体组件
z488/561rpc 二向色镜	Chroma	z488/561rpc	滤光立方体二向色镜
z488/561_TIRF 发射滤光片	Chroma	z488/561m_TIRF	滤光立方体发射滤光片
UIS2 60X 物镜	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon 转染系统	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph 成像软件	Molecular Devices
DiI 膜染料	Invitrogen	V-22885	用于校准
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
牛源 DNAse I IV 型	Sigma	D5025
血细胞计数板	Fisher	0267110
DiD 膜染料	Invitrogen	D-7757
罗丹明	Invitrogen	R634
0.22 μm 膜式注射器滤器单元	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite 多色红色微球	Polysciences	19507	0.5 μm
浸油	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		控制振镜
旋转培养瓶	Bellco	1965-00250

表1. pTIRF 显微镜设备。

成分	Prep-PSS	Basal-PSS	Stim-PSS
NaCl	145 mM	145 mM	95 mM
KCl	5.6 mM	5.6 mM	56 mM
MgCl2	-	0.5 mM	0.5 mM
CaCl2	-	2.2 mM	5 mM
HEPES	15 mM	15 mM	15 mM
pH	7.4	7.4	7.4
葡萄糖	2.8 mM	5.6 mM	5.6 mM
Pen-Strep	1x	-	-

表2. 灌注及嗜铬细胞制备溶液。

成分	电穿孔培养基	常规铺板培养基	2倍抗生素培养基
1x DMEM/F-12	1 ml/板	2 ml/板	1 ml/板
FBS	10%	10%	10%
阿糖胞苷（CAF）	-	从10 mM储备液中加入1 μl/ml	-
青霉素	-	100 单位/ml	200 单位/ml
链霉素	-	100 μg/ml	200 μg/ml
庆大霉素	-	25 μg/ml	50 μg/ml

表3. 嗜铬细胞培养基。

成分	TH-PSS	TL-PSS
Liberase TH	2 ml	-
Liberase TL	-	0.85 ml
Prep-PSS	98.0 ml	84.0 ml
DNase	8.75 mg	7.4 mg

表4. TH-PSS 和 TL-PSS 溶液。

讨论

基于偏振的全内反射荧光显微镜可检测细胞膜拓扑结构的快速亚微米级变化。该技术的实施相对简单，特别是当全内反射光学系统已配备的情况下。所需组件仅包括一个四分之一波片、两个偏振分光立方体以及用于分离p偏振和s偏振照明光路的快门。这些元件在光学平台上具体放置的位置通常取决于可用空间。

为了获得膜拓扑信息，所使用的荧光探针应以固定或已知的方向插入膜中。本文所述技术假定使用碳菁染料，但也可使用其他染料，例如 FM1-43¹⁴。膜染色过程本身较为简单。培养的细胞仅需短暂暴露于少量 diI/diD 染料中（少于 10 秒），即可实现细胞膜的充分标记。加入过量染料会导致玻璃表面形成光散射聚集体，从而降低图像质量。细胞与染料孵育时间过长会导致染料被细胞内化，这会损害图像质量，并可能影响细胞活性。若细胞染色良好，则偏振（P）和垂直（S）发射图像之间将呈现明显差异。如图 2A所示，P 发射将清晰突出显示与盖玻片呈斜角的膜区域（即 细胞贴附区域的边缘），而 S 发射强度在整个细胞贴附区域大致均匀。如果 P 和 S 之间的差异不明显，则可能是细胞未能良好贴附于基底，或细胞膜状态不健康，此类细胞不应用于实验。

我们之前描述pTIRFM的研究中使用了diI作为荧光膜探针。本文采用diD，因为它适用于以GFP/pHluorin作为另一荧光团的双色成像实验。我们使用561 nm激光而非640 nm激光（后者更接近其激发峰）来激发diD，因为该荧光团在640 nm下的漂白速度更快。尽管561 nm激光位于diD已发表激发光谱的尾部区域，但仍能有效发射荧光。561 nm激光的另一个优势是它可同时激发diI和diD，使我们能够对两种探针使用相同的偏振设置。需要注意的是，荧光团在膜中的取向会影响膜拓扑结构的解释。例如，如果荧光团的跃迁偶极子垂直于膜平面（而非像diI或diD那样平行或接近平行），则非平面膜区域将更明显地通过S偏振光而非P偏振光发射被突出显示。

我们还描述了分离和电穿孔转染牛肾上腺嗜铬细胞的技术。牛嗜铬细胞是一种优良的分泌模型，具有易于培养、对多种促分泌剂有反应，以及拥有较大的分泌囊泡（可通过普通光学显微镜清晰观察）等优点。为了表达荧光蛋白，细胞在接种于胶原处理的培养皿前，先在悬浮状态下进行电穿孔。根据我们的经验，与Ca²⁺-磷酸钙法或Lipofectamine试剂相比，电穿孔的表达效率要高得多。电穿孔的缺点是需要更多的细胞（因为许多细胞无法存活下来）并依赖昂贵的商业试剂。目前尚不清楚具体原因，但并非所有细胞膜都能整合diD染料。此外，培养皿中仅有部分细胞被成功转染。要找到既成功转染又良好染色的细胞可能非常耗时，因此优化染色和电穿孔的条件非常值得。

综上所述，本文介绍了如何利用pTIRFM技术监测牛肾上腺嗜铬细胞中致密核心囊泡融合过程中发生的快速且局部的膜形变。尽管本文仅讨论了一种应用，但该技术非常适用于研究其他涉及膜形态变化的生物学过程，包括内吞作用、胞质分裂和细胞运动。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
iXon3 EMMCD 相机	Andor	897
IX81 倒置显微镜	Olympus		侧置滤光立方体组件
43 系列 Ar-Ion 激光器	CVI Milles Griot Laser Optics	543-AP-A01	可调至 488nm
Sapphire 561 LP 二极管激光器	Coherent		561nm
扫描振镜系统	Thorlabs	GVS102
VC3 通道焦点灌流系统	ALA Scientific Instruments	ALA VC3X4PP
QMM 石英微流控分配器	ALA Scientific Instruments	ALA QMM-4
10 PSI 压力调节器	ALA Scientific Instruments	ALA PR10
显微操作器	Burleigh	TS 5000-150
安装式消色差四分之一波片	Thorlabs	AQWP05M-600
420-680nm 偏振分光立方体	Thorlabs	PBS201
六位中性密度滤光轮	Thorlabs	FW1AND
步进电机驱动智能快门	Sutter Instruments	IQ25-1219
HQ412lp 二向色镜滤光片	Chroma	NC255583	合并 488nm 和 561nm 光束
镀膜平凹透镜	Edmund Optics	PCV 100mm VIS 0	发散 488nm 光束
镀膜平凹透镜	Edmund Optics	PCV 250mm VIS 0	发散 561nm 光束
镀膜平凸透镜	Edmund Optics	PCX 125mm VIS 0	聚焦两束光
镀膜平凸透镜	Edmund Optics	PCX 50mm VIS 0	粘合至滤光立方体组件
z488/561rpc 二向色镜	Chroma	z488/561rpc	滤光立方体二向色镜
z488/561_TIRF 发射滤光片	Chroma	z488/561m_TIRF	滤光立方体发射滤光片
UIS2 60x 物镜	Olympus	UPLSAPO 60XO	NA 1.37
Neon 转染系统	Invitrogen	MPK 5000
MetaMorph 成像软件	Molecular Devices
DiI 细胞膜染料	Invitrogen	V-22885	用于校准
TH Liberase	Roche	5401135001
TL Liberse	Roche	5401020001
牛源 DNAse I IV 型	Sigma	D5025
血细胞计数板	Fisher	0267110
DiD 细胞膜染料	Invitrogen	D-7757
罗丹明	Invitrogen	R634
0.22 μm 膜式注射器滤器单元	Millipore	SLGS033SS
Fluoresbrite 多色红色微球	Polysciences	19507	0.5 微米
浸油	Sigma	56822
LabVIEW	National Instruments		控制振镜
旋转培养瓶	Bellco	1965-00250