自由行走昆虫脑部的胞外金属丝四极记录

摘要

我们先前开发了一种将四极导线植入蟑螂脑中央复合体的技术，可实现对固定式蟑螂个体神经元单位活动的监测。本文介绍了该技术的一个改进版本，使我们还能够记录自由活动昆虫的脑部活动。

摘要

人们对脑部活动在昆虫运动控制中作用的兴趣日益增加，这就要求我们能够在昆虫执行自然行为的同时监测其神经活动。我们此前开发了一种将四极导线植入蟑螂脑中央复合体的技术，可在束缚状态下的蟑螂转弯或改变行走速度时，同时记录多个神经元的活动。尽管这一技术是一项重大进展，但束缚状态下的实验仅能观察到有限的行为，且常常缺乏自由活动动物中存在的反馈过程。现在，我们提出该技术的一种改进版本，使我们能够在蟑螂于实验区域内自由行走并通过对障碍物进行转向、攀爬或挖掘来应对时，记录其脑中央复合体的神经活动。结合高速视频记录与聚类分析，我们现在能够将脑部活动与自由活动昆虫运动的多种参数相互关联。

引言

本文介绍了一种成功记录蟑螂（Blaberus discoidalis）中央复合体（CC）内神经元活动的系统， 当昆虫在实验 arena 中行走并遇到导致其转身、钻过下方或攀爬越过的物体时，可记录其神经活动。这些导线还可连接至刺激器，以激发周围神经组织的活动，从而引发相应的行为变化。

在过去十年中，人们对不同脑区在控制昆虫行为中所起作用的关注显著增加。其中大部分研究集中于被称为中央复合体（CC）的中线脑神经毡区域。由于采用了多种技术来探究CC在行为中的作用，该领域已取得诸多进展。这些技术包括主要在黑腹果蝇（Drosophila）中进行的神经遗传学操作结合行为分析^1-3，以及用于监测CC内神经活动并尝试将该活动与行为相关参数关联起来的电生理学技术。   

电生理学 技术包括对单个已识别神经元进行的细胞内记录^4-9以及常使用多通道探针的细胞外记录^10,11。这两种技术具有互补性。采用锐电极或全细胞膜片钳进行的细胞内记录可提供关于已识别神经元的非常详细的数据，但一次仅限于一到两个细胞，要求限制或完全不移动，并且只能维持相对较短的时间。而细胞外记录易于设置，无需固定动物，可维持数小时。通过使用多通道四极电极和簇分离技术，可同时分析较大量的神经元群体^9,12。尽管全细胞膜片钳技术已成功应用于固定状态的昆虫¹³，但我们认为，仍有必要发展一些技术，以使我们能够在昆虫自由活动并遭遇前进障碍时，长时间记录其大脑中的神经活动。

由于昆虫在移动和上下弹跳时需要进行记录，这促使我们采用细胞外记录方法。我们曾使用商用的16通道硅探针在固定准备状态下成功实现了记录¹¹，但即使体型较大的蟑螂体积仍然很小，这意味着探针必须安装在身体之外。加之探针齿极为脆弱，因此不适合用于自由行走的实验准备。在之前的两个项目中，我们采用由细金属丝组成的四极导线束来实现类似的记录性能，但结构更为坚固。这些四极导线束使我们能够对 tethered（固定）蟑螂进行记录，并将中央复合体（CC）神经元活动与行走速度的变化¹⁴以及触角接触杆状物所引发的转向行为关联起来¹⁰。

尽管这些固定装置已经并将继续发挥重要作用，但它们确实存在一些局限性。首先，昆虫所能执行的行为被限制在一个平面内。也就是说，我们可以轻易诱发行走速度或转向行为的变化，但攀爬和掘洞等动作则无法实现，至少在典型的固定装置下是如此。其次，我们的固定装置属于“开环”系统，即无法为系统提供与正常运动相关的反馈。因此，当蟑螂在固定装置上转向时，其视觉环境并不会相应地发生变化。虽然可以构建闭环固定系统来引入此类反馈，但这类系统受限于模拟视觉环境的编程和硬件复杂性。尽管如此，我们仍认为，可以通过记录动物在实验区域或跑道中自由行走并遭遇自然环境中常见物体时的活动，来改进现有的固定记录方法。

尽管用于记录脑活动的无线系统¹⁵是理想选择，但目前的无线系统在记录通道数量、数据采集时间、电池寿命和重量方面仍存在局限性。因此，我们选择尝试将有线记录系统改造，用于自由活动的实验准备。随着更先进的无线系统逐步问世，该技术可轻松适配此类设备。本文所述系统重量轻，性能良好，似乎对蟑螂的行为几乎没有不良影响。结合低成本的高速摄像机和集群切割软件，可将单个脑神经元的活动与运动行为关联起来。本文将介绍四极电极导线的制备方法、其在昆虫脑内的植入技术，以及电活动和运动行为的记录方法，并说明如何整合这些数据以进行后续分析。

方案

1. 多通道电极丝的制备

1. 取出一根约1.1米长、直径为12 μm（带PAC涂层）的极细镍铬丝。在每根镍铬丝的两端贴上标签胶带，并将其悬挂在一根水平螺纹杆上，使两端高度一致且靠近实验台面。
2. 重复步骤1.1，再制备一根镍铬丝，共形成四个末端，将这根新丝放置在第一根丝旁边（间距约1厘米）。
3. 用标签胶带将四个末端绑在一起，并将该标签固定到一个电动旋转绕线装置上。该装置可由一个廉价的直流电机改装而成。
4. 以单向旋转绕线2分钟（60 rpm），然后反向解绕30秒。
5. 使用热风枪将镍铬丝熔合在一起。切勿让热风枪直接接触金属丝。从交替方向进行三次上下往复吹风，每次吹风持续约10秒。
6. 剪去绕线两端的顶部和底部。此时四根金属丝在一端已绞合并熔合在一起，而在另一端仍保持分离状态。
7. 添加支撑管。截取一段30厘米长的聚乙烯管（内径0.28 mm，外径0.61 mm）。将四线电极缓慢而小心地穿入支撑管中，避免产生弯折。
8. 当熔合端从另一侧穿出后，将其拉出，使导管两端露出的金属丝长度相等。
9. 用镊子夹住每根金属丝的分离端。使用燃气喷灯的火焰底部，小心烧去每根金属丝末端最后2至3毫米处的绝缘层。加热至金属丝发红，但不得卷曲。
10. 将四线电极连接至一个与记录设备匹配的公-母IC插座适配器。用镊子将每根金属丝的去绝缘端分别插入适配器的不同插孔中。 用小黄铜针固定插孔中的金属丝。使用尖头电烙铁将焊锡熔化后填满插孔。注意不要让电烙铁接触脆弱的金属丝。
11. 检测每根金属丝的阻抗以及每对金属丝之间的互阻抗。
    1. 将已熔合绞合的一端浸入盛有生理盐水的容器中，并将一根铜导线从盐水中引出连接至欧姆表。
    2. 将欧姆表的另一端连接至含有金属丝的插孔引脚。每根金属丝的阻抗应低于3 MΩ。 
    3. 若未达到上述数值，需重新尝试焊接连接。
    4. 将金属丝从盐水中取出，用水冲洗尖端，并测试每对金属丝之间的互阻抗（共6对）。互阻抗应高于5 MΩ。
    5. 若未达到上述数值，可在熔合端切去少量尖端部分后重新测试。 
    6. 对于未能满足所有金属丝阻抗要求的任何一组金属丝，应予以废弃。
12. 固定四线电极。
    1. 折叠一个略大于插座适配器的小型矩形纸盒。
    2. 将适配器放入纸盒中，使公头朝下。穿刺纸盒，使公头的所有引脚位于盒外，而适配器其余部分位于盒内。
    3. 用胶带从外部固定纸盒的四个角。在纸盒内部使用小块双面胶带固定每一根金属丝，确保金属丝在穿出纸盒时保持熔合状态。
    4. 混合快速固化双组分环氧树脂，并倒入纸盒中以固定适配器和所有金属丝。
    5. 用牙科蜡将导管的近端固定在纸盒一侧，但保持导管开口，以便四线电极可在两端自由滑动。
13. 修尖四线电极。
    1. 每次实验前，使用锋利的手术刀片（而非剪刀）切割四线电极的尖端。此举可防止金属丝末端受压变形或散开，同时为下一步提供平整的切割面。
       1. 使用垂直安装的小型旋转工具，配备中等和细粒度砂轮（可组合在同一平台上），对四线电极进行抛光并去除部分尖端绝缘层。用镊子夹住束线末端附近位置。将束线末端倾斜至与砂轮呈45°角，轻轻接触中等转速旋转的砂轮，先用中等粒度砂轮处理约1至2秒，再用细粒度砂轮重复相同操作。上述过程共重复四次，每次将束线沿轴向旋转90°。关键在于砂轮的旋转方向必须远离金属丝末端的浅角，否则可能导致金属丝分离。
       2. 理想结果是将束线末端由平直边缘转变为尖锐的锥形，且每根金属丝末端仅去除少量绝缘层。在电镀前使用解剖显微镜确认尖端形态。若发现尖端有毛刺，需重新切割并抛光。
       3. 若在后续电镀步骤中的阻抗测试显示金属丝间阻抗极低（小于4 MΩ），表明抛光过程中去除材料过多。应重新切割并抛光四线电极。
    2. 对四线电极进行电镀。将四线电极尖端浸入饱和硫酸铜溶液（85 ml水，5 ml硫酸，50 g硫酸铜）中。使用刺激隔离器对每根金属丝施加2.5 μA电流进行电镀。通电1秒，暂停1秒，重复此过程4次。
    3. 检测每根金属丝的阻抗及每对金属丝之间的互阻抗。每根金属丝的阻抗应在0.5–1 MΩ之间，互阻抗应高于4 MΩ。
    4. 将适配器安装至多通道记录系统的前置放大器上。
    5. 将一根弯曲的昆虫针固定在微操作器上，并用牙科蜡将四线电极尖端固定在昆虫针尖端。

2. 动物准备

1. 用冰对蟑螂进行麻醉。
2. 待蟑螂停止活动后，使用大号鞍形针将其垂直固定在平整的软木表面，鞍形针应跨过昆虫身体但不穿透其任何部位。
3. 将制备好的标本转移至塑料容器中，并在动物周围放置冰块以减少血液流动和身体移动。
4. 在颈部放置一个塑料颈圈以支撑头部，并在头部周围使用牙科蜡固定头部。
5. 用剃刀片在单眼之间切开一个小窗口，并去除头部的几丁质外骨骼。
6. 用镊子清除结缔组织和脂肪，暴露脑组织。
7. 向头囊内加入适量蟑螂生理盐水，覆盖脑组织。
8. 为剥离脑被膜，使用精细镊子轻轻夹住脑表面的被膜，再用另一把精细镊子在已植入导线的区域将被膜撕开。
9. 用昆虫针在脑前部的头囊上开一个小孔。将三根较粗（56 µm）的绝缘铜线编织成的导线插入孔中，作为参考/接地电极。
10. 使用显微操作器将四极记录电极的尖端降至脑表面，并将其定位在目标脑区附近。
11. 在头囊上电极前后两侧，小心放置两小片略大于头囊开口的薄醋酸盐片（2 mm × 1 mm）。
12. 打开记录系统。
13. 根据记录质量，缓慢将四极记录电极下移 150–250 µm 至脑表面以下。
14. 关闭记录系统。
15. 将两片醋酸盐片尽可能靠近四极记录电极放置，但不得接触电极（图 1A）。
16. 加热一个小刮刀或压扁的皮下注射针，插入牙科蜡中，使刮刀尖端带有液态蜡。小心地用刮刀接触距四极记录电极较远的每片醋酸盐片末端，使液态蜡流至每片上，密封其与头囊几丁质之间的缝隙。
17. 重复步骤 2.16。 每次在醋酸盐片上滴加少量液态蜡。操作从远离四极记录电极处开始，逐步向其靠近。最终四极记录电极将被牙科蜡固定。注意避免热蜡进入脑腔或接触脑组织。
18. 采用与步骤 2.16 和 2.17 相同的方法，用牙科蜡固定参考/接地电极。
19. 加热连接四极记录电极与显微操作器的牙科蜡，使四极记录电极脱离显微操作器。
20. 将四极记录电极弯曲成环状，嵌入头部的牙科蜡中，以提供应力缓解（图 1B）。
21. 用牙科蜡覆盖应力缓解环（图 1C）。
22. 小心移除所有固定装置，将标本转移至培养皿中，用大号鞍形针将标本背侧朝上固定。
23. 使用热熔胶枪将一根杆状物固定在前胸背板上。该杆为一根从前胸背板延伸至腹部上方的木棒。
24. 用牙科蜡将四极记录电极导管的末端固定在木棒的后端。
25. 用牙科蜡将四极记录电极和参考/接地电极固定在木棒的前端。
26. 从导管插座端尽可能拉出四极记录电极，但不要用力牵拉，以避免动物活动时损坏导管外露部分 （图 1D）。
27. 移除所有固定装置。用牙科蜡将参考/接地电极固定在四极记录电极导管上。
28. 实验前至少等待 60 分钟，使动物从冰麻醉中充分恢复。

3. 实验步骤

1. 使用 USB 转串口线缆将一台 PC 与记录系统及 LED 灯连接。
2. 开始神经信号记录。
3. 使用 Motmot 图像采集包以每秒 20 帧的速度开始行走实验的视频记录，或使用高速相机以每秒 120 帧的速度进行攀爬实验的视频记录¹⁶。
4. 将蟑螂放入一个 40 cm × 40 cm 的聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）实验 arena 中进行行走实验，或放入一个长 58 cm、宽 5 cm、高 5 cm 的 arena 中进行攀爬实验。行走实验 arena 的右侧墙中部向中心延伸有一透明屏障，头端装置位于该屏障上方，用于防止动物进入被头端装置遮挡摄像视野的区域。攀爬实验 arena 的中央位置设有一个丙烯酸块（高度为 1.2 cm 或 1.8 cm，宽 5 cm）或高度相近的平台。
5. 通过自定义 MATLAB 命令从 PC 生成 TTL 脉冲。（s=serial('COM4'); fopen(s); s.RequestToSend='off'/s.RequestToSend='on'/; fclose(s); delete(s);）。该 TTL 脉冲为记录系统生成时间戳，并用于开启或关闭 LED 灯。 
6. 让蟑螂在 arena 中自由探索，直至其在行走实验中静止不动超过 30 秒；在攀爬实验中，允许蟑螂翻越障碍块/平台或从平台下方穿过。 
7. 停止视频记录。
8. 停止神经信号记录。
9. 记录由 TTL 脉冲生成的时间戳。
10. 将蟑螂从 arena 中移除，并等待至少 3 分钟。
11. 对下一次试验重复执行步骤 3.2–3.10 。
12. 完成所有记录后，通过一根导线尖端（阳极）和参考电极（阴极）施加持续 5 秒、5 µA 的直流电流，使铜在脑内导线尖端处沉积。

4. 离线分析

1. 通过关联 LED 灯亮起时的视频帧与记录系统在该时刻记录的时间戳，实现视频与神经数据的同步。
2. 标记导线尖端位置。采用 Timms 增强法在 12 µm 连续切片中沉淀并观察铜沉积¹⁷。明显的沉积物应在 3–8 个相邻切片中可见（约占我们记录区域背腹面长度的 18–48%）（图 2）。
3. 将特定电脉冲与单个神经元的活动相关联。按照 elsewhere^10,14,18 中详细描述的 spike 分选流程进行操作。使用 KlustaKwik 程序（版本 1.5，作者 K. Harris，罗格斯大学）生成初始的自动聚类，然后将其导入 MClust 程序（版本 3.5，作者 A.D. Redish et al.，明尼苏达大学）进行进一步优化与分析（图 3）。
4. 追踪蟑螂的运动。在行走实验中，使用 Caltech 多果蝇追踪器（版本 0.1.5.6；http://ctrax.sourceforge.net/）及配套的 MATLAB FixErrors 工具箱¹⁹，提取视频每一帧中蟑螂（视觉）质心位置及其身体朝向。在攀爬实验中，使用运动分析软件包提取视频每一帧中木块以及蟑螂头部和前胸背板的位置。

结果

我们在27个用于行走实验的制备样本中记录了中央复合体（CC）的50个神经元单位的神经活动。其中15个制备样本（23个单位）还进行了攀爬实验。各个神经元单位根据制备编号和单位编号命名（例如，“单位1-2”表示第1个制备样本中的第2个单位）。

一次攀爬实验视频的截图如图4所示。完整视频见补充材料视频1（声音来自单元1-2）。记录来自右侧扇形体（FB）。当蟑螂遇到障碍物时停止行走，并利用触角探测障碍物（图4A-C）。随后，蟑螂抬起身体前部，改变身体与基底之间的角度（图4D-E），然后将腿摆向障碍物顶部并翻越过去（图4F-I）。每帧上方显示了蟑螂的运动速度和高度，以及从第一帧到当前帧两个已分类神经元单元的瞬时放电频率。瞬时放电频率通过使用宽度为50毫秒的高斯核对每个单元的脉冲时间进行平滑处理计算得到。在攀爬过程中，单元1-1的放电频率上升，且其上升早于运动速度的增加（图4I

讨论

尽管以往关于昆虫脑内中央复合体（CC）或其他脑区的电生理学研究使我们对行为的中枢调控机制有了深入认识，但这些研究大多是在固定不动的准备状态^9,11或 tethered（束缚飞行）状态^10,14下进行的。因此，动物的感觉体验和生理状态可能与自然状态存在显著差异。此外，在这些条件下，动物所能执行的行为任务仅限于单一平面内。本文中，我们介绍了一种在自由活动的蟑螂中记录中央复合体（CC）电活动的方法。我们希望已为您在自己的实验室中开展自由活动昆虫的电生理记录提供了所需的全部信息。我们展示了所使用系统（Neuralynx、MClust、WinAnalzye 和 Ctrax）的操作流程，但一旦记录电极成功植入，记录系统可轻松适配于其他设备。 

我们已完成27次制备，迄今为止尚无任何实验因蟑螂损坏导线组而终止。我们未观察到动物有任何试图清理或移除导线组、石蜡或杆件的行为。植入后的蟑螂行走步态正常，能够像未手术个体一样在实验区域内自由探索并完成攀爬任务。我们的实验通常在植入四极电极后持续...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镍铬丝	Sandvik Heating Technology	Kanthal RO-800	用于制作四极电极
医用级聚乙烯管	A-M Systems	800700	用作四极电极套管
Lynx-8	Neuralynx		用于多通道单位放电记录
Cheetah 32	Neuralynx		用于多通道单位放电记录
高速相机	Basler	A602f	用于行走实验的视频记录
高速相机	Casio	EX-FC150	用于攀爬实验的视频记录
WINanalyze	Winanalyze	版本 1.4 3D	用于视频追踪分析
MATLAB	MathWorks	MATLAB R2012b	用于TTL脉冲生成及离线数据分析