自由行走昆虫脑部的胞外金属丝四极记录

摘要

我们先前开发了一种将四极导线植入蟑螂脑中央复合体的技术，可实现对固定式蟑螂个体神经元单位活动的监测。本文介绍了该技术的一个改进版本，使我们还能够记录自由活动昆虫的脑部活动。

摘要

人们对脑部活动在昆虫运动控制中作用的兴趣日益增加，这就要求我们能够在昆虫执行自然行为的同时监测其神经活动。我们此前开发了一种将四极导线植入蟑螂脑中央复合体的技术，可在束缚状态下的蟑螂转弯或改变行走速度时，同时记录多个神经元的活动。尽管这一技术是一项重大进展，但束缚状态下的实验仅能观察到有限的行为，且常常缺乏自由活动动物中存在的反馈过程。现在，我们提出该技术的一种改进版本，使我们能够在蟑螂于实验区域内自由行走并通过对障碍物进行转向、攀爬或挖掘来应对时，记录其脑中央复合体的神经活动。结合高速视频记录与聚类分析，我们现在能够将脑部活动与自由活动昆虫运动的多种参数相互关联。

引言

本文介绍了一种成功记录蟑螂（Blaberus discoidalis）中央复合体（CC）内神经元活动的系统， 当昆虫在实验 arena 中行走并遇到导致其转身、钻过下方或攀爬越过的物体时，可记录其神经活动。这些导线还可连接至刺激器，以激发周围神经组织的活动，从而引发相应的行为变化。

在过去十年中，人们对不同脑区在控制昆虫行为中所起作用的关注显著增加。其中大部分研究集中于被称为中央复合体（CC）的中线脑神经毡区域。由于采用了多种技术来探究CC在行为中的作用，该领域已取得诸多进展。这些技术包括主要在黑腹果蝇（Drosophila）中进行的神经遗传学操作结合行为分析^1-3，以及用于监测CC内神经活动并尝试将该活动与行为相关参数关联起来的电生理学技术。   

电生理学 技术包括对单个已识别神经元进行的细胞内记录^4-9以及常使用多通道探针的细胞外记录^10,11。这两种技术具有互补性。采用锐电极或全细胞膜片钳进行的细胞内记录可提供关于已识别神经元的非常详细的数据，但一次仅限于一到两个细胞，要求限制或完全不移动，并且只能维持相对较短的时间。而细胞外记录易于设置，无需固定动物，可维持....

方案

1. 多通道电极丝的制备

1. 取出一根约1.1米长、直径为12 μm（带PAC涂层）的极细镍铬丝。在每根镍铬丝的两端贴上标签胶带，并将其悬挂在一根水平螺纹杆上，使两端高度一致且靠近实验台面。
2. 重复步骤1.1，再制备一根镍铬丝，共形成四个末端，将这根新丝放置在第一根丝旁边（间距约1厘米）。
3. 用标签胶带将四个末端绑在一起，并将该标签固定到一个电动旋转绕线装置上。该装置可由一个廉价的直流电机改装而成。
4. 以单向旋转绕线2分钟（60 rpm），然后反向解绕30秒。
5. 使用热风枪将镍铬丝熔合在一起。切勿让热风枪直接接触金属丝。从交替方向进行三次上下往复吹风，每次吹风持续约10秒。
6. 剪去绕线两端的顶部和底部。此时四根金属丝在一端已绞合并熔合在一起，而在另一端仍保持分离状态。
7. 添加支撑管。截取一段30厘米长的聚乙烯管（内径0.28 mm，外径0.61 mm）。将四线电极缓慢而小心地穿入支撑管中，避免产生弯折。
8. 当熔合端从另一侧穿出后，将其拉出，使导管两端露出的金属丝长度相等。
9. 用镊子夹住每根金属丝的分离端。使用燃气喷灯的火焰底部，小心烧去每根金属丝末端最后2至3毫米处的绝缘层。加热至金属丝发红，但不得卷曲。
10. 将四线电极连接至一个与记录设备匹配的公-母IC插座适配器。用镊子将每根金属丝的去绝缘端分别插入适配器的不同插孔中。 用小黄铜针固定插孔中....

结果

我们在27个用于行走实验的制备样本中记录了中央复合体（CC）的50个神经元单位的神经活动。其中15个制备样本（23个单位）还进行了攀爬实验。各个神经元单位根据制备编号和单位编号命名（例如，“单位1-2”表示第1个制备样本中的第2个单位）。

一次攀爬实验视频的截图如图4所示。完整视频见补充材料视频1（声音来自单元1-2）。记录来自右侧扇形体（FB）。当蟑螂遇到障碍物时停止行走，并利用触角探测障碍物（图4A-C）。随后，蟑螂抬起身体前部，改变身体与基底之间的角度（图4D-E），然后将腿摆向障碍物顶部并翻越过去（图4F-I）。每帧上方显示了蟑螂的运动速度和高度，以及从第一帧到当前帧两个已分类神经元单元的瞬时放电频率。瞬时放电频率通过使用宽度为50毫秒的高斯核对每个单元的脉冲时间进行平滑处理计算得到。在攀爬过程中，单元1-1的放电频率上升，且其上升早于运动速度的增加（图4I

讨论

尽管以往关于昆虫脑内中央复合体（CC）或其他脑区的电生理学研究使我们对行为的中枢调控机制有了深入认识，但这些研究大多是在固定不动的准备状态^9,11或 tethered（束缚飞行）状态^10,14下进行的。因此，动物的感觉体验和生理状态可能与自然状态存在显著差异。此外，在这些条件下，动物所能执行的行为任务仅限于单一平面内。本文中，我们介绍了一种在自由活动的蟑螂中记录中央复合体（CC）电活动的方法。我们希望已为您在自己的实验室中开展自由活动昆虫的电生理记录提供了所需的全部信息。我们展示了所使用系统（Neuralynx、MClust、WinAnalzye 和 Ctrax）的操作流程，但一旦记录电极成功植入，记录系统可轻松适配于其他设备。 

我们已完成27次制备，迄今为止尚无任何实验因蟑螂损坏导线组而终止。我们未观察到动物有任何试图清理或移除导线组、石蜡或杆件的行为。植入后的蟑螂行走步态正常，能够像未手术个体一样在实验区域内自由探索并完成攀爬任务。我们的实验通常在植入四极电极后持续.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
镍铬丝	Sandvik Heating Technology	Kanthal RO-800	用于制作四极电极
医用级聚乙烯管	A-M Systems	800700	用作四极电极套管
Lynx-8	Neuralynx		用于多通道单位放电记录
Cheetah 32	Neuralynx		用于多通道单位放电记录
高速相机	Basler	A602f	用于行走实验的视频记录
高速相机	Casio	EX-FC150	用于攀爬实验的视频记录
WINanalyze	Winanalyze	版本 1.4 3D	用于视频追踪分析
MATLAB	MathWorks	MATLAB R2012b	用于TTL脉冲生成及离线数据分析