共识脑源性蛋白，人类和小鼠脑蛋白质组使用两个2D-DIGE和Mini双向电泳免疫印迹法研究提取协议

Summary

用尿素/硫脲/ SDS缓冲液为人类和小鼠脑组织中一种常见的蛋白提取协议允许由蛋白质2D-DIGE并随后将其表征迷你2DE免疫印迹鉴定。这种方法使一个人从活组织切片检查和实验模型获得更多的可重复性和可靠的结果。

Abstract

二维凝胶电泳（2DE）是一个功能强大的工具来揭示蛋白质组的修改可能涉及到不同的生理或病理条件。基本上，这种技术是基于根据其等电点在第一步骤中，根据它们的分子量经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的蛋白质的分离，其次。在这份报告中对人类的验尸和小鼠脑组织中少量的优化样品制备协议描述。此方法使得能够同时执行二维荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）和迷你2DE免疫印迹。这些方法的组合，使人们不仅发现新的蛋白质和/或蛋白质修饰在它们的表达由于其与质谱检测的兼容性，又是一个新的洞察标记验证。因此，微型2DE耦合到西方墨点法证识别和验证后翻译后修饰，蛋白质分解代谢，并提供在不同的条件和/或治疗方法的定性比较。本文中，我们提供了研究中的AD和路易体痴呆，如β-淀粉样肽和α-突触核蛋白中找到的蛋白质聚集体的成分的方法。我们的方法，因此可以适用于蛋白质组的分析和不溶性蛋白质从人脑组织和小鼠模型中提取了。同时，它可提供用于所涉及的神经变性疾病以及潜在的新型生物标志物和治疗靶标分子和细胞途径的研究的有用信息。

Introduction

精神和神经紊乱代表全球疾病负担的13％，如病理生理机制，危险因素和前驱的生物标志物的新挑战，必须探索^1。为配合这一目标，人类大脑的蛋白质组学研究成为不可或缺揭开参与像记忆，行为，情绪和神经元的可塑性，例如，不仅对生理也为病理状态过程的分子途径。因此，在使用动物模型的更具体的转基因小鼠，带来了广泛的可能性，以模仿人类神经退行性疾病²的病因。

蛋白质组学方法是时下为了实现这些新的观点在神经科学领域。二维凝胶电泳（2DE）是一种有效的和可能的简单的方法，使比较大范围的样品的蛋白质组。此外，它也是一个强大的方法，以便确定从复杂混合物中分离出的蛋白质和通过质谱法进一步分析。这种技术基本上是由在两个连续的步骤:根据其等电点（pI）1）蛋白的分离通过等电聚焦（IEF）。更精确地说，将电势穿过固丙烯酰胺条施加之间的pH梯度，然后将蛋白质转移和集中在其全球净电荷的函数所确定的等电点。 2）等电聚焦蛋白质变性并通过加入十二烷基硫酸钠（SDS带负电荷），从而在其第一结构的蛋白质根据它们的表观分子量（MW）用SDS-PAGE ³分离。这两个不同的特性使我们能够解决一个double值在蛋白质组研究中走得更远。一方面这种方法提供了可能用最小的染料2D-DIGE法进行定量分析，并在另一方面一个qualitativE解析由微型二维超声耦合到西方墨点法。

通过2D-DIGE定量分析赐蛋白表....

Protocol

1，同质化，并从人类和小鼠脑组织总蛋白抽提

1. 脑组织的同质化。均匀化用陶工玻璃（用于人类样品），或特氟隆匀浆器（用于小鼠的样品）的脑组织中的10％（重量/体积）的8M尿素，2M硫脲和1％w / v的SDS缓冲液（UTS）。超声在60 Hz 30脉冲申请0.5秒，共组织解体^13，14一个超声波发生器。
   1. 测定蛋白浓度与Bradford法，以BSA作为标准。这UTS缓冲器提取是用一维SDS-PAGE上完全兼容，只要溶解物没有过度加热，以避免氨甲酰^15。
   2. 添加1％（重量/体积）的Amberlite时及在室温下10分钟并轻轻搅拌下孵育。此后过滤到0.22微米的针头式过滤器，最后加SDS的尿素/硫脲溶液。此步骤会降低尿酸和异氰酸的量，这是在equilibr与脲鎓溶液中，并促进其降解。
2. 氯仿/甲醇沉淀蛋白。蛋白质之间100-150微克沉淀为11厘米IPG胶条和1-1.5毫克18厘米的人（独立于选定进行IEF的pH值范围内）。
   1. 执行在冰上或4°C的所有步骤凉爽的氯仿和甲醇，在4℃下开始沉淀步骤之前30分钟。
   2. 添加三卷甲醇和氯仿一个卷UTS的裂解液中的一个量。手动摇动混合物，并添加三个体积的冷水。中1分钟，并通过离心在4℃下沉淀的蛋白质以12,000×g离心30分钟涡旋
   3. 用巴斯德吸管弃上清，加入3体积的冷甲醇。旋涡再次在30分钟内于4℃下12,000×g离心最后，弃上....

Results

对脑组织蛋白质组学仍然具有挑战性，因为没有理想的缓冲区存在收回100％的蛋白质，特别是膜相关或细胞骨架蛋白。在第一组实验都集中于寻找与这两种方法和使以回收蛋白质的大面板兼容合适的裂解缓冲液。因此，3裂解缓冲液进行测定，以确定最合适的一个。首先，它是用来将共同的生化和分子生物学缓冲的Tris-HCl ²⁰在10mM的含1％（重量/体积）SDS（图1A）。此外，Tris-盐酸具有强大的应用如聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶电泳缓冲液中。其他两种裂解缓冲液为UTS（图1B）和2DE 1。的Tris-SDS产生一个贫穷的分辨率和斑点的数目被大大降低（图1B）在与悉尼科技大学，其中一个高点分离，无畸变和FA观察到的分布比较Ř更好回收蛋白的观察（图1B）。这一点是由悉尼科技大学萃取率几乎没有残留颗粒，而的Tris-HCl欠了厚厚一本板凳离心后的事实支持。该图案显示在图1B清楚地给出了关于其他缓冲液如的Tris-HCl在UTS较高的蛋白质溶解度的证据。 Nothewort.......

Discussion

发现蛋白质的表达病理变化，寻找生物标记物和药物靶潜在途径的调节是其中neuroproteomics的目标接近^30。在一片新兴的工具，在二维超声心动图场增加了一个有前途的预想。然而，一个共识应以尽量减少可变性和提高重现性在实验中达到。在这种思想的行标准化协议来执行2D-DIGE（ 图2）和随后的2DE免疫印迹（ 图3），对人类和小鼠的脑组织与一维免疫印迹完全兼容本文中详细描述。

其中最大的难题在蛋白质组学是溶解缓冲液的选择。为了增加不同的方法之间的再现性，UTS被选择，因为它是用IEF完全兼容。此外，UTS提取缓冲液产生任何PELLET或离心12,000×g离心后真的稍微一（不与SDS沉淀在4℃混淆）。这是一个关键点要考虑到许多神经退行性疾病存在的蛋白质聚集，包括AD。事实上，没有沉淀简化了性能和数据解释，因为没有独立的研究应该为可溶和不可溶级分来完成。

无论2D-DIGE或mini-2D的方法将要进行的，也有一些限制，应当说明。首先在UT.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo	GE Healtcare	25-8010-65
Immobiline DryStrip	GE Healtcare		参考在pH区间/大小的作用
IPG缓冲液，pH X-X	GE Healtcare		参考在所需的pH区间的作用
AMBERLITE IRN-150L混合床树脂 1	GE Healtcare	551797N
DRYSTRIP 覆盖液体固定 1 * 1 升	GE Healtcare	17-1335-01
套件盒 IPG 1 * 1 套件	GE Healtcare	28-9334-92	塑料盒进行被动补液
MILLEX GS 过滤器	Millipore	SLGS033SB
Criterion XT 预制胶 13.3 x 8.7 厘米（宽 x 长）	Bio-Rad		参考 MW 分离
IPGphor III 等电聚焦单元	GE Healtcare	11-0033-64
Ettan DALTsix 大型电泳系统	GE Healtcare	80-6485-08
OneTouch 2D 凝胶 SpotPicker 1.5 mm	凝胶公司	P2D1.5