一种使用尿素/硫脲/SDS缓冲液从人和小鼠脑组织中提取蛋白质的常用方法，可实现通过二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）对蛋白质进行鉴定，并随后通过微型二维电泳免疫印迹法（mini 2DE immunoblotting）对其进行表征。该方法有助于从人类活检样本和实验模型中获得更可重复且可靠的结果。
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摘要
摘要
双向凝胶电泳（2DE）是一种强大的工具，可用于揭示可能与不同生理或病理状态相关的蛋白质组变化。该技术的基本原理是首先根据蛋白质的等电点进行分离，然后在第二步中通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）根据其分子量进行分离。本文描述了一种针对少量人死后脑组织和小鼠脑组织的优化样品制备方案。该方法可用于进行双向荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）以及微型双向凝胶电泳免疫印迹（mini 2DE immunoblotting）。结合这两种方法，不仅因其与质谱检测兼容而能够发现新的蛋白质和/或蛋白质表达中的修饰，还能进一步验证生物标志物。因此，微型双向凝胶电泳与蛋白质印迹联用可实现对翻译后修饰、蛋白质降解过程的鉴定与验证，并可在不同条件和/或处理之间进行定性比较。本文中，我们提供了一种用于研究阿尔茨海默病（AD）和路易体痴呆中蛋白质聚集体组分的方法，例如淀粉样β肽和α-突触核蛋白。该方法也可适用于人脑组织及小鼠模型中蛋白质组和不溶性蛋白质提取物的分析。同时，该方法还可为研究神经退行性疾病相关的分子与细胞通路，以及潜在的新型生物标志物和治疗靶点提供有价值的信息。
引言
精神与神经系统疾病占全球疾病负担的13%，必须深入探索诸如病理生理机制、风险因素以及前驱期生物标志物等新挑战1。为实现这一目标，开展人类大脑的蛋白质组学研究至关重要，有助于揭示参与记忆、行为、情绪及神经元可塑性等过程的分子通路，不仅适用于生理状态，也适用于病理状态。因此，动物模型尤其是转基因小鼠的应用，为模拟人类神经退行性疾病的病因提供了广泛的可能性2。
目前已有多种蛋白质组学方法可用于实现神经科学领域这些新的研究视角。二维凝胶电泳（2DE）是一种高效且相对简单的方法，能够比较多种样品的蛋白质组。此外，该技术也是一种从复杂混合物中分离蛋白质以进行质谱鉴定和进一步分析的有力手段。该技术主要包括两个连续步骤：1）通过等电聚焦（IEF）根据蛋白质的等电点（pI）进行分离。具体而言，在固定pH梯度的固相pH梯度胶条上施加电场，蛋白质会依据其整体净电荷迁移并聚焦于其特定的pI位置。2）将等电聚焦后的蛋白质通过添加十二烷基硫酸钠（SDS）进行变性并带上负电荷，从而使蛋白质在其一级结构状态下依据其表观分子量（MW）通过SDS-PAGE3进行分离。这两个不同的分离维度使得我们能够更深入地开展蛋白质组研究。一方面，该方法可结合微量染料2D-DIGE技术实现定量分析；另一方面，也可通过小型2DE联合蛋白质印迹法（western blotting）进行定性分析。
通过二维差异凝....
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方案
1. 人和小鼠脑组织的匀浆及总蛋白提取
- 脑组织匀浆化。使用玻璃匀浆器（用于人源样本）或聚四氟乙烯匀浆器（用于小鼠样本），在8 M尿素、2 M硫脲和1%（w/v）SDS缓冲液（UTS）中以10%（w/v）的比例匀浆脑组织。使用超声波发生器在60 Hz条件下进行30次脉冲处理，每次0.5秒，以实现组织的完全裂解13,14。
- 采用Bradford法测定蛋白浓度，以BSA作为标准品。该UTS缓冲液提取方法完全适用于一维SDS-PAGE，只要避免裂解液过热以防止发生氨基甲酰化15。
- 加入1%（w/v）Amberlite树脂，在室温下轻柔混匀孵育10分钟。随后通过0.22 µm注射器滤器过滤，并最终向尿素/硫脲溶液中添加SDS。此步骤可减少溶液中与尿素处于平衡状态的尿酸和异氰酸含量，从而减缓尿素的降解。
- 氯仿/甲醇蛋白沉淀。为11 cm IPG胶条沉淀100–150 µg蛋白，为18 cm胶条沉淀1–1.5 mg蛋白（与所选IEF的pH范围无关）。
- 所有操作步骤均在冰上或4 °C条件下进行。在开始沉淀前，将氯仿和甲醇于4 °C预冷30分钟。
- 向一体积的UTS裂解液中加入三体积甲醇和一体积氯仿，手动振荡混合，再加入三体积冷蒸馏水。涡旋混匀1分钟，于4 °C以12,000 × g离心30分钟以沉淀蛋....
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结果
脑组织蛋白质组学研究仍然具有挑战性，因为目前尚无理想的缓冲液能够完全回收所有蛋白质，尤其是膜结合蛋白或细胞骨架蛋白。第一组实验旨在寻找一种适合两种方法且能广泛回收多种蛋白质的裂解缓冲液。为此，测试了三种裂解缓冲液以确定最适宜的一种。首先使用的是常见的生化与分子生物学缓冲液 Tris-HCl20 10 mM，含1% (w/v) SDS （图1A）此外，Tris-HCl 广泛用作聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳的缓冲液。另外两种裂解缓冲液为 UTS （图 1B） 以及二维电泳结果。Tris-SDS 获得的分辨率较差，且蛋白点数量显著减少 （图 1B） 与UTS观察到的图谱相比，后者表现出较高的斑点分离度、无畸变以及更佳的蛋白质回收效果 （图 1B）这一点由以下事实支持：UTS提取法几乎不产生残余沉淀，而Tris-HCl在台式离心后则形成较厚的沉淀。图中显示的模式表明 图1B 清楚地表明，与其他缓冲液（如 Tris-HCl）相比，UTS 缓冲液中的蛋白质溶.......
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讨论
发现蛋白质的病理性表达变化、寻找生物标志物以及调控潜在的药物靶点通路，是神经蛋白质组学研究的重要目标30。在众多新兴技术中，双向电泳（2DE）领域展现出良好的前景。然而，为了最大限度地减少实验变异性并提高可重复性，亟需建立统一的标准。基于这一理念，本文详细描述了一种标准化的操作流程，用于对人和小鼠脑组织进行二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）（图2）以及后续的二维电泳免疫印迹（2DE免疫印迹）（图3），该流程与一维免疫印迹完全兼容。
蛋白质组学中最大的难题之一是溶解缓冲液的选择。为了提高不同方法之间的可重复性，选择了UTS，因为它与等电聚焦（IEF）完全兼容。此外，使用UTS提取缓冲液在12,000 × g离心后不会产生沉淀或仅产生极微量沉淀（不要与4 °C下SDS沉淀混淆）。这一点至关重要，因为许多神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病，AD）均涉及蛋白质聚集。由于无沉淀产生，实验操作和数据分析得以简化，无需分别对可溶性和不可溶性组分进行独立研究。
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作得到了法国国家健康与医学研究院（Inserm）、里尔第二大学、MEDIALZ、LabEx（卓越实验室，“未来投资计划”项目）以及DISTALZ（阿尔茨海默病多学科创新策略发展项目）的支持。F-J.F-G 目前获得法国国家科研署（ANR）资助（NeuroSplice de Tau 项目 ANR-2010-BLAN-1114 01），但本工作也曾得到西班牙卡斯蒂利亚-拉曼查自治区政府（JCCM）资助项目的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CyDye DIGE 荧光最小试剂盒 5 nmol 1 * 5 Nmo | GE Healtcare | 25-8010-65 | |
| Immobiline DryStrip | GE Healtcare | 根据pH区间/尺寸选择参考编号 | |
| IPG 缓冲液，pH X-X | GE Healtcare | 根据所需pH区间选择参考编号 | |
| AMBERLITE IRN-150L 混床树脂 1 | GE Healtcare | 551797N | |
| DRYSTRIP 覆盖液 Immobiline 1 * 1 L | GE Healtcare | 17-1335-01 | |
| IPG 试剂盒箱 1 * 1 套装 | GE Healtcare | 28-9334-92 | 用于被动水化的塑料盒 |
| MILLEX GS 滤器 | Millipore | SLGS033SB | |
| Criterion XT 预制凝胶 13.3 x 8.7 cm（宽 x 长） | Bio-Rad | 根据待分离分子量选择参考编号 | |
| IPGphor III 等电聚焦仪 | GE Healtcare | 11-0033-64 | |
| Ettan DALTsix 大型电泳系统 | GE Healtcare | 80-6485-08 | |
| OneTouch 2D 凝胶斑点挑取器 1.5 mm | Gel Company | P2D1.5 |
参考文献
- Collins, P. Y., et al. Grand challenges in global mental health. Nature. 475, 27-30 (2011).
- De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468. , Humana Press. 449-468 (2011).
- O'Farrell, P. H.
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重印与许可
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