本文详细介绍了利用三维（3D）实验方法定量分析乳腺癌细胞侵袭的技术。具体而言，我们讨论了建立此类实验所需的步骤、定量方法与数据分析，以及检测细胞侵袭过程中细胞膜完整性丧失的相关方法。
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摘要
摘要
如今已广为人知，细胞和组织的微环境是影响肿瘤发生与进展的关键调控因素。此外，细胞外基质（ECM）已被证实是在培养条件下及体内稳态中调控细胞行为的关键因子。 体内目前在二维（2D）塑料表面培养细胞的方法会导致细胞与其微环境之间复杂相互作用的紊乱和丧失。通过采用三维（3D）培养检测方法，可建立类似于体内条件的细胞-微环境相互作用环境。 体内 微环境。本文提供了一种在三维基底膜蛋白基质中培养乳腺癌细胞的详细方法，展示了三维培养在评估细胞向周围环境侵袭方面的潜力。此外，我们还讨论了如何通过免疫染色技术利用这些三维实验体系来检测调控上皮形态的信号分子的丢失情况。这些研究有助于揭示调控乳腺癌扩散过程中侵袭机制的重要细节。
引言
单个或集体细胞的迁移与侵袭是癌症的两个重要特征，也是癌细胞发生转移扩散所必需的过程1-4。癌细胞启动转移的能力取决于其利用侵袭伪足降解细胞基底膜并侵入邻近组织的迁移和侵袭能力。侵袭伪足是富含肌动蛋白、具有动态特性的基质降解突起结构，可通过释放基质降解蛋白酶来降解细胞外基质5。癌细胞侵袭包括基质降解、随后癌细胞迁移的过程，并伴随三维（3D）基质环境的重组2。因此，细胞要穿透基质，必须改变自身形态并与细胞外基质（ECM）相互作用2。
乳腺组织完整性的维持依赖于严格调控的组织结构，因为细胞-细胞外基质（ECM）连接和细胞-细胞黏附连接可影响基因表达，上皮极性的破坏可能导致癌症的发生6-10。然而，大多数 体外 迁移和侵袭实验，例如Transwell小室实验或划痕实验，均为二维（2D）实验，因此忽略了细胞与其邻近环境之间复杂的相互作用3,6,8,11-14在三维培养中，已观察到显著的形态学和功能多样性，包括细胞形态、细胞分化、细胞-基质黏附以及基因表达模式的变化，而这些特征在二维检测中通常缺失。2,6,8,11因此，三维检测方法在更真实地模拟生理环境方面具有显著优势 体内 条件，有助于将基础研究中的突破性发现更好地转化为临床应用6-10然而，需要注意的是，尽管使用三维培养具有诸多优势，但该模型无法完全模拟出 体内 包含多种细胞类型的肿瘤微环境。然而，可以将间质细胞（例如成纤维细胞、白细胞和巨噬细胞）整合到三维模型中，以研究肿瘤-间质相互作用对癌细胞黏附和侵袭的影响15-17.
培养中的乳腺上皮细胞在存在层粘连蛋白和胶原蛋白等细胞外基质蛋白时生长效果最佳。基于这一认识，一种源自Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肿瘤的商用基质混合物被开发出来，称为Matrigel基底膜基质。2,8已建立多种技术用于在基底膜基质中将上皮细胞培养为三维集落2,83D基底膜基质模型可用于有效建立良性和恶性乳腺细胞的生长环境，模拟体内发生的情况 体内 环境18,19MCF10A细胞为非恶性乳腺上皮细胞。在基底膜基质中培养时，这些细胞表现出 体内 正常乳腺细胞的特征，并通过受控的细胞增殖、细胞极化和凋亡来形成管腔结构8,12,20此外，MCF10A细胞在三维培养中形成腺泡时，其细胞核的形态比单层培养条件下更接近于乳腺组织中的上皮细胞核。21Bissell 及其同事的研究首次揭示，当恶性乳腺细胞与非恶性乳腺细胞在富含层粘连蛋白的环境中培养时，可观察到两者之间的差异：恶性细胞表现出高度紊乱的表型、增殖增加、细胞间黏附减少、间充质标志物表达上调，以及侵袭性结构形成数量增多。3,6,22.
细胞环境的异常可影响肿瘤的形成20。三维培养方法可用于有效研究肿瘤细胞与其周围环境之间的相互作用，并确定蛋白表达如何影响此类相互作用14,20,21,23。本文提供了一种详细的实验方法，用于在三维培养体系中培养MDA-MB-231乳腺癌细胞，以分析其侵袭性，并利用上皮标志物层粘连蛋白（laminin）——细胞基底膜的一种组分——研究上皮形态的丧失情况18,19,24,25。该详细操作流程可用于准确且可重复地定量任何侵袭性癌细胞形成星状（侵袭性）结构的能力，不仅限于常见的乳腺癌细胞系（如MDA-MB-231、Hs578T、MCF-7或T47D）。因此，该检测方法可作为评估细胞中蛋白表达或使用促侵袭或抗侵袭化合物处理如何调控单个或多个细胞降解细胞外基质的平台。
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方案
1. 乳腺癌细胞在基底膜基质中的三维培养（包埋技术）
- Matrigel 基底膜基质的处理：在冰上过夜解冻 4 °C. 基底膜基质在低温下呈液态，但在室温下会凝固。将基底膜基质置于冰上（图1A-B).
- 用盖玻片覆盖共聚焦显微 No.1 玻璃底培养皿 50 μl 通过使用P-200移液器枪头以螺旋方式涂布基底膜基质，实现基底膜基质的铺展图1C）。在铺展基底膜基质时需小心，避免产生气泡。同样，应避免将基质铺展至玻璃底培养皿的边缘附近，以防止弯月面形成。若对基底膜基质操作经验不足，可将培养皿、P-200 移液器及吸头预先冷却，置于冰上（或 alternatively 在冰箱中过夜冷藏 at 4 °C）。此步骤可提供额外时间，以便在基底膜基质凝固前充分铺展。将培养皿置于细胞培养箱中（于 37 °C 含5% CO₂2）至少 30 分钟，以使基底膜基质凝固（图1D).
- 在基质凝固的同时，用胰蛋白酶消化一个70-80%汇合度的100 mm细胞培养板。当细胞开始从培养板脱落时，将其重悬于10 ml含10%（v/v）胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，以灭活胰蛋白酶（图1E）。然后将重悬的细胞转移至15 ml锥形管中（图1F).
- 将细胞（置于锥形管中）在专用的细胞培养离心机中以 100 × g 离心 3 分钟图1G-H).
- 在细胞离心的同时，分装 50 μl 将基质转移至一个1 ml微量离心管中（注意：每个玻璃底培养皿对应一个微量离心管；因此，若实验需要3个培养皿，则相应需要3个微量离心管），然后将离心管置于冰上（图1B).
- 吸去步骤1.4中锥形管中的培养基，同时保持沉淀物不受扰动（图1I). 将已离心沉淀的细胞重悬于1 ml含FBS的RPMI培养基中（图1J).
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数后（图1K），或使用细胞颗粒计数器取2.5 × 104 将细胞转入微量离心管中，并加入适量培养基以达到总体积 50 μl (图1L).
- 将步骤1.7中的细胞（25,000个细胞）混匀 50 μl) 与步骤1.5中含基质的微量离心管按1:1比例混合；最终体积将为 100 μl (图1M).
- 轻柔铺板 100 μl 将步骤1.8中获得的基质：细胞混合物滴加至步骤1.2中已固化的基底膜基质包被培养皿上（图1N这使得细胞能够嵌入基底膜基质中。
- 将培养皿转移至细胞培养箱中（于 37 °C 含5% CO₂2）并让基质：细胞混合物凝固至少30分钟。
- 待基质与细胞混合物凝固后，向培养皿中加入2 ml含FBS的RPMI培养基（图1O）并将培养皿放回培养箱，在实验剩余时间内在此储存（图 1P).
- 每5天更换一次培养基（或根据实验要求进行更换；MDA-MB-231细胞的实验持续时间为5天）。
- 使用光学显微镜，对悬浮于基底膜基质中的 MDA-MB-231 克隆进行微分干涉差（DIC）成像图3A每天使用10倍物镜拍摄20个代表性区域的图像，持续五天，以确定菌落形态发生情况（图3C).
- 分析图像 盲目地 确定细胞克隆星状形成（图3B若观察到细胞球状体向外延伸出一个或多个突起，则将其判定为星状克隆。为计算侵袭性星状克隆的百分比，将每幅获取图像中星状克隆的数量除以该图像中细胞克隆的总数，随后对每天20幅图像的星状克隆百分比取平均值。
图 1. MDA-MB-231 乳腺癌细胞在基底膜基质中的三维培养（包埋法）。A-B) 实验装置示意图（在通风橱中进行）。C) 玻璃底培养皿的孔中包被 50 μl 基底膜基质。 D) 将培养皿置于细胞培养孵箱中（37 °C，含 5% CO2），使基质至少固化 30 分钟。 E) 用胰蛋白酶消化细胞。 F) 将细胞重悬于 15 ml 圆锥形离心管中。 G-H) 将含细胞的离心管在组织培养专用离心机中以 100 × g 离心 3 分钟。 I) 细胞沉淀。 J) 将已离心的细胞用 1 ml 含胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基重悬。 K) 使用血细胞计数板对细胞进行计数。 L) 取 2.5 × 104 个细胞分装至微量离心管中，并加入适量培养基，使总体积达到 50 μl。 M) 将步骤 1.7 中的细胞悬液（50 μl 中含 25,000 个细胞）与步骤 1.5 中含基质的微量离心管内容物按 1:1 比例混合；最终体积为 100 μl。 N) 轻柔地将步骤 8 得到的 100 μl 基质-细胞混合液接种至步骤 1.2 中已固化的基质包被培养皿上。 O) 待基质-细胞混合液完全固化后，向培养皿中加入 2 ml 含 FBS 的 RPMI 培养基。 P) 将培养皿放入孵箱中，继续后续实验培养。
2. 使用免疫荧光检测三维培养物的形态发生特征
- 从培养箱中取出培养皿之前，准备好冰盘、冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）、20%丙酮:80%甲醇（固定液）以及3%牛血清白蛋白（BSA；封闭液）（图2A）。
- 将培养皿置于冰盘上，吸除培养基，然后用2 ml冰冷的PBS洗涤3次（图2B）。
- 最后一次PBS洗涤后，向培养皿中加入2 ml 20%丙酮:80%甲醇溶液（图2C），在4 °C条件下固定细胞20分钟（可置于冰上或冰箱中）（图2D）。
- 固定20分钟后，将培养皿恢复至室温，吸除固定液，随后用PBS洗涤3次。最后一次PBS洗涤后，向培养皿中加入2 ml 3% BSA，于室温封闭至少30分钟（图2E）。
- 在封闭期间，将一抗（层粘连蛋白V，1:100）和二抗（按适当稀释比例）溶解于3%牛血清白蛋白（BSA）封闭缓冲液中配制稀释液。请注意，应将400–500 μl的“BSA + 一抗”溶液直接加至基质-细胞混合物上。
- 封闭30分钟后，直接加入一抗溶液，于室温孵育至少1小时（图2F）。请注意，在30分钟封闭后不应进行PBS洗涤。
- 完成步骤2.6后，移除“BSA + 一抗”溶液，并用PBS洗涤3次。
- 将二抗溶解于3% BSA中（按适当稀释比例），直接加至基质-细胞混合物上，盖上培养皿，于室温孵育1小时（图2G）。
- 移除“BSA + 二抗”溶液，并用PBS洗涤3次。
- 加入2 ml Hoechst 33258（1:10,000）PBS溶液用于细胞核染色，用铝箔包裹（或使用不透光容器覆盖以防止光漂白），孵育5分钟（图2H）。
- Hoechst 33258染色孵育5分钟后，用PBS洗涤培养皿5次。
- 将封片剂直接加至共聚焦培养皿中的基质-细胞混合物上，小心加盖盖玻片，避免破坏基底膜基质-细胞混合物中克隆的完整性（图2I）。
- 将培养皿于室温下静置过夜（或24小时）使其干燥（图2I）。干燥后可将培养皿储存于-20 °C，但强烈建议尽快进行成像。
- 使用荧光显微镜，根据所用抗体的合适激光波长采集图像（图3D-E）。
图 2. 通过免疫荧光检测三维培养物。A) 实验装置示意图。B) 将培养皿置于冰盒上，吸除培养基，随后用 2 ml 冷 PBS 洗涤细胞三次。C) 向培养皿中加入 2 ml 20% 丙酮:80% 甲醇溶液。D) 在 4 °C 下固定细胞 20 分钟（可置于冰上或冰箱中）。E) 向培养皿中加入 2 ml 3% BSA，于室温封闭至少 30 分钟。F) 封闭 30 分钟后，加入一抗并于室温孵育至少 1 小时。G) 将二抗溶于 3% BSA（按适当稀释比例）后直接加入基底膜基质:细胞混合物中，随后盖上培养皿并于室温孵育 1 小时。H) 向培养皿中加入 2 ml Hoechst（1:10,000，溶于 PBS），用铝箔包裹后孵育 5 分钟。I) 将封片剂直接滴加至共聚焦培养皿中的基质:细胞混合物上，并加盖玻璃盖玻片。培养皿于室温下避光干燥过夜（或 24 小时）。
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结果
MDA-MB-231 细胞在三维基质中侵袭的一个示例如图 3C所示。细胞被包埋于基质中（第1天），到第3天开始形成侵袭性（星状）结构，到第5天则完全侵入基质中（图 3C）。统计形成的星状克隆数量，并以每皿克隆总数（侵袭性和非侵袭性）的百分比表示。此外，由于在五天内每天进行测量，因此也可评估侵袭速率。
建立形态发生事件的时间线可为这些检测中的众多参数提供测试基础。例如，可使用抗癌药物或可能促进细胞骨架重排的药物处理乳腺癌细胞，并与未刺激细胞和溶剂对照组相比，评估这些药物对侵袭的影响24。或者，可通过基因改造使乳腺癌细胞表达潜在的癌基因，或利用RNA干扰（如shRNA）降低基因表达，进而定量分析其形成侵袭性突起的能力18,24,25。
使用三维细胞培养作为实验工具的一个主要优势在于，能够在细胞形态变化过程中检测重要信号分子的空间和时间特征。通过免疫荧光染色技术，可在三维培养体系中直观地观察这些分子的表达情况。在
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讨论
三维细胞培养技术的发展使研究人员能够研究乳腺上皮细胞的转化过程，从而可视化其显著的形态学变化。除了分析细胞侵袭外，单细胞或多细胞的乳腺上皮球状体还可用于评估细胞黏附、增殖、大小以及基底-顶端极性的变化。与先前报道的将细胞覆盖于细胞外基质（ECM8）之上的方法不同，我们的方法是将细胞嵌入ECM18,19,24中，从而实现对多向侵袭的定量分析。这些创新的三维培养模型使研究人员能够研究在传统单层培养或Transwell小室侵袭实验中无法观察到的表型变化。通过结合生物化学与药理学策略，并对细胞集落进行共聚焦免疫荧光分析，三维模型显著提升了对形态学改变进行精细、深入分析的能力。因此，该技术进一步加深了我们对影响癌症起始与进展机制的理解。
我们发现，每孔共聚焦培养皿中接种 MDA-MB-231 细胞的最适数量为 25,000 个细胞。增加细胞数量可能导致基底膜基质过度降解（称为“蓬松现象”），因此不推荐。然而，若同时调整其他参数（例如相应增加基底膜基质体积），较高细胞密度也可能适用。此外，不同批次的基底膜基质混合物浓度可能存在差异。因此，初始阶段应检...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由加拿大卫生研究院（CIHR）资助项目 MOP 107972 向 M.B. 提供资金支持。M.B. 是 CIHR 新研究者薪金奖的获得者。D.C. 获得了转化乳腺癌研究单元和加拿大卫生研究院癌症研究与技术转化战略培训项目（伦敦地区癌症计划）提供的研究生奖学金。C.G. 获得了转化乳腺癌研究单元（伦敦地区癌症计划）以及加拿大卫生研究院癌症研究与技术转化战略培训项目提供的研究生奖学金。SGD。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml 离心管 | VWR | CA10011-700 | 无菌，一次性使用 |
| 100-mm 培养皿 BD353003 | VWR | CABD353003 | 无菌，一次性使用 |
| 15 ml Falcon 管 | VWR | CA21008-918 | 无菌，一次性使用 |
| 1 ml 滤芯吸头 | VWR | 10011-350 | 无菌，一次性使用 |
| 200 μl 滤芯吸头 | VWR | 22234-016 | 无菌，一次性使用 |
| 20 μl 滤芯吸头 | VWR | 22234-008 | 无菌，一次性使用 |
| 35-mm 玻璃底共聚焦 No.1 培养皿 | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | 使用前预冷 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | BioShop | ALB003.100 | 免疫荧光实验中使用浓度为 3% |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体，高度交叉吸附 | Life Technologies | A11029 | 免疫荧光实验中稀释比例为 1:250 |
| Alexa Fluor 568 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体 | Life Technologies | A11011 | 免疫荧光实验中稀释比例为 1:1,200 |
| 抗 β-连环蛋白抗体 | BD Transduction Laboratories | 610153 | 小鼠单克隆抗体；免疫荧光实验中使用稀释比例为 1:100 |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | F1051 | 使用浓度为 10%（v/v） |
| Hoechst 33258 五水合物（bis-Benzimide）— 10 mg⁄ml 水溶液 | Life Technologies | H3569 | 使用浓度为 0.1%（1:10,000 稀释） |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | 用于三维培养成像（10X 和 40X 下的微分干涉相差图像） | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | 使用浓度为 100 nM |
| 抗层粘连蛋白抗体 | Cedarlane | AB19012(CH) | 兔多克隆全长人源抗体；免疫荧光实验中使用稀释比例为 1:100 |
| LSM-510 META 激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | 使用 63X 物镜；油浸镜头 | |
| 无酚红 Matrigel (BD356237) | VWR | CACB356237 | 批号 2180819；浓度 10.4 mg/ml |
| Olympus IX-81 显微镜 | Olympus | 用于三维培养成像（10X 和 40X 下的微分干涉相差图像） | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | Life Technologies | 15140-122 | 抗生素（加入培养基中；使用浓度为 0.01%） |
| 10 ml 移液管 | VWR | CA53300-523 | 无菌，一次性使用 |
| 含谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基 | Life Technologies | 11875-119 | 用于 MDA-MB-231 细胞的培养 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x)，含酚红 | Life Technologies | 25200-072 | 用于消化 MDA-MB-231 细胞 |
| MEGM（子弹头试剂盒）：MEBM (CC3151) + SingleQuots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | 用于 MCF10A 细胞的培养 |
参考文献
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