本文详细介绍了利用三维（3D）实验方法定量分析乳腺癌细胞侵袭的技术。具体而言，我们讨论了建立此类实验所需的步骤、定量方法与数据分析，以及检测细胞侵袭过程中细胞膜完整性丧失的相关方法。
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本文内容
摘要
摘要
如今已广为人知，细胞和组织的微环境是影响肿瘤发生与进展的关键调控因素。此外，细胞外基质（ECM）已被证实是在培养条件下及体内稳态中调控细胞行为的关键因子。 体内目前在二维（2D）塑料表面培养细胞的方法会导致细胞与其微环境之间复杂相互作用的紊乱和丧失。通过采用三维（3D）培养检测方法，可建立类似于体内条件的细胞-微环境相互作用环境。 体内 微环境。本文提供了一种在三维基底膜蛋白基质中培养乳腺癌细胞的详细方法，展示了三维培养在评估细胞向周围环境侵袭方面的潜力。此外，我们还讨论了如何通过免疫染色技术利用这些三维实验体系来检测调控上皮形态的信号分子的丢失情况。这些研究有助于揭示调控乳腺癌扩散过程中侵袭机制的重要细节。
引言
单个或集体细胞的迁移与侵袭是癌症的两个重要特征，也是癌细胞发生转移扩散所必需的过程1-4。癌细胞启动转移的能力取决于其利用侵袭伪足降解细胞基底膜并侵入邻近组织的迁移和侵袭能力。侵袭伪足是富含肌动蛋白、具有动态特性的基质降解突起结构，可通过释放基质降解蛋白酶来降解细胞外基质5。癌细胞侵袭包括基质降解、随后癌细胞迁移的过程，并伴随三维（3D）基质环境的重组2。因此，细胞要穿透基质，必须改变自身形态并与细胞外基质（ECM）相互作用2。
乳腺组织完整性的维持依赖于严格调控的组织结构，因为细胞-细胞外基质（ECM）连接和细胞-细胞黏附连接可影响基因表达，上皮极性的破坏可能导致癌症的发生6-10。然而，大多数 体外 迁移和侵袭实验，例如Transwell小室实验或划痕实验，均为二维（2D）实验，因此忽略了细胞与其邻近环境之间复杂的相互作用3,6,8,11-14在三维培养中，已观察到显著的形态学和功能多样性，包括细胞形态、细胞分化、细胞-基质黏附以及基因表达模式的变化，而这些特征在二维检测中通常缺失。2,6,8,11因此，三维检测方法在更真实地模拟生理环境方面具有显著优势 体内 条件，有助于将基础研究中的突破性发现更好地转化为临床应用6-10然而，需要注意的是，尽管使用三维培养具有....
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方案
1. 乳腺癌细胞在基底膜基质中的三维培养（包埋技术）
- Matrigel 基底膜基质的处理：在冰上过夜解冻 4 °C. 基底膜基质在低温下呈液态，但在室温下会凝固。将基底膜基质置于冰上（图1A-B).
- 用盖玻片覆盖共聚焦显微 No.1 玻璃底培养皿 50 μl 通过使用P-200移液器枪头以螺旋方式涂布基底膜基质，实现基底膜基质的铺展图1C）。在铺展基底膜基质时需小心，避免产生气泡。同样，应避免将基质铺展至玻璃底培养皿的边缘附近，以防止弯月面形成。若对基底膜基质操作经验不足，可将培养皿、P-200 移液器及吸头预先冷却，置于冰上（或 alternatively 在冰箱中过夜冷藏 at 4 °C）。此步骤可提供额外时间，以便在基底膜基质凝固前充分铺展。将培养皿置于细胞培养箱中（于 37 °C 含5% CO₂2）至少 30 分钟，以使基底膜基质凝固（图1D).
- 在基质凝固的同时，用胰蛋白酶消化一个70-80%汇合度的100 mm细胞培养板。当细胞开始从培养板脱落时，将其重悬于10 ml含10%（v/v）胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基中，以灭活胰蛋白酶（图1E）。然后将重悬的细胞转移至15 ml锥形管中（图1F).
- 将细胞（置于锥形管中）在专用的细胞培养....
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结果
MDA-MB-231 细胞在三维基质中侵袭的一个示例如图 3C所示。细胞被包埋于基质中（第1天），到第3天开始形成侵袭性（星状）结构，到第5天则完全侵入基质中（图 3C）。统计形成的星状克隆数量，并以每皿克隆总数（侵袭性和非侵袭性）的百分比表示。此外，由于在五天内每天进行测量，因此也可评估侵袭速率。
建立形态发生事件的时间线可为这些检测中的众多参数提供测试基础。例如，可使用抗癌药物或可能促进细胞骨架重排的药物处理乳腺癌细胞，并与未刺激细胞和溶剂对照组相比，评估这些药物对侵袭的影响24。或者，可通过基因改造使乳腺癌细胞表达潜在的癌基因，或利用RNA干扰（如shRNA）降低基因表达，进而定量分析其形成侵袭性突起的能力18,24,25。
使用三维细胞培养作为实验工具的一个主要优势在于，能够在细胞形态变化过程中检测重要信号分子的空间和时间特征。通过免疫荧光染色技术，可在三维培养体系中直观地观察这些分子的表达情况。在
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讨论
三维细胞培养技术的发展使研究人员能够研究乳腺上皮细胞的转化过程，从而可视化其显著的形态学变化。除了分析细胞侵袭外，单细胞或多细胞的乳腺上皮球状体还可用于评估细胞黏附、增殖、大小以及基底-顶端极性的变化。与先前报道的将细胞覆盖于细胞外基质（ECM8）之上的方法不同，我们的方法是将细胞嵌入ECM18,19,24中，从而实现对多向侵袭的定量分析。这些创新的三维培养模型使研究人员能够研究在传统单层培养或Transwell小室侵袭实验中无法观察到的表型变化。通过结合生物化学与药理学策略，并对细胞集落进行共聚焦免疫荧光分析，三维模型显著提升了对形态学改变进行精细、深入分析的能力。因此，该技术进一步加深了我们对影响癌症起始与进展机制的理解。
我们发现，每孔共聚焦培养皿中接种 MDA-MB-231 细胞的最适数量为 25,000 个细胞。增加细胞数量可能导致基底膜基质过度降解（称为“蓬松现象”），因此不推荐。然而，若同时调整其他参数（例如相应增加基底膜基质体积），较高细胞密度也可能适用。此外，不同批次的基底膜基质混合物浓度可能存在差异。因此，初始阶段应检.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由加拿大卫生研究院（CIHR）资助项目 MOP 107972 向 M.B. 提供资金支持。M.B. 是 CIHR 新研究者薪金奖的获得者。D.C. 获得了转化乳腺癌研究单元和加拿大卫生研究院癌症研究与技术转化战略培训项目（伦敦地区癌症计划）提供的研究生奖学金。C.G. 获得了转化乳腺癌研究单元（伦敦地区癌症计划）以及加拿大卫生研究院癌症研究与技术转化战略培训项目提供的研究生奖学金。SGD。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 ml 离心管 | VWR | CA10011-700 | 无菌，一次性使用 |
| 100-mm 培养皿 BD353003 | VWR | CABD353003 | 无菌，一次性使用 |
| 15 ml Falcon 管 | VWR | CA21008-918 | 无菌，一次性使用 |
| 1 ml 滤芯吸头 | VWR | 10011-350 | 无菌，一次性使用 |
| 200 μl 滤芯吸头 | VWR | 22234-016 | 无菌，一次性使用 |
| 20 μl 滤芯吸头 | VWR | 22234-008 | 无菌，一次性使用 |
| 35-mm 玻璃底共聚焦 No.1 培养皿 | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | 使用前预冷 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | BioShop | ALB003.100 | 免疫荧光实验中使用浓度为 3% |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG (H+L) 抗体，高度交叉吸附 | Life Technologies | A11029 | 免疫荧光实验中稀释比例为 1:250 |
| Alexa Fluor 568 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体 | Life Technologies | A11011 | 免疫荧光实验中稀释比例为 1:1,200 |
| 抗 β-连环蛋白抗体 | BD Transduction Laboratories | 610153 | 小鼠单克隆抗体；免疫荧光实验中使用稀释比例为 1:100 |
| 胎牛血清（FBS） | Sigma | F1051 | 使用浓度为 10%（v/v） |
| Hoechst 33258 五水合物（bis-Benzimide）— 10 mg⁄ml 水溶液 | Life Technologies | H3569 | 使用浓度为 0.1%（1:10,000 稀释） |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | 用于三维培养成像（10X 和 40X 下的微分干涉相差图像） | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | 使用浓度为 100 nM |
| 抗层粘连蛋白抗体 | Cedarlane | AB19012(CH) | 兔多克隆全长人源抗体；免疫荧光实验中使用稀释比例为 1:100 |
| LSM-510 META 激光扫描共聚焦显微镜 | Zeiss | 使用 63X 物镜；油浸镜头 | |
| 无酚红 Matrigel (BD356237) | VWR | CACB356237 | 批号 2180819；浓度 10.4 mg/ml |
| Olympus IX-81 显微镜 | Olympus | 用于三维培养成像（10X 和 40X 下的微分干涉相差图像） | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/ml） | Life Technologies | 15140-122 | 抗生素（加入培养基中；使用浓度为 0.01%） |
| 10 ml 移液管 | VWR | CA53300-523 | 无菌，一次性使用 |
| 含谷氨酰胺的 RPMI 1640 培养基 | Life Technologies | 11875-119 | 用于 MDA-MB-231 细胞的培养 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA (1x)，含酚红 | Life Technologies | 25200-072 | 用于消化 MDA-MB-231 细胞 |
| MEGM（子弹头试剂盒）：MEBM (CC3151) + SingleQuots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | 用于 MCF10A 细胞的培养 |
参考文献
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., ....
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重印与许可
