本方案描述了光片显微镜的搭建及其应用方法 体内 成像 秀丽隐杆线虫 胚胎
方法文章
搭建简易光片显微镜用于 整体 成像 秀丽隐杆线虫 发育
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
快速且光毒性低的成像技术是实现生物体全貌发育研究的前提。in toto 光片显微镜相比共聚焦显微镜可显著减少光漂白和光毒性效应，同时提供具有亚细胞分辨率的三维图像。本文介绍了光片显微镜的搭建过程，该系统由一台正置显微镜和一组用于生成光片的小型光电机械元件组成。本方案详细描述了显微镜的构建、光路准直以及光片特性的表征方法。此外，还详述了如何利用简单的观察室对 C. elegans 胚胎进行 in toto 成像。该方法可实现数小时内发育过程的三维双色延时成像，有助于长期追踪细胞形态变化、细胞分裂及标记蛋白的动态过程。
引言
生物体的形成与形态构建涉及细胞运动、细胞形态变化、细胞分裂和细胞分化。要理解这些过程的进展及其协调机制，需要具备三维成像能力与亚细胞分辨率的快速成像工具。在具备这些特性的技术中 体内 成像能力方面，光片照明显微镜，又称单平面/选择性平面照明显微镜，具有产生低光毒性和低光漂白效应的独特优势1,2.
在片状照明显微镜中，样品由来自侧面的光片进行照明，从而实现光学切片。照明光路与检测光路相互垂直，光片被调整至与检测物镜的物体焦平面重合。样品置于两条光路的交汇处，并可沿检测轴方向移动，以实现三维成像。只有目标平面被照明，且该平面上的所有点同时被检测。与共聚焦显微镜相比，这种方法显著提高了成像速度，并减少了光漂白和光毒性3。
从实际操作来看，片状照明显微镜易于搭建和校准：进行二维成像时，检测部分和照明部分均无需扫描；作为一种具备光学切片能力的宽场成像技术，通过移动承载样品的载物台沿单一轴向移动，即可实现三维成像。
本文介绍了简易光片显微镜的搭建及其应用 整体上 成像 C. elegans 胚胎 秀丽隐杆线虫 胚胎非常适合活体观察 体内 由于其透明性、不变的细胞谱系和固定模式的细胞位置，适用于成像研究4,5所开发的光片显微装置基于一台标准的正置显微镜用于信号检测。以下方案详细说明了如何搭建和调试激发模块/光路、测试与表征光片以及装载样品以进行三维成像。同时提供了利用该装置对多种表达荧光标记物的菌株进行延时成像所获得的视频示例。
方案
1. 设置光片与检测光路
图1展示了光学装置的总体示意图。
- 将显微镜和激光器放置并固定在光学平台上。
- 结合 488 nm、561 nm 和 405 nm 激光器及其对应的二向色镜。在通过二向色镜后，各激光束必须精确共线对准。需要注意的是，激光波长、二向色镜和光学滤光片的选择应根据实验中所用特定荧光标记物的吸收光谱来确定。
- 放置声光可调滤光器（AOTF）。使用供应商提供的测试表调整AOTF的频率和功率。当对准良好时，通过功率计测量，在最大调谐状态下约有90%的激光功率被透射。 请注意，某些激光器可通过软件完全控制，这可能使声光可调滤光器（AOTF）变得不必要。
- 放置并固定望远镜。请注意，该望远镜由两片透镜组成，用于将光束扩展至等于或大于照明物镜后孔径直径的宽度。焦距较短的透镜应置于前方。
- 放置、对准并固定潜望镜，使光路向上偏转，更靠近柱面透镜的后光阑。注意，潜望镜的两面反射镜安装时应使其长轴方向与镜面倾斜方向一致，以便反射完全扩束后的光束。
- 将柱面透镜放置在潜望镜出口旁边。注意，柱面透镜在一个方向上聚焦光束，而在另一个方向上保持光束准直，从而形成一片光片。
- 使用照明物镜重新聚焦生成的光片。注意照明物镜的像方焦点应与检测物镜的物方焦点重合。将光束投射到远处的屏幕（例如墙面）上。沿照明光束轴线移动照明物镜，使屏幕上呈现清晰的光片轮廓。
- 将四线（405/488/561/638）发射滤光片放入显微镜（镜座）中预留的位置。
- 将EMCCD相机放置在显微镜的输出端口。
- 用螺丝将第一级手动平移台固定在显微镜载物台的螺孔中。注意平移台边缘应位于显微镜载物台中心约2 cm处，以确保比色皿位于检测物镜的正下方中心位置。
- 将第二个人工翻译阶段固定在第一个上，两个阶段的运动方向必须相互垂直（X轴和Y轴平移）。
- 将Z轴压电位移台固定在前两个位移台的顶部。注意，也可使用电动位移台替代压电位移台。
- 固定比色皿架（参见 图2) 位于各阶段的顶部。比色皿将被放置在照明光路与检测光路的交汇处，这两条光路相互垂直。
2. 检查光片
- 将荧光溶液注入玻璃比色皿中，并将其放置在两条光路交叉处的样品支架上。此时可观察到光片。光片必须呈水平状态，并相对于检测物镜对称/居中。
- 移除柱面透镜并采集图像，以测量光片的厚度。注意，光片的厚度取决于照明物镜的数值孔径（NA）（当 NA = 0.3 时，约为 3–4 µm）。注意，对于特定透镜，可通过狭缝减小进入后焦面的光束尺寸来增加光片厚度。注意，可使用荧光微球来测量显微镜的轴向和横向分辨率。
- 在开始实验前，将柱面透镜重新安装到位。
3. C. elegans 胚胎的制片
以下步骤如图3所示。
- 使用钻石刻线笔切割一块尺寸为 10 x 20 x 1 mm 的载玻片。
- 制备 5% 的细菌琼脂水溶液，煮沸后置于加热块中保持在 60 °C。
- 在切下的载玻片一侧加入 50 µl 多聚-L-赖氨酸，使其自然干燥。
- 将一张显微镜载玻片放置在实验台上并固定。
- 将切下的载玻片紧贴固定载玻片放置，在其上方加入一滴熔化的琼脂，再用另一张干净的显微镜载玻片轻轻挤压，形成一层薄的琼脂垫。
- 待琼脂垫干燥后，再移去上层的载玻片。
- 在固定载玻片一侧将琼脂垫进行切割，使琼脂边缘保留约 3 mm 的多余部分，然后轻柔地移除固定载玻片。
- 在琼脂表面加入 50 µL 多聚-L-赖氨酸，使其完全干燥。
- 将处于产卵期的线虫放入表面皿中的 M9 培养基内。
- 用解剖刀在阴门位置切割线虫，以释放胚胎。
- 在双目显微镜下识别处于目标发育阶段的胚胎，并使用微毛细移液管收集。
- 将胚胎放置在切下载玻片上突出部分的、涂有多聚-L-赖氨酸的琼脂区域，紧邻载玻片边缘放置。切勿将胚胎置于琼脂边缘，否则其稳定性不足。轻柔移去液体，使胚胎牢固黏附于多聚-L-赖氨酸层上。
- 迅速排列 胚胎，以防干燥。
- 将切下的载玻片放入塑料培养皿中，并轻柔加入 M9 培养基，使其覆盖载玻片。
- 在双目显微镜下检查，确认卵仍牢固黏附在琼脂上。
4. C. elegans 发育过程的记录
- 将先前制备的样品（切片、含胚胎的琼脂）固定在样品 holder 中，并放入比色皿内。图4 描述了自制的样品 holder，图5 展示了比色皿在观察状态下的视图。
- 将比色皿固定在压电载物台上。
- 使用明场照明确定胚胎的位置。
- 启动自制软件以控制声光可调滤波器（AOTF）、相机和压电载物台。请注意，也可使用免费软件（如 MicroManager）。
- 选择激光谱线和功率（AOTF）。
- 通过调节支撑柱面透镜和照明透镜的三向调节台，调整光片的位置。沿横向（X方向）移动调节台以获得最亮的信号；随后调整光片的Z方向位置以及纵向位置（Y方向），以获得最佳信噪比。注意，由于不同胚胎间光程长度可能存在差异，可能需要逐个调整光片焦点的位置。
- 进行延时成像时，需设置曝光时间、增益、每两幅图像之间的时间间隔、采集图像的总数以及激光功率。对于双色成像，需选择第二条激光谱线，双色图像将依次连续采集。
- 若需采集Z轴层扫图像，还需设定相邻切片之间的距离，以及压电载物台的起始和终止位置。
结果
来自三种不同 C. elegans 品系的三次三维延时成像实验展示了利用上述光片显微镜装置可获得的数据类型。我们验证了在这些条件下，胚胎能够以正常速度发育并存活于成像过程中，这与早期报道一致，即SPIM成像在 C. elegans 胚胎中仅引起较低水平的光毒性6,7。
第一种品系表达一种与GFP融合的组蛋白（zuIs178；stIs10024）。记录持续2小时，每隔37秒采集一次包含20层切片的图像（切片间距为1 μm）。图6展示了该图像堆栈在不同时间点的单个层面。间期细胞核（箭头）和凝缩的有丝分裂染色质（箭头末端）均清晰可见。
第二种菌株表达与GFP融合的微管蛋白（ruIs57）以及与mCherry融合的组蛋白（itIs37; stIs10226）。记录持续16分钟，每隔105秒采集一组包含20个切片的图像（切片间距为1 μm）。图7展示了该图像组中不同层面及不同时间点的图像。相关视频1显示了连续三个时间点的三维重建结果。在细胞分裂过程中，有丝分裂纺锤体（绿色）和凝缩的染色体（红色）清晰可见，从而可以追踪发育过程中细胞分裂的方向。
第三种品系表达载脂蛋白VIT-2与GFP的融合蛋白（pwIs23）以及膜结合型mCherry（ltIs44）。记录持续25分钟，每30秒采集一次共10层切片的图像（切片间距为1 μm）。图8展示了该图像序列中不同层面及不同时间点的图像。细胞内卵黄脂蛋白颗粒（绿色）的快速运动可被清晰追踪。
图1： SPIM光学装置，由照明单元和检测单元组成，显示前视图和底视图。在照明单元中，由二向色镜合并的激光进入AOTF，后者可独立控制每束激光的功率。随后，望远镜将光束直径扩大4倍，再通过潜望镜将光束引导至显微镜的高度。柱面透镜形成光片，再由照明物镜重新聚焦。检测单元集成在直立显微镜中，主要由检测物镜、滤光片、管镜和EMCCD相机组成。样品置于照明光路与检测光路的交汇处。压电载物台可实现样品在垂直方向（Z轴）的移动，以进行三维图像采集。
图 2： 比色皿支架。 该支架由 3 块铝板组成，并用螺丝固定在压电台上。玻璃比色皿由一个弹簧（红色部分）夹持固定。
图 3：秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎用于SPIM实验的封片流程。将一片切割好的玻璃用多聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine）包被，在包被表面上放置一块琼脂垫，再将多聚-L-赖氨酸滴加至琼脂垫上。最后，将秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎整齐排列于经多聚-L-赖氨酸包被的琼脂垫上。
图4： 样品支架。该支架与玻璃比色皿的内径相匹配。两个弹簧（红色部分）固定载玻片（见图3）。然后将此支架放入玻璃比色皿中。
图 5： 观察环境中的样品 holder。 胚胎根据 图 3 中总结的方案固定在玻璃载玻片上。载玻片由 图 4 中描述的样品 holder 夹持。该样品 holder 被插入由 图 2 中描述的 holder 夹持的玻璃比色皿中。光片呈水平方向，从侧面照射胚胎。检测物镜垂直位于样品上方。
图6： 表达组蛋白::GFP融合蛋白的C. elegans胚胎的延时记录。 转基因胚胎表达组蛋白::GFP融合蛋白（zuIs178; stIs10024）在不同时间点的单平面图像。 图像来源于三维延时成像：每组图像由20层切片构成（层间距离1 µm）；每层曝光时间：30 msec；图像组间时间间隔：37 sec；总采集时间：2 hr。箭头：间期细胞核；箭头尖端：凝缩的有丝分裂染色质。在 t = 0 min 时，胚胎处于2细胞阶段；在 t = 120 min 时，胚胎约含有70个细胞，符合正常发育速度（注意：图片中仅显示单一层面上的细胞，并非胚胎全部细胞）。照明光源功率为30 µW（在488 nm波长下，测量位置为照明物镜出口处）。 请点击此处观看该视频。
图7：表达 Tubulin::GFP 融合蛋白和 Histone::mCherry 融合蛋白的 C. elegans 胚胎的记录图像。 图像来源于一个表达 Tubulin::GFP 融合蛋白（ruIs57）和 Histone::mCherry 融合蛋白（itIs37 ; stIs10226）的 C. elegans 胚胎的三维延时成像序列。记录条件：每105秒采集一次共20层图像（层间距离为1 µm），总采集时间16分钟，每个通道的曝光时间为200毫秒。图a展示了同一图像堆栈中的10层切片。图b展示了同一层切片每隔210秒的图像。照明光源功率分别为：488 nm 激光30 µW，561 nm 激光300 µW（测量位置为照明物镜出口处）。请点击此处观看该视频。
图8： 表达 VIT-2::GFP 融合蛋白和膜靶向 mCherry 的 C. elegans 胚胎的成像记录。 图像来源于表达 VIT-2::GFP 融合蛋白（pwIs23）和膜靶向 mCherry（ltIs44）的 C. elegans 胚胎的三维时间序列成像。记录条件：每 30 秒采集一次共 10 层图像（层间距离为 1 µm）；总采集时间：25 分钟；每个通道的曝光时间：200 毫秒。图a展示了同一图像堆栈的前 5 层切片。图b展示了每 30 秒同一层切片的图像。请点击此处观看该视频。
讨论
本方案描述了一种简易的光片显微镜搭建方法 在 体内 成像 秀丽隐杆线虫 胚胎。用于生成和校准光片的光学元件，包括激光器、扩束镜、准直透镜和聚焦透镜，可方便地安装在光学平台上。结合用于检测光路的正置显微镜和相机，即可构建一套简便的光片显微镜系统。
这种几何结构使得样品环境十分简单。将活体样本置于玻璃比色皿中，由少量机械部件进行固定、定位和移动。由于片层照明显微镜是一种具备光学切片能力的宽场成像技术，因此三维成像仅需单轴的电动移动。这将同步需求限制在单一扫描元件上，从而简化了软件开发。与iSPIM6相比，我们采用的直立式几何结构允许使用高数值孔径（NA）的物镜进行检测。与物镜位于水平面的SPIM装置相比，该设计更便于样品安装以及对一系列胚胎进行成像。总体而言，该技术的实现较为直接，即使缺乏光学专业知识也能完成搭建。该方法是一种比共聚焦显微镜更经济的替代方案，具有成像速度更快、光毒性更低的优点，但轴向分辨率较低是其不足之处。
我们还开发了一种简便且可重复的装片方法 秀丽隐杆线虫 胚胎用于 体内 使用该系统进行成像。样品固定过程快速（15 分钟），适用于日常实验。对于 秀丽隐杆线虫 成像，这种简易装置的优势至少有两点：（i） 整体上 无需旋转即可成像，因此三维重建直接简便；（ii）样品固定容易，且可在同一载玻片上依次对多个胚胎进行成像。我们展示了具有足够时间分辨率的时间序列成像视频实例，可用于观察细胞分裂和细胞形态变化。光片显微镜在研究中的强大能力 秀丽隐杆线虫 发展也已被其他研究者近期阐明6, 7, 8因此，该技术将对研究形态发生及模式形成具有重要意义 C. elegans 胚胎
该系统是否也可用于分析其他模式生物的发育过程？需要认识到，对于小型透明生物（如 C. elegans）而言，实现片层照明显微成像的要求比对较大生物（如 Drosophila 胚胎）更为宽松。in toto 成像 Drosophila 通常需要旋转样本并进行多视角重构9, 10。使用共线激发物镜从两侧激发，也可减少因光衰减引起的阴影效应11。然而，本文所展示的装置仍适用于以低漂白和低光毒性成像 Drosophila 胚胎的单侧结构。该装置也可用于成像其他小型透明胚胎，例如海鞘或斑马鱼胚胎。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢Lenne实验室和Bertrand实验室的所有成员，特别感谢Olivier Blanc在软件开发方面的贡献以及Jérémie Capoulade的讨论建议。同时感谢PICsL-IBDM影像平台，特别是Claude Moretti和Brice Detailleur提供的技术支持。
本工作由法国国家科学研究中心（CNRS）的ATIP资助项目（资助P.-F. L.和V.B.）、Labex INFORM资助项目（资助P.-F. L.和V.B.）以及赛诺菲-安万特公司资助项目（资助V.B.）提供支持。我们感谢由法国国家研究局（ANR-10-INSB-04-01，"投资未来"计划）资助的France-BioImaging研究基础设施。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SPIM | |||
| 检测 | |||
| 正置显微镜 | ZEISS | Axiophot 1 | |
| 100x W 物镜（NA 1.1，工作距离 2.5mm） | NIKON | ||
| 背照式EMCCD | ANDOR | DU-885K-CS0-#VP | |
| 照明 | |||
| 488 nm / 60 mW 激光器 | TOPTICA | iBeam smart | |
| 405 nm / 120 mW 激光器 | TOPTICA | iBeam smart | |
| 561 nm / 500 mW 激光器 | COBOLT | JIVE 500 | 用于延时成像，50 或 100 mW 已足够 |
| 四线激光抑制带滤光片 ZET 405/488/561/638 | AHF | F57-405 | |
| 405 二向色镜 | AHF | F38-405 | |
| 488 二向色镜 | SEMROCK | Di01-R488 | |
| 声光可调滤波器（AOTF） | AA | AOTFnC-400.650-TN | |
| 反射镜 | |||
| 50 mm 透镜 | THORLABS | 5倍望远镜 | |
| 200 mm 透镜 | THORLABS | 5倍望远镜 | |
| 潜望镜 | THORLABS | RS99/M | |
| 柱面透镜 f=100mm | THORLABS | ACY254-100-A | |
| 10X NA 0.3 | NIKON | ||
| xyz 载物台 | NEWPORT | ||
| 样品 | |||
| Bacto 琼脂 | Becton Dickinson | 214010 | 水中配制成 5% |
| 聚-L-赖氨酸溶液 | Sigma | P8920 | |
| 毛细管 GC100F-10，外径 1.0 mm，内径 0.58 mm，长度 100 mm | Havard Apparatus | 30-0019 | |
| 吸管（口吸移液管） | Dutscher | 55005 | |
| M9 培养基： | |||
| KH₂PO₄（3 g/L） | 任意供应商 | ||
| Na₂HPO₄（6 g/L） | 任意供应商 | ||
| NaCl（5 g/L） | 任意供应商 | ||
| MgSO₄（终浓度 1 mM） | 任意供应商 | ||
| 比色皿支架 | 自制 | 由 Brice Detailleur 制作 | |
| 样品支架 | 自制 | 由 Claude Moretti 制作 | |
| x 向载物台 | NEWPORT | ||
| 盖玻片 50×20×1 mm | MARIENFELD | 裁剪为 10×20×1 mm | |
| 带放大器/控制器的压电载物台 | PI | P-622.ZCD / E-625.CR | |
| 比色皿 40 mm × 40 mm × 10 mm | HELLMA | 704.002-OG.40 mm- 10mm high | |
| 金刚石点玻璃标记笔 | VWR | ||
| 软件 | |||
| 基于 C++ (Qt) 的自研软件 | 由 Olivier Blanc 和 Claire Chardès 开发，可根据请求获取。替代方案：Micro-Manager 或 LabVIEW |
参考文献
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