在此，我们介绍一种使用微型装置的实验方案himar1 mariner转座子介导的诱变用于构建高密度插入突变体文库，以筛选、分离和鉴定模式菌株中新的海藻酸盐调控因子 铜绿假单胞菌 菌株PAO1
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摘要
摘要
铜绿假单胞菌 是一种革兰氏阴性环境细菌，具有多样的代谢能力。 P. aeruginosa 是一种机会性细菌病原体，可在囊性纤维化（CF）患者中引起慢性肺部感染。该菌过度产生一种称为藻酸盐的荚膜多糖，这一表型也被称为黏液状表型（mucoidy），可促进形成黏液状生物膜，这类生物膜对抗生素化疗和宿主防御机制的抵抗力强于浮游状态的细菌细胞。此外，由非黏液状向黏液状表型的转化是CF患者进入慢性感染阶段的临床标志。藻酸盐的过度产生由 P. aeruginosa 是一个吸能过程，会大量消耗细胞能量。因此，海藻酸盐的合成在细胞内受到严格调控 P. aeruginosa为了更好地理解海藻酸盐的调控机制，我们描述了一种使用微型装置的实验方案himar1 转座子诱变法用于鉴定原型菌株PAO1中新的海藻酸盐调控因子。该实验流程包括两个基本步骤。首先，我们转移了mini-himar1 转座子（pFAC）从宿主 E. coli SM10/λpir 转入受体菌 P. aeruginosa PAO1 通过 双亲接合以构建高密度插入突变体文库，并在后续进行筛选 假单胞菌 添加庆大霉素的分离琼脂平板。其次，我们筛选并分离黏液型菌落，利用指向庆大霉素抗性盒外侧的DNA引物进行反向PCR，并结合DNA测序以定位插入位点。通过该方案，我们已鉴定出两个新的海藻酸盐调控因子， mucE (PA4033) 和 kinB (PA5484)，在野生型菌株PAO1中 mucA 编码抗σ因子MucA，该因子作用于藻酸盐合成主要调控因子AlgU（AlgT，σ22该高通量诱变方案可经修改用于鉴定其他与毒力相关且导致菌落形态改变的基因。
引言
机会性革兰氏阴性病原体的能力 铜绿假单胞菌 过度产生藻酸盐是其形成生物膜能力的关键因素。藻酸盐的过度产生是一种常被称为黏液型的表型。从囊性纤维化（CF）患者痰液中分离出黏液型菌落，提示存在慢性感染，并与患者整体健康状况恶化直接相关。1目前认为，藻酸盐的调控与合成机制涉及 P. aeruginosa 主要发生在两个操纵子上。第一个是海藻酸生物合成操纵子，包含12个基因（algD-alg8-alg44-algK-algE-algG-algX-algL-algI-algJ-algF-algA负责将藻酸盐聚合物在周质空间合成并转运至胞外环境的蛋白2-5第二个操纵子是以替代σ因子开头的一组基因簇 algU/T 并继续进行 mucA, mucB，以及 mucDAlgU/T 是一种正向调控因子，而 mucAB-D 被归类为藻酸盐生成的负调控因子6-8此外，转录调控因子（如 AlgB、AlgQ、AlgR 和 RpoN）以及通过分解代谢物阻遏控制、激酶活性（KinB）和膜内蛋白水解所介导的转录后和翻译后修饰也被证实参与了藻酸盐的调控。9-14.
一种名为 pFAC 的 mini-himar1 转座子载体最初由哈佛医学院 Mekalanos 博士的实验室构建15。pFAC 质粒包含一个可移动元件，该元件两侧为两个27 bp的反向重复序列，中间携带一个庆大霉素抗性盒（aacC1：534 bp）、一个编码高活性mariner转座酶的基因16，以及一个编码β-内酰胺酶（bla）的基因（图1）。pFAC 可移动元件的序列信息可在 GenBank 登录号 DQ36630013 中获取。在 pFAC 中，aacC1 基因后方设有一个多克隆位点（MCS），可用于通过反向PCR鉴定染色体插入位点。使用 mini-himar1 转座子的一个主要优势是转座（诱变）过程不需要特定的宿主因子。此外，在P. aeruginosa基因组中广泛存在TA二核苷酸插入位点。例如，在PAO1（6,264,404 bp，GenBank登录号NC_002516.2）和PA14（6,537,648 bp；GenBank登录号NC_008463）基因组中，TA二核苷酸插入位点分别出现94,404次和100,229次。由于基因组中TA二核苷酸高度富集，mini-himar1转座子能够实现高密度且随机的诱变，特别适用于毒力基因及高度调控基因的分析。理论上，mini-himar1转座子可插入P. aeruginosa基因组中任意非必需基因内，在PAO1基因组中每个开放阅读框平均约有18个TA插入位点。
此处，我们介绍一种使用微型装置的实验方案himar1 转座子介导的诱变用于鉴定黏液型调控新因子 P. aeruginosa更具体而言，我们通过双亲接合将含有迷你-的 pFAC 载体himar1 转座子来自 E. coli SM10/λpir 转入非黏液型原养型菌株 PAO1。转座子整合至基因组后，将受体菌株在 假单胞菌 含三氯生的分离琼脂（PIA），可抑制细菌生长 E. coli因此，一个突变体文库 P. aeruginosa 可在添加了庆大霉素的PIA平板上通过生长情况及黏液表型的存在进行筛选。注意，真正的转座子介导的 与 一种整合突变体会表现出对庆大霉素耐药且对羧苄西林敏感的表型。在本研究中，通过四次独立的接合转移实验，共分离得到约80,000株PAO1插入突变体。随后，我们筛选出黏液型菌落，并通过限制性内切酶消化、连接和反向PCR确定插入位点。我们以庆大霉素抗性盒作为探针进行Southern印迹分析，以检测每个基因组中的插入拷贝数。结果表明，采用该方案每次接合获得的突变体中，超过90%的菌株基因组中仅含有单个插入拷贝。 himar1 基因组中，并表现出对庆大霉素耐药、羧苄西林敏感的表型。共鉴定出32株黏液型分离株，其中22株被定位至不同的基因位点 P. aeruginosa PAO1 染色体。该插入率足以提供充分的覆盖度，以鉴定出多个新的海藻酸盐过量产生的调控因子。
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方案
1. 细菌菌株的制备与双亲接合
- 将含有15 µg/ml庆大霉素的5 ml LB（Luria Broth）培养基接种E. coli SM10/λpir/pFAC，并于37 °C摇床培养过夜。
- 将P. aeruginosa菌株PAO1接种于5 ml LB培养基中，于42 °C摇床培养过夜。
- 测定过夜培养物的OD600值，并等量混合PAO1与E. coli pFAC，使终体积为1–1.4 ml。
- 在6,000 × g条件下离心混合液5分钟。
- 同时，干燥用于接合的LB平板：将平板在37 °C培养箱中打开放置10–15分钟。
- 从细胞混合物中弃去上清液，仅保留50 µl。
- 用剩余的50 µl上清液重悬细胞沉淀，并将悬液以一小滴形式移至干燥的LB平板上。
- 小心将平板置于通风橱中晾干（重要提示：切勿使细胞在平板上扩散，否则会显著降低接合效率）。
- 待液滴完全干燥后，将LB平板倒置，于37 °C孵育4–6小时。
- 在细胞混合物孵育期间，准备含300 µg/ml庆大霉素的大尺寸（150 O.D. × 15 mm）PIA平板；使用前将其置于37 °C培养箱中15–20分钟，以去除表面残留水分。
- 细胞混合物孵育结束后，用无菌接种环收集细胞，转移至含1 ml LB的微量离心管中，通过涡旋或移液充分混匀。
- 将细胞均匀涂布于含300 µg/ml庆大霉素的大尺寸PIA平板上。（重要提示：此步骤建议将逐渐增加的细胞混合物体积分别接种至不同平板，e.g. 平板1：10 µl，平板2：50 µl，平板3：100 µl，平板4：500 µl， etc.）
- 于37 °C过夜培养。
2. 黏液型菌落的检测与分离
- 从培养箱中取出平板，观察是否有黏液状菌落。
- 挑取单个黏液状菌落，在含有PIA和300 µg/ml庆大霉素的小型平板（100 O.D. × 10 mm）上划线分离。
- 在37 °C下培养过夜。
- 对前一步过夜培养物重复步骤 2.2。
- 再重复步骤 2.2–2.4 两次，以确定黏液状分离株的稳定性。
- 最终分离步骤完成后，用单个黏液状菌落接种4.5 ml LB培养基，在37 °C摇床中过夜培养。
- 次日，为每个黏液状突变株标记3个微量离心管。
- 将过夜培养物分别取1.25 ml两份加入两个离心管中，用于基因组DNA提取及转座子插入位点的鉴定（见方案3）。
- 此外，通过移液将1 ml过夜培养物加入已标记妥当、含有等体积10%脱脂牛奶的冻存管中，以保存各黏液状突变株。于-86 °C保存。
3. 基因组DNA的限制性消化与连接
- 使用任何首选方法从黏液状突变体中提取基因组DNA（gDNA）例如酚-氯仿，离心柱 等。).
- 测定gDNA的浓度，用1 µl限制性内切酶SalI、0.5 µl牛血清白蛋白和5 µl SalI酶缓冲液（100 mM NaCl，50 mM Tris-HCl，10 mM MgCl）对总共2 µg的gDNA进行消化2，1 mM 二硫苏糖醇（DTT），室温下 pH 7.9），以及适量体积的 dH₂O2O，使总体积达到50 µl。
- 37 °C 过夜消化 DNA。（重要提示：根据限制性内切酶的效率，可能需要在过夜消化后额外加入 1 µl 酶，并在 37 °C 继续孵育 1–2 小时。此步骤为过夜消化之外的补充操作。）
- 使用任何首选方法纯化已消化的DNA（例如 琼脂糖凝胶纯化、离心柱）并用 25 µl 缓冲液洗脱。
- 将纯化的DNA约11 µl（浓度优选为~10–20 ng/µl）与1.5 µl连接缓冲液（330 mM Tris-乙酸盐，pH 7.5，660 mM乙酸钾，100 mM乙酸镁，5 mM DTT）、1.5 µl 100 mM ATP和1 µl DNA连接酶混合，进行消化后DNA的连接反应。
- 将混合物在室温下孵育15分钟，然后在70 °C孵育15分钟以灭活酶。（注意：延长室温孵育时间可能提高连接反应的成功率）。
4. 反向PCR（iPCR）与序列分析
- 使用以下正向和反向引物及热循环条件对连接产物进行 iPCR：
-上游引物（Gm3OUT）：GGGCATACGGGAAGAAGTGA
- 反向引物（Gm5OUT）：GACTGCCCTGCTGCGTAACA
热循环仪条件：
1. 94 °C，1 分钟。
2. 94 °C 下变性 1 分钟。
3. 58 °C 反应 2 分钟。
4. 72 °C 反应 2 分钟。
5. 72 °C 反应 8 分钟。
6. 10 °C 保持。
重复步骤 2-4，共 34 个循环。
（注意：扩增的iPCR产物可在4 °C保存。） - 通过琼脂糖凝胶电泳确认iPCR扩增是否成功。
- 使用 Gm3OUT 和 Gm5OUT 引物对 iPCR 产物进行测序。确定插入位点及插入片段的方向 himar1 被绘制出来。
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结果
如图1所示，微型-himar1 mariner 转座子载体 pFAC 包含两段27 bp的反向重复序列，其侧翼为插入位点TA，中间为aacC1庆大霉素抗性盒及其依赖σ70的启动子，以及一个多克隆位点（MCS）。此外，pFAC载体还含有编码高活性himar1转座酶、β-内酰胺酶（bla）以及tra转移操纵子的基因。TA插入位点可实现该载体在铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株基因组中的高效整合。准确识别和筛选黏液型突变体对于确定参与藻酸盐调控的基因位点至关重要。图1展示了黏液型和非黏液型分离株的示例。
为了更准确地鉴定黏液型突变株，应将完成的接合反应产物接种到多个大培养皿（150 mm）上。将细胞混合物重悬于无菌PBS中，并涂布于含庆大霉素（300 µg/ml）的PIA平板上。用PBS对细胞混合物进行梯度稀释，使每个平板上长出1,000–3,000个菌落。根据上述方案，每次接合反...
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讨论
需要注意的是，该方法也可用于其他假单胞菌属（Pseudomonas）物种，但需进行以下修改：荧光假单胞菌（P. fluorescens）和恶臭假单胞菌（P. putida）应在30 °C下培养，而施氏假单胞菌（P. stutzeri）则应在42 °C下培养；施氏假单胞菌（P. stuzeri）应接种于添加了150 µg/mL庆大霉素的LB平板上；在步骤1.11中，应将施氏假单胞菌（P. stutzeri）细胞转移至500 µl LB培养基中，而非1 ml。此外，本实验方案中有两个关键步骤。首先，受体菌株必须在适当的温度下培养。例如，PAO1应在42 °C下培养，以提高重组频率15。如果受体菌株未在正确温度下培养，突变文库的效率将显著降低。其次，反向PCR（iPCR）具有高度可重复性，但基因组DNA（gDNA）必须完全消化，以确保可通过DNA连接形成共价闭合的环状DNA。若操作正确，iPCR产物在琼脂糖凝胶电泳中应呈现为单一条带。若出现多条条带，则表明该突变体中存在多个插入片段。我们发现，iPCR结果与Sout...
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披露
作者 Hongwei D. Yu 是 Progenesis Technologies, LLC 的首席科学官兼联合创始人。
致谢
本研究工作得到了美国国家航空航天局西弗吉尼亚太空拨款联盟（NASA WVSGC）、囊性纤维化基金会（CFF-YU11G0）以及美国国立卫生研究院（NIH）P20RR016477 和 P20GM103434 项目对西弗吉尼亚州生物医学研究卓越创新与发展计划网络（IDeA Network for Biomedical Research Excellence）的支持。 我们感谢 Vonya M. Eisinger 在本研究工作中提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LB培养基（Luria Broth） | Difco | 240230 | 通过Fisher Scientific购买 |
| Pseudomonas分离琼脂 | Difco | 292710 | 通过Fisher Scientific购买 |
| 小型培养皿（100 O.D. × 10 mm） | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| 大型培养皿（150 O.D. × 15 mm） | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| 甘油（Glycerol） | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| 台式摇床培养箱 | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | 以200 rpm振荡 |
| 恒温培养箱 | VWR | 1540 | |
| 台式微量离心机 | Sorvall | 75-003-287 | 通过Fisher Scientific购买 |
| SmartSpec Plus分光光度计 | Bio-Rad | 170-2525 | 或选用其他方法/供应商 |
| 一次性接种环 | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 ml微量离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 ml冻存管 | Corning | 430659 | 通过Fisher Scientific购买 |
| 15 ml离心管 | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| 脱脂奶粉（Skim Milk） | Difco | DF0032-17-3 | 通过Fisher Scientific购买 |
| DNeasy血液与组织试剂盒（250） | Qiagen | 69506 | 或选用其他方法/供应商 |
| QIAquick PCR纯化试剂盒（250） | Qiagen | 28106 | 或选用其他方法/供应商 |
| QIAprep Spin质粒小提试剂盒（250） | Qiagen | 27106 | 或选用其他方法/供应商 |
| FastLink II DNA连接试剂盒 | Epicentre Technologies | LK6201H | 通过Fisher Scientific购买 |
| Accu block数字干式恒温器 | Labnet | NC0205808 | 通过Fisher Scientific购买 |
| SalI限制性内切酶 | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | 通过Fisher Scientific购买 |
| Taq DNA聚合酶 | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler梯度PCR仪 | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE琼脂糖 | Genemate | 3120-500 | 通过Fisher Scientific购买 |
| 硫酸庆大霉素（Gentamycin Sulfate） | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 ml冻存管 | Corning | 430659 | 通过Fisher Scientific购买 |
参考文献
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