鉴定与海藻酸盐产生相关的新基因 铜绿假单胞菌 使用微型装置himar1 Mariner 转座子介导的诱变

摘要

在此，我们介绍一种使用微型装置的实验方案himar1 mariner转座子介导的诱变用于构建高密度插入突变体文库，以筛选、分离和鉴定模式菌株中新的海藻酸盐调控因子 铜绿假单胞菌 菌株PAO1

摘要

铜绿假单胞菌 是一种革兰氏阴性环境细菌，具有多样的代谢能力。 P. aeruginosa 是一种机会性细菌病原体，可在囊性纤维化（CF）患者中引起慢性肺部感染。该菌过度产生一种称为藻酸盐的荚膜多糖，这一表型也被称为黏液状表型（mucoidy），可促进形成黏液状生物膜，这类生物膜对抗生素化疗和宿主防御机制的抵抗力强于浮游状态的细菌细胞。此外，由非黏液状向黏液状表型的转化是CF患者进入慢性感染阶段的临床标志。藻酸盐的过度产生由 P. aeruginosa 是一个吸能过程，会大量消耗细胞能量。因此，海藻酸盐的合成在细胞内受到严格调控 P. aeruginosa为了更好地理解海藻酸盐的调控机制，我们描述了一种使用微型装置的实验方案himar1 转座子诱变法用于鉴定原型菌株PAO1中新的海藻酸盐调控因子。该实验流程包括两个基本步骤。首先，我们转移了mini-himar1 转座子（pFAC）从宿主 E. coli SM10/λpir 转入受体菌 P. aeruginosa PAO1 通过 双亲接合以构建高密度插入突变体文库，并在后续进行筛选 假单胞菌 添加庆大霉素的分离琼脂平板。其次，我们筛选并分离黏液型菌落，利用指向庆大霉素抗性盒外侧的DNA引物进行反向PCR，并结合DNA测序以定位插入位点。通过该方案，我们已鉴定出两个新的海藻酸盐调控因子， mucE (PA4033) 和 kinB (PA5484)，在野生型菌株PAO1中 mucA 编码抗σ因子MucA，该因子作用于藻酸盐合成主要调控因子AlgU（AlgT，σ²²该高通量诱变方案可经修改用于鉴定其他与毒力相关且导致菌落形态改变的基因。

引言

机会性革兰氏阴性病原体的能力 铜绿假单胞菌 过度产生藻酸盐是其形成生物膜能力的关键因素。藻酸盐的过度产生是一种常被称为黏液型的表型。从囊性纤维化（CF）患者痰液中分离出黏液型菌落，提示存在慢性感染，并与患者整体健康状况恶化直接相关。¹目前认为，藻酸盐的调控与合成机制涉及 P. aeruginosa 主要发生在两个操纵子上。第一个是海藻酸生物合成操纵子，包含12个基因（algD-alg8-alg44-algK-algE-algG-algX-algL-algI-algJ-algF-algA负责将藻酸盐聚合物在周质空间合成并转运至胞外环境的蛋白^2-5第二个操纵子是以替代σ因子开头的一组基因簇 algU/T 并继续进行 mucA, mucB，以及 mucDAlgU/T 是一种正向调控因子，而 mucAB-D 被归类为藻酸盐生成的负调控因子^6-8此外，转录调控因子（如 AlgB、AlgQ、AlgR 和 RpoN）以及通过分解代谢物阻遏控制、激酶活性（KinB）和膜内蛋白水解所介导的转录后和翻译后修饰也被证实参与了藻酸盐的调控。^9-....

方案

1. 细菌菌株的制备与双亲接合

1. 将含有15 µg/ml庆大霉素的5 ml LB（Luria Broth）培养基接种E. coli SM10/λpir/pFAC，并于37 °C摇床培养过夜。
2. 将P. aeruginosa菌株PAO1接种于5 ml LB培养基中，于42 °C摇床培养过夜。
3. 测定过夜培养物的OD₆₀₀值，并等量混合PAO1与E. coli pFAC，使终体积为1–1.4 ml。
4. 在6,000 × g条件下离心混合液5分钟。
5. 同时，干燥用于接合的LB平板：将平板在37 °C培养箱中打开放置10–15分钟。
6. 从细胞混合物中弃去上清液，仅保留50 µl。
7. 用剩余的50 µl上清液重悬细胞沉淀，并将悬液以一小滴形式移至干燥的LB平板上。
8. 小心将平板置于通风橱中晾干（重要提示：切勿使细胞在平板上扩散，否则会显著降低接合效率）。
9. 待液滴完全干燥后，将LB平板倒置，于37 °C孵育4–6小时。
10. 在细胞混合物孵育期间，准备含300 µg/ml庆大霉素的大尺寸（150 O.D. × 15 mm）PIA平板；使用前将其置于37 °C培养箱中15–20分钟，以去除表面残留水分。
11. 细胞混合物孵育结束后，用无菌接种环收集细胞，转移至含1 ml LB的....

结果

如图1所示，微型-himar1 mariner 转座子载体 pFAC 包含两段27 bp的反向重复序列，其侧翼为插入位点TA，中间为aacC1庆大霉素抗性盒及其依赖σ⁷⁰的启动子，以及一个多克隆位点（MCS）。此外，pFAC载体还含有编码高活性himar1转座酶、β-内酰胺酶（bla）以及tra转移操纵子的基因。TA插入位点可实现该载体在铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株基因组中的高效整合。准确识别和筛选黏液型突变体对于确定参与藻酸盐调控的基因位点至关重要。图1展示了黏液型和非黏液型分离株的示例。

为了更准确地鉴定黏液型突变株，应将完成的接合反应产物接种到多个大培养皿（150 mm）上。将细胞混合物重悬于无菌PBS中，并涂布于含庆大霉素（300 µg/ml）的PIA平板上。用PBS对细胞混合物进行梯度稀释，使每个平板上长出1,000–3,000个菌落。根据上述方案，每次接合反.......

讨论

需要注意的是，该方法也可用于其他假单胞菌属（Pseudomonas）物种，但需进行以下修改：荧光假单胞菌（P. fluorescens）和恶臭假单胞菌（P. putida）应在30 °C下培养，而施氏假单胞菌（P. stutzeri）则应在42 °C下培养；施氏假单胞菌（P. stuzeri）应接种于添加了150 µg/mL庆大霉素的LB平板上；在步骤1.11中，应将施氏假单胞菌（P. stutzeri）细胞转移至500 µl LB培养基中，而非1 ml。此外，本实验方案中有两个关键步骤。首先，受体菌株必须在适当的温度下培养。例如，PAO1应在42 °C下培养，以提高重组频率¹⁵。如果受体菌株未在正确温度下培养，突变文库的效率将显著降低。其次，反向PCR（iPCR）具有高度可重复性，但基因组DNA（gDNA）必须完全消化，以确保可通过DNA连接形成共价闭合的环状DNA。若操作正确，iPCR产物在琼脂糖凝胶电泳中应呈现为单一条带。若出现多条条带，则表明该突变体中存在多个插入片段。我们发现，iPCR结果与Sout.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB培养基（Luria Broth）	Difco	240230	通过Fisher Scientific购买
Pseudomonas分离琼脂	Difco	292710	通过Fisher Scientific购买
小型培养皿（100 O.D. × 10 mm）	Fisher Scientific	08-757-13
大型培养皿（150 O.D. × 15 mm）	Fisher Scientific	08-757-14
甘油（Glycerol）	Fisher Scientific	BP229-4
台式摇床培养箱	New Brunswick Scientific	Innova 4080	以200 rpm振荡
恒温培养箱	VWR	1540
台式微量离心机	Sorvall	75-003-287	通过Fisher Scientific购买
SmartSpec Plus分光光度计	Bio-Rad	170-2525	或选用其他方法/供应商
一次性接种环	Fisher Scientific	22-363-597
1.5 ml微量离心管	Fisher Scientific	05-408-129
2.0 ml冻存管	Corning	430659	通过Fisher Scientific购买
15 ml离心管	Fisher Scientific	05-539-12
脱脂奶粉（Skim Milk）	Difco	DF0032-17-3	通过Fisher Scientific购买
DNeasy血液与组织试剂盒（250）	Qiagen	69506	或选用其他方法/供应商
QIAquick PCR纯化试剂盒（250）	Qiagen	28106	或选用其他方法/供应商
QIAprep Spin质粒小提试剂盒（250）	Qiagen	27106	或选用其他方法/供应商
FastLink II DNA连接试剂盒	Epicentre Technologies	LK6201H	通过Fisher Scientific购买
Accu block数字干式恒温器	Labnet	NC0205808	通过Fisher Scientific购买
SalI限制性内切酶	New England BioLabs	R0138L
EasyStart Micro 50	Molecular BioProducts	6020	通过Fisher Scientific购买
Taq DNA聚合酶	New England BioLabs	M0267L
iCycler梯度PCR仪	Bio-Rad	170-8740
LE琼脂糖	Genemate	3120-500	通过Fisher Scientific购买
硫酸庆大霉素（Gentamycin Sulfate）	Fisher Scientific	BP918-1
2.0 ml冻存管	Corning	430659	通过Fisher Scientific购买