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方法文章

从基础脊椎动物谱系制备原代成肌前体细胞/成肌细胞培养物

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DOI：

10.3791/51354

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2014年4月30日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham, 2Nutrition Métabolisme Aquaculture, INRA UR1067, 3Laboratoire de Physiologie et Genomique des Poissons, INRA UR1037

本文内容

摘要

体外培养系统已证明对我们理解脊椎动物肌发生过程至关重要。然而，关于非哺乳类脊椎动物骨骼肌的发育与生长，尤其是在基部分类群中，仍有许多未知之处。建立一种高效且稳定的原代培养方案，用于分离该组织中的成肌前体细胞（MPCs）——即具有自我更新能力的成肌祖细胞，并维持其自我更新、增殖和分化能力，有助于揭示脊椎动物各谱系中保守与分化的调控机制。

摘要

由于研究肌源性程序本身具有难度且耗时较长 体内由骨骼肌中固有的成体干细胞——肌源性前体细胞（MPCs）建立的原代培养系统，已被证明对于理解哺乳动物骨骼肌的发育与生长不可或缺。尤其在基础分类群中 脊索动物门， 然而，关于调控肌肉前体细胞自我更新、增殖和分化的分子机制，目前的研究数据仍然有限。特别值得关注的是，基础脊椎动物在幼体后阶段能够发生显著的骨骼肌纤维增生，其潜在的分子机制尤为引人兴趣。即 硬骨鱼类）以及附肢丢失后的完全再生（即 有尾两栖动物）。此外，培养成肌细胞有助于理解再生过程、成肌程序的重演及其间的差异。为此，我们详细描述了一种稳健且高效的实验方案（及其变体），用于分离和维持肌肉前体细胞（MPCs）及其后代——成肌细胞和未成熟肌管——在细胞培养中的生长，以此作为研究从较基础的脊椎动物开始成肌程序演化的平台。充分利用斑马鱼（zebrafish）作为模式生物的优势，Danio rerio），我们报道了该方案在鲤科支系小型鱼类中的应用 Danioninae同时，本方案可用于通过分离墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）甚至实验室啮齿类动物。该方案现已被广泛用于多种鱼类物种的肌生成研究，包括虹鳟、鲑鱼和海鲷。1-4.

引言

通过在原代小鼠细胞中重现这一过程，人们对哺乳动物肌生成已有相当深入的理解Mus musculus) 成肌细胞培养物和广泛研究的小鼠来源细胞系 C2C125从20世纪50年代开始6这些培养技术极大地推动了对小鼠成肌程序的理解，并进一步促进了对其他脊椎动物肌生成过程的认识。此外，单根肌纤维外植技术也增强了我们对卫星细胞与周围肌纤维之间相互作用的理解。7-9细胞培养因其从祖细胞到分化细胞的周期较短，特别适用于肌生成研究10，RNAi转染的相对简便性11-14，转基因15,16 过表达研究14,17,18 , 体外 扩增，随后进行 体内 移植18-20以及跨物种的成肌前体细胞及其调控因子的比较21,22尽管已有文献描述了由于培养体系的人工环境所导致的差异5,23 ，这些 体外 在哺乳动物中，这些系统已被证明对于解析由单核增殖性前体细胞（即肌卫星细胞，MSCs）形成多核、终末分化的肌纤维的复杂程序至关重要。

课堂之外 哺乳纲然而，控制肌生成的机制在不同物种间的保守性与/或差异性仍不清楚，这主要归因于培养来自不同分类群的肌源性前体细胞（MPCs）和成肌细胞的困难。事实上，目前仅在三种鸟类中成功建立了原代成肌细胞培养体系24-26，一种爬行动物27，少数两栖动物28-30，以及一些鱼类1,3,4,31-33. 来自非啮齿类脊椎动物的连续成肌细胞系34-36更为罕见，其中唯一的非哺乳动物成肌细胞系源自日本鹌鹑（Cortunix japonica），QM737尽管进行了多次永生化尝试，仍未能成功建立硬骨鱼类成肌细胞系，而针对这些细胞的高效转染方案直至今年才得以发表15因此，建立清晰且经过优化的原代肌肉前体细胞（MPCs）和成肌细胞培养方案，涵盖多种脊椎动物，不仅对于进一步拓展我们对成肌程序进化机制的认识至关重要，而且有助于利用比较生理学的强大优势，推动人类骨骼肌疾病及相关障碍治疗领域的突破。

尽管文献中已有大量关于MPC/成肌细胞分离的报道38-49，但作者通常仅以简略且常不完整的形式描述这些分离方案。此外，已发表的最具指导性的方案主要是针对小鼠建立的50-53，其中一些依赖抗体筛选54,55或荧光转基因标记56,57，这使得这些方案在肌肉生物学研究中常用的大多数非啮齿类物种中无法使用或不切实际。鉴于目前对鱼类、两栖类和爬行类的成肌过程了解甚少，一个详细而全面的实验方案，辅以视听指导，并已在远缘相关物种中验证其有效性，将对该领域具有重要意义。

首次由 Powell 及其同事于 1989 年描述58，以下方案最初是为了从鲑科鱼类（即虹鳟， Oncorhynchus mykiss，以及大西洋鲑鱼， Salmo salar）以及一些较大的鲤科鱼类（即 金鱼， Carassius auratus auratus2000年，Fauconneau和Paboeuf优化了虹鳟鱼原代成肌细胞培养方法59，并对该方案进行了若干优化，使其可应用于多种体型较小的鲤科鱼类 Danioninae 进化枝（斑马鱼， Danio rerio和大斑马鱼 Devario aequipinnatus)32 由于斑马鱼及其近缘物种拥有丰富的遗传学研究工具，因此成为研究的理想对象。硬骨鱼类因其独特的生长策略（至少在大多数物种中如此）而具有较高的研究价值。大型鲑科鱼类与大多数鱼类相似，具有无限生长的特性，其生长潜力不会因成熟而达到渐近极限，即使在老年阶段仍具有生长能力。60-62与斑马鱼不同，大型丹尼奥鱼如巨型丹尼奥63 以及小口脂鲤展现出典型的硬骨鱼类生长潜力，使其直接对比成为研究肌肉前体细胞命运选择在骨骼肌增生与肥大中是否发挥作用的理想平台。

同样，我们已证明该方案可用于小鼠和墨西哥钝口螈，细胞得率和存活率指标相对较高。有尾目蝾螈，例如墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum），具有再生组织的显著能力，包括完整的四肢和尾部64-66。这一特性使这些两栖动物成为研究骨骼肌萎缩和衰老的有趣模型。采用下述方案，可实施与多种鱼类研究中类似的方法，从而为相关研究提供更广泛的比较背景。正如许多真正的比较生物学家所认识到的，当数据在最广泛的范围内（此处指整个脊椎动物谱系）进行分析时，基础生物学和转化生物医学领域才能取得最具意义的进展。

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方案

伦理声明：本文所述涉及脊椎动物的所有实验均事先获得阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物照护与使用委员会的批准，并符合美国卫生与公共服务部下属国立卫生研究院实验室动物福利办公室所制定的指南。

1. 培养前准备

  1. 按如下方法制备基础培养基：在 DMEM（13.48 g/L；2 L 中含 26.96 g）中加入 9 mM NaHCO3（每 2 L 含 1.51 g）和 20 mM HEPES（每 2 L 含 9.53 g）。
    1. 测定 pH 值，并用 HCl 或 NaOH 调整至 7.40。
    2. 测定渗透压，并用 NaCl 调整至约 300 mOsm（如需要）。
    3. 使用两个 1 L 真空过滤灭菌系统进行过滤灭菌，置于 4 °C 避光保存，可保存 2–3 个月。
      注：完整的试剂、工具、耗材和设备信息请参见表 1和表 2。
  2. 通过将 5 mg γ-射线照射的多聚-L-赖氨酸（> 300,000 mw）溶解于 50 ml 超纯无菌水中，制备多聚-L-赖氨酸处理的培养板。室温下轻轻颠倒混匀 10 分钟，确保赖氨酸聚合物完全溶解。
  3. 根据培养板类型（参见表 3），将所需量的多聚-L-赖氨酸溶液加入各孔中。将培养板置于超净台中静置 5 分钟。
  4. 随后吸除多聚-L-赖氨酸溶液，并用无菌水洗涤两次。将培养板置于超净台中晾干 20 分钟。
  5. 取 1 mg 层粘连蛋白（来源于 Engelbreth-Holm-Swarm）溶解于 50 ml 基础培养基中，终浓度为 20 μg/ml。将层粘连蛋白溶液以 2 μg/cm2 的量加入经多聚-L-赖氨酸处理的细胞培养板中（不同规格培养板的用量参见表 3）。
  6. 轻轻摇晃培养板，确保溶液均匀覆盖各孔。用封口膜密封培养板，并置于培养箱中孵育 24 小时。培养箱温度应根据所用物种设定（参见表 7），无需额外添加气体。
    注：在接种细胞前，必须让层粘连蛋白在培养板上吸附 24 小时。若未执行此步骤，将导致细胞贴壁效果差甚至完全不贴壁。
  7. 按照表 4所述方法配制培养基。完全培养基最好在使用当天配制。
  8. 为组织分离做准备，组装以下物品并进行高压灭菌：300–500 ml 烧杯；玻璃培养皿；手术刀柄；镊子（精细和粗型）；解剖剪刀；以及若干张防水灭菌纸。
    注：每位参与解剖操作的人员配备 2 把手术刀柄、1 把镊子（类型依个人偏好而定）、1 把解剖剪刀和 5–10 张防水灭菌纸即可满足需求。
  9. 除上述灭菌物品外，还需准备 70% 乙醇、电子天平、无菌 50 ml 离心管（数量依培养规模而定）和冰。

2. 组织解剖

  1. 开始前，确保有足够的鱼类储备。
    注意：所用鱼类的年龄至关重要。即使两种不同物种的鱼体重相近，其中一种较年轻的鱼所含的肌肉前体细胞（MPCs）也会多于另一种较年长的鱼。一般而言，尤其是使用鲑科鱼类时，较年轻的鱼效果最佳。对于短鳍鱼（danionins），最佳使用年龄可达一岁；而对于鲑科鱼类，则以4至6个月或更小（体重不超过15 g）为最佳。
  2. 每解剖5 g组织，取25 ml 分离培养基于无菌的50 ml 锥形管中。
  3. 称重、记录质量并标记管子编号，将管子置于冰上。
  4. 每次将2-3条鱼浸入浓度超过> 300 mg/L的碳酸氢钠缓冲三卡因甲磺酸盐溶液中实施安乐死。待鳃盖运动停止超过> 5分钟后，将鱼浸入70%乙醇（置于无菌烧杯中）中30秒。
  5. 将鱼从70%乙醇中取出，放置于防水灭菌纸上。在鳃盖后方，使用解剖刀做一个表浅的切口。从上述切口处捏住皮肤并向鱼尾方向拉扯，以去除鳞片和皮肤。
  6. 去皮后，从鱼体两侧切取轴上、快缩糖酵解型“白色”肌肉组织（避免靠近侧线处的慢缩氧化型“红色”肌肉），并将其放入分离培养基中。根据机构规定丢弃鱼的其余部分。
    注意：尽管完全可以培养来源于红肌的MPCs，但几乎所有使用硬骨鱼类MPCs的研究文献均采用从轴上肌节分离得到的细胞。
  7. 重复步骤2.4–2.6，直至获得足够量的肌肉组织。在解剖过程中，确保合并的肌肉组织始终置于冰上，以维持细胞活性。

3. 机械解离

  1. 将一管25 ml/5 g的肌肉组织倒入玻璃培养皿中。使用两把装有#10刀片的手术刀柄，将组织切碎至浆状或糊状。采用两把手术刀片相互来回拉动的方式效果最佳。
    注意：尽管组织匀浆器看似适用，但其可能导致存活细胞数量显著减少，甚至完全丧失。
  2. 使用25 ml 移液管和移液器，将浆状组织转移回原来的锥形管中。
  3. 重复步骤3.1–3.2，直至所有管中的组织均完成机械解离。
  4. 将组织在300 x g、10 °C条件下离心5分钟。
  5. 离心后，使用25 ml 移液管、真空抽吸装置或小心倾倒的方式，弃去25 ml 上清培养基。
  6. 向每管中加入25 ml 洗涤液，重悬组织，然后按上述条件再次离心。
  7. 用洗涤液洗涤两次，每次均弃去上清液。

4. 酶解离

  1. 在步骤3.4中，通过将0.22 g IV型胶原酶与44 ml混合来制备胶原酶溶液 基础培养基（或0.11 g/0.22 ml的足够量）。
  2. 在 4 °C 下于烧杯中搅拌 10–15 分钟。使用 50 ml 注射器和0.45 μm注射器滤器
    注意：根据胶原酶制剂的不同，可能需要使用多个注射器滤器。除 Worthington Biochemical 以外的供应商提供的胶原酶在过滤时难度更大。胶原酶用于解离构成肌内膜的胶原蛋白中的肽键，该消化过程将去除肌纤维的保护屏障。
  3. 每克肌肉组织用10 ml 0.2%胶原酶溶液重悬组织。对于5 g肌肉组织，加入100 ml 胶原酶溶液和15 ml 基础培养基
  4. 加入10 μl 每毫升 PSF 的颗粒数 胶原酶溶液/基础培养基（例如 250 μl 至25 ml）。确保组织充分悬浮，因为这将影响酶消化的效率。
  5. 将肌肉组织在胶原酶中于18 °C轻柔振荡孵育60分钟。根据机械解离程度和物种不同，胶原酶消化时间可延长至90分钟，但可能影响细胞活力。
  6. 胶原酶消化后，将锥形管在300 × g离心 x 在12 °C下以g离心5分钟。弃去上清液，将组织重悬于25 ml 洗涤液
  7. 再次以300离心 x 12 °C 下离心 5 分钟。用洗涤液再重复洗涤一次。
  8. 组织洗涤两次后，将肌肉组织重悬于25 ml 洗液并用10 ml 用移液管反复吹打组织/培养基匀浆，直至其顺畅地进出移液管，通常吹打5–10次即可。
    1. 重复使用 5 ml 血清移液管，然后连接注射器上的16号金属套管。
  9. 将锥形管在300 × g条件下离心 x 12 °C 下以 g 离心 5 分钟。倾去上清液。
  10. 在上述5分钟离心期间，通过将0.25 g胰蛋白酶与5 ml混合来制备胰蛋白酶消化液 基础培养基
  11. 4 °C下搅拌10–15分钟，用20 ml滤器过滤除菌 注射器和0.45 μm注射器滤器
  12. 取出锥形管，加入 100 μl 胰蛋白酶溶液 4.9 ml 每克肌肉组织加入500 μl解离液至每个试管中。例如，加入500 μl 胰蛋白酶溶液和24.5毫升 将解离培养基加入5 g肌肉组织中。
    注意：胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，可将成肌前体细胞从基底膜上分离。
  13. 将组织重悬于胰蛋白酶/解离培养基中，于 18 °C 孵育 20 分钟。
  14. 第一次胰蛋白酶孵育后，将锥形管在300 × g下离心 x g 12 °C 下持续 1 分钟。
  15. 通过将上清液与中和液混合来中和胰蛋白酶 分离培养基 以1体积上清液与4体积分离培养基的比例混合。在第二次胰蛋白酶消化期间，于4 °C保存。
  16. 向剩余的组织沉淀中重复步骤 4.12–4.15，将步骤 4.15 后所得上清液与第一次胰蛋白酶消化所得的上清液/分离培养基合并。
  17. 或者： 可联合使用胶原酶和胰蛋白酶消化以最大化细胞产量。
    1. 为此，使用连接在20 ml注射器上的金属套管（长度6英寸，16号最佳） triturate 胶原酶消化物 注射器，直至匀浆液能顺利通过套管针。
    2. 向匀浆中加入 500 μl 加入胰蛋白酶溶液（步骤4.10中配制），在18 °C下孵育20分钟。
    3. 孵育结束后，将锥形管在300 x 在12 °C下以g离心1分钟。
    4. 通过将上清液与中和液混合来中和胰蛋白酶 分离培养基 以1体积上清液与4体积分离培养基的比例混合。
    5. 4 °C 条件下保存，用于第二次胰蛋白酶消化。
    6. 按照标准方案进行步骤4.18。
  18. 将最终的上清液/分离培养基混合物分装至50 ml锥形管中，在300 × g条件下离心 x g 12 °C 下持续 10 分钟。
  19. 移除上清液时需小心，避免扰动细胞沉淀。用移液器加入2 ml 的 完全培养基 将细胞沉淀充分溶解于各管中。
  20. 将悬浮于完全培养基中的细胞合并至一个 50 ml 锥形管
  21. 用1 ml冲洗每根试管 完全培养基，与先前重悬的细胞悬液混合。
  22. 用金属套管和注射器吹打5-10次。
  23. 用100 μm细胞滤网过滤细胞悬液，并用完全培养基冲洗。
  24. 通过40 μm细胞滤网过滤细胞悬液。
  25. 加入足够的完全培养基至 50 ml 并以300离心 x 15 °C下离心10分钟，转速为g。

5. 细胞计数、稀释与接种

  1. 在步骤4.25的最后一次离心后，通过小心倾倒或使用血清移液管去除上清液。将细胞沉淀重悬于5 ml 完全培养基
  2. 细胞完全重悬后，移除20 μl 细胞悬液，并置于1.5 ml离心管中 微量离心管
  3. 加入 5 μl 加入台盼蓝染料，静置5分钟。使用血细胞计数板测定活细胞数量。
  4. 确定后，将细胞稀释至所需浓度。硬骨鱼类MPCs的最佳接种密度为每平方厘米150,000–200,000个细胞。2对于六孔板接种策略，将细胞稀释至1.5 × 106 - 2.0 × 106 每毫升 支持充分的增殖与分化。
  5. 取出经多聚-L-赖氨酸处理并涂有层粘连蛋白的培养板，接种细胞。（参见 表5 （针对特定培养皿的稀释倍数和涂布体积。）注意： 表6 显示从不同硬骨鱼类肌肉组织中每克分离出的平均细胞数量。虹鳟（O. mykiss) 每克肌肉组织中的MPC数量少于斑马鱼（D. rerio因此需要分离更多的鱼以获得足够的接种量。
  6. 用实验室封口膜密封培养板，置于适当温度的低温培养箱中。此处列出的所有物种（小鼠除外）的主祖细胞（MPCs）均可在常压大气环境下培养，无需二氧化碳（CO₂）。2）补充。（参见 表7.)
  7. 或者： 一些实验室已采用一种方案，要求让MPCs在培养基质上贴壁40分钟。
    1. 然后用洗涤液冲洗培养板，以去除任何松散附着和非黏附的细胞。警告：此步骤非常重要，可避免其他细胞发生“非特异性”黏附。例如 成纤维细胞）与培养基质的黏附。
    2. 加入完全培养基，将细胞放入培养箱中，并按照下述方法进行培养。

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结果

接种后24小时，应可见成肌前体细胞（MPCs）已贴附于层粘连蛋白基质上（见图1a和图1d）。接种后，细胞（MPCs）呈现纺锤形，这是该细胞类型的典型特征（图1），且表达MyoD1（图2）。在Danio属物种中，MPCs显得更为致密，其双极突起较Oncorhynchus和Salmo属物种的MPCs更小。然而，在培养四天后，所检测的所有鱼类物种的MPCs均呈现出相似的形态，并明显表现出成肌细胞的特征（图1b和图1e）。应移除完全培养基，并用洗涤液对MPCs洗涤两次。成纤维细胞可能污染成肌细胞培养物，其星形形态（与成肌细胞的纺锤形相对）可将其与MPCs/成肌细胞轻易区分。对培养板进行洗涤可显著提高此类成纤维细胞的去除效果。

在本文所描述的物种中（见表7），每日更换培养基可获得最佳结果。在添加新鲜完全培...

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讨论

无论在何种物种中，肌源性程序均可通过以下方法最简便地研究 体外 系统。事实上，在分离后，鱼类的成肌前体细胞（MPCs）或哺乳动物的肌卫星细胞（MSCs）会迅速进入这一高度调控的过程，该过程涉及成肌细胞的增殖、细胞周期退出和终末分化，以及这些成肌细胞融合形成新生肌管。目前普遍缺乏可用于鱼类物种的转基因基因报告品系（斑马鱼可能除外）67 和虹鳟鱼69限制体内 MPC/MSC 激活、增殖和分化的研究，以及因此产生的 体外 此处介绍的系统是鱼类物种研究的一个理想平台。

无论何种物种，MPC/MSCs 的成功培养都高度依赖于以下三点：a）严格保持无菌操作；b）对骨骼肌组织进行充分的机械解离；c）优化酶消化条件。在肌肉组织分离的初始步骤中，必须格外注意在不造成污染的前提下获取足够量的组织。至关重要的是，鱼类（或其他任何实验动物）必须使用 70% 乙醇进行充分消毒，并保证足够的消毒时间。在我们的操作经验中，30 秒效果最佳；时间过短可能导致污染，而时间过长则可能破坏组织完整性并降低细胞活力。乙醇具有...

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致谢

作者谨向 Josep Planas 博士和 Juan Castillo 博士致以诚挚感谢，感谢他们在将本培养方案开发并应用于小型鱼类和两栖动物方面所提供的专业指导。同时感谢众多为从大量鱼类（包括多个物种和个体数量）中进行肌肉组织解剖与解离工作而不懈协助的人员，包括 Matthew Charging、Delci Christensen、Zachary Fowler、Brooke Franzen、Nathan Froehlich、Kira Marshall、Ben Meyer、Ethan Remily 和 Sinibaldo Romero。本研究得到了阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）生物学系启动资金、美国国立卫生研究院（NIH）资助号 #2P20 RR015566（蛋白酶研究中心）、NIH NIAMS 资助号 #R03AR055350 以及北达科他州立大学（NDSU）Advance FORWARD 美国国家科学基金会（NSF）资助号 HRD-0811239（授予 PRB）的支持。此外，研究还获得了 UAB 营养与肥胖研究中心资助号 P30DK056336（NIH NIDDK）的资助。本研究内容仅由作者负责，不一定代表 NIH 的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
表1. 详细试剂信息
试剂公司（首选 vs. 替代）目录号（首选 vs. 替代）每培养物用量
γ-射线辐照的聚-L-赖氨酸Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)P5899 (ICN19454405)5 mg
DMEM（高葡萄糖）Sigma-Aldrich (cellgro)MT-50-003-PB (D7777)2 L
层粘连蛋白BD Biosciences (Sigma-Aldrich)CB-40232 (L2020)1 mg
碳酸氢钠 (NaHCO3)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP328-500 (S5761)1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)BP310-1 (H6147)9.53 g
抗生素/抗真菌剂Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)SV3007901 (A5955)17–20 mL
硫酸庆大霉素Lonza (Sigma-Aldrich)BW17-519Z (G1397)2–3 mL
供体马血清Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007403 (H1270)75 mL
胎牛血清Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)SH3007103 (F2442)25 mL
胶原酶（IV型）Worthington (Sigma-Aldrich)LS004189 (C9891)0.44 g
胰蛋白酶（来自胰腺）MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)ICN15357125 (T5266)1 g
表2. 耗材、工具与设备
耗材工具设备
细胞培养板镊子（粗齿）移液器
无菌50 mL锥形管镊子（细齿）pH计
实验室胶带手术刀柄低温培养箱（Echotherm）
0.2 μm 真空过滤灭菌系统手术刀片（#10, #11）超净工作台
防水高压灭菌纸手术剪刀真空抽滤装置
移液管玻璃培养皿微渗透压计
12–16 G 带鲁尔锁接头的套管针
表3. 细胞培养板包被的优化体积
板规格每孔面积（cm²）聚-L-赖氨酸*层粘连蛋白**
6孔板9.51.6 mL1
24孔板1.90.320.2
48孔板0.950.160.1
96孔板0.320.060.03
* 浓度为0.1 mg/mL** 浓度为0.020 mg/mL
表4. 分离、解离和培养用培养基
试剂分离洗涤解离
基础培养基419.25 mL395.40 mL297.00 mL
硫酸庆大霉素**0.75 mL0.60 mL–
供体马血清75.00 mL––
胎牛血清***–––
* PSF：青霉素/链霉素/两性霉素B混合液（100倍浓缩）；** 浓度为50 mg/mL；*** 经鉴定
表5. 推荐稀释比例与接种体积
板规格每孔面积（cm²）稀释比例接种体积
6孔板9.51.5–2.0×10⁶ 个细胞/mL1 mL
24孔板1.91.5–2.0×10⁶ 个细胞/mL250 μL
48孔板0.951.5–2.0×10⁶ 个细胞/mL150 μL
96孔板0.321.5–2.0×10⁶ 个细胞/mL50–100 μL
表6. 每克组织平均细胞数
物种每克组织平均细胞数
Danio rerio6,400,000
Danio dangila1,783,000
Devario aequipinnatus1,797,000
Oncorhynchus mykiss66,800
表7. 推荐培养温度
物种温度
Danio/Devario spp.26–28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.10*–18 °C
Ambystoma mexicanum18°C
* 较低温度支持较低的增殖速率。

参考文献

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