体外培养系统已证明对我们理解脊椎动物肌发生过程至关重要。然而，关于非哺乳类脊椎动物骨骼肌的发育与生长，尤其是在基部分类群中，仍有许多未知之处。建立一种高效且稳定的原代培养方案，用于分离该组织中的成肌前体细胞（MPCs）——即具有自我更新能力的成肌祖细胞，并维持其自我更新、增殖和分化能力，有助于揭示脊椎动物各谱系中保守与分化的调控机制。
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摘要
摘要
由于研究肌源性程序本身具有难度且耗时较长 体内由骨骼肌中固有的成体干细胞——肌源性前体细胞（MPCs）建立的原代培养系统，已被证明对于理解哺乳动物骨骼肌的发育与生长不可或缺。尤其在基础分类群中 脊索动物门， 然而，关于调控肌肉前体细胞自我更新、增殖和分化的分子机制，目前的研究数据仍然有限。特别值得关注的是，基础脊椎动物在幼体后阶段能够发生显著的骨骼肌纤维增生，其潜在的分子机制尤为引人兴趣。即 硬骨鱼类）以及附肢丢失后的完全再生（即 有尾两栖动物）。此外，培养成肌细胞有助于理解再生过程、成肌程序的重演及其间的差异。为此，我们详细描述了一种稳健且高效的实验方案（及其变体），用于分离和维持肌肉前体细胞（MPCs）及其后代——成肌细胞和未成熟肌管——在细胞培养中的生长，以此作为研究从较基础的脊椎动物开始成肌程序演化的平台。充分利用斑马鱼（zebrafish）作为模式生物的优势，Danio rerio），我们报道了该方案在鲤科支系小型鱼类中的应用 Danioninae同时，本方案可用于通过分离墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）甚至实验室啮齿类动物。该方案现已被广泛用于多种鱼类物种的肌生成研究，包括虹鳟、鲑鱼和海鲷。1-4.
引言
通过在原代小鼠细胞中重现这一过程，人们对哺乳动物肌生成已有相当深入的理解Mus musculus) 成肌细胞培养物和广泛研究的小鼠来源细胞系 C2C125从20世纪50年代开始6这些培养技术极大地推动了对小鼠成肌程序的理解，并进一步促进了对其他脊椎动物肌生成过程的认识。此外，单根肌纤维外植技术也增强了我们对卫星细胞与周围肌纤维之间相互作用的理解。7-9细胞培养因其从祖细胞到分化细胞的周期较短，特别适用于肌生成研究10，RNAi转染的相对简便性11-14，转基因15,16 过表达研究14,17,18 , 体外 扩增，随后进行 体内 移植18-20以及跨物种的成肌前体细胞及其调控因子的比较21,22尽管已有文献描述了由于培养体系的人工环境所导致的差异5,23 ，这些 体外 在哺乳动物中，这些系统已被证明对于解析由单核增殖性前体细胞（即肌卫星细胞，MSCs）形成多核、终末分化的肌纤维的复杂程序至关重要。
课堂之外 哺乳纲然而，控制肌生成的机制在不同物种间的保守性与/或差异性仍不清楚，这主要归因于培养来自不同分类群的肌源性前体细胞（MPCs）和成肌细胞的困难。事实上，目前仅在三种....
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方案
伦理声明：本文所述涉及脊椎动物的所有实验均事先获得阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物照护与使用委员会的批准，并符合美国卫生与公共服务部下属国立卫生研究院实验室动物福利办公室所制定的指南。
1. 培养前准备
- 按如下方法制备基础培养基：在 DMEM（13.48 g/L；2 L 中含 26.96 g）中加入 9 mM NaHCO3（每 2 L 含 1.51 g）和 20 mM HEPES（每 2 L 含 9.53 g）。
- 测定 pH 值，并用 HCl 或 NaOH 调整至 7.40。
- 测定渗透压，并用 NaCl 调整至约 300 mOsm（如需要）。
- 使用两个 1 L 真空过滤灭菌系统进行过滤灭菌，置于 4 °C 避光保存，可保存 2–3 个月。
注：完整的试剂、工具、耗材和设备信息请参见表 1和表 2。
- 通过将 5 mg γ-射线照射的多聚-L-赖氨酸（> 300,000 mw）溶解于 50 ml 超纯无菌水中，制备多聚-L-赖氨酸处理的培养板。室温下轻轻颠倒混匀 10 分钟，确保赖氨酸聚合物完全溶解。
- 根据培养板类型（参见表 3），将所需量的多聚-L-....
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结果
接种后24小时，应可见成肌前体细胞（MPCs）已贴附于层粘连蛋白基质上（见图1a和图1d）。接种后，细胞（MPCs）呈现纺锤形，这是该细胞类型的典型特征（图1），且表达MyoD1（图2）。在Danio属物种中，MPCs显得更为致密，其双极突起较Oncorhynchus和Salmo属物种的MPCs更小。然而，在培养四天后，所检测的所有鱼类物种的MPCs均呈现出相似的形态，并明显表现出成肌细胞的特征（图1b和图1e）。应移除完全培养基，并用洗涤液对MPCs洗涤两次。成纤维细胞可能污染成肌细胞培养物，其星形形态（与成肌细胞的纺锤形相对）可将其与MPCs/成肌细胞轻易区分。对培养板进行洗涤可显著提高此类成纤维细胞的去除效果。
在本文所描述的物种中（见表7），每日更换培养基可获得最佳结果。在添加新鲜完全培.......
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讨论
无论在何种物种中，肌源性程序均可通过以下方法最简便地研究 体外 系统。事实上，在分离后，鱼类的成肌前体细胞（MPCs）或哺乳动物的肌卫星细胞（MSCs）会迅速进入这一高度调控的过程，该过程涉及成肌细胞的增殖、细胞周期退出和终末分化，以及这些成肌细胞融合形成新生肌管。目前普遍缺乏可用于鱼类物种的转基因基因报告品系（斑马鱼可能除外）67 和虹鳟鱼69限制体内 MPC/MSC 激活、增殖和分化的研究，以及因此产生的 体外 此处介绍的系统是鱼类物种研究的一个理想平台。
无论何种物种，MPC/MSCs 的成功培养都高度依赖于以下三点：a）严格保持无菌操作；b）对骨骼肌组织进行充分的机械解离；c）优化酶消化条件。在肌肉组织分离的初始步骤中，必须格外注意在不造成污染的前提下获取足够量的组织。至关重要的是，鱼类（或其他任何实验动物）必须使用 70% 乙醇进行充分消毒，并保证足够的消毒时间。在我们的操作经验中，30 秒效果最佳；时间过短可能导致污染，而时间过长则可能破坏组织完整性并降低细胞活力。乙醇具有.......
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致谢
作者谨向 Josep Planas 博士和 Juan Castillo 博士致以诚挚感谢，感谢他们在将本培养方案开发并应用于小型鱼类和两栖动物方面所提供的专业指导。同时感谢众多为从大量鱼类（包括多个物种和个体数量）中进行肌肉组织解剖与解离工作而不懈协助的人员，包括 Matthew Charging、Delci Christensen、Zachary Fowler、Brooke Franzen、Nathan Froehlich、Kira Marshall、Ben Meyer、Ethan Remily 和 Sinibaldo Romero。本研究得到了阿拉巴马大学伯明翰分校（UAB）生物学系启动资金、美国国立卫生研究院（NIH）资助号 #2P20 RR015566（蛋白酶研究中心）、NIH NIAMS 资助号 #R03AR055350 以及北达科他州立大学（NDSU）Advance FORWARD 美国国家科学基金会（NSF）资助号 HRD-0811239（授予 PRB）的支持。此外，研究还获得了 UAB 营养与肥胖研究中心资助号 P30DK056336（NIH NIDDK）的资助。本研究内容仅由作者负责，不一定代表 NIH 的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 表1. 详细试剂信息 | |||
| 试剂 | 公司（首选 vs. 替代） | 目录号（首选 vs. 替代） | 每培养物用量 |
| γ-射线辐照的聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich (MP Biomedicals) | P5899 (ICN19454405) | 5 mg |
| DMEM（高葡萄糖） | Sigma-Aldrich (cellgro) | MT-50-003-PB (D7777) | 2 L |
| 层粘连蛋白 | BD Biosciences (Sigma-Aldrich) | CB-40232 (L2020) | 1 mg |
| 碳酸氢钠 (NaHCO3) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP328-500 (S5761) | 1.51 g |
| HEPES (C8H18N2O4S) | Fisher Scientific (Sigma-Aldrich) | BP310-1 (H6147) | 9.53 g |
| 抗生素/抗真菌剂 | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SV3007901 (A5955) | 17–20 mL |
| 硫酸庆大霉素 | Lonza (Sigma-Aldrich) | BW17-519Z (G1397) | 2–3 mL |
| 供体马血清 | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007403 (H1270) | 75 mL |
| 胎牛血清 | Thermo Scientific (Sigma-Aldrich) | SH3007103 (F2442) | 25 mL |
| 胶原酶（IV型） | Worthington (Sigma-Aldrich) | LS004189 (C9891) | 0.44 g |
| 胰蛋白酶（来自胰腺） | MP Biomedicals (Sigma-Aldrich) | ICN15357125 (T5266) | 1 g |
| 表2. 耗材、工具与设备 | |||
| 耗材 | 工具 | 设备 | |
| 细胞培养板 | 镊子（粗齿） | 移液器 | |
| 无菌50 mL锥形管 | 镊子（细齿） | pH计 | |
| 实验室胶带 | 手术刀柄 | 低温培养箱（Echotherm） | |
| 0.2 μm 真空过滤灭菌系统 | 手术刀片（#10, #11） | 超净工作台 | |
| 防水高压灭菌纸 | 手术剪刀 | 真空抽滤装置 | |
| 移液管 | 玻璃培养皿 | 微渗透压计 | |
| 12–16 G 带鲁尔锁接头的套管针 | |||
| 表3. 细胞培养板包被的优化体积 | |||
| 板规格 | 每孔面积（cm²） | 聚-L-赖氨酸* | 层粘连蛋白** |
| 6孔板 | 9.5 | 1.6 mL | 1 |
| 24孔板 | 1.9 | 0.32 | 0.2 |
| 48孔板 | 0.95 | 0.16 | 0.1 |
| 96孔板 | 0.32 | 0.06 | 0.03 |
| * 浓度为0.1 mg/mL | ** 浓度为0.020 mg/mL | ||
| 表4. 分离、解离和培养用培养基 | |||
| 试剂 | 分离 | 洗涤 | 解离 |
| 基础培养基 | 419.25 mL | 395.40 mL | 297.00 mL |
| 硫酸庆大霉素** | 0.75 mL | 0.60 mL | – |
| 供体马血清 | 75.00 mL | – | – |
| 胎牛血清*** | – | – | – |
| * PSF：青霉素/链霉素/两性霉素B混合液（100倍浓缩）；** 浓度为50 mg/mL；*** 经鉴定 | |||
| 表5. 推荐稀释比例与接种体积 | |||
| 板规格 | 每孔面积（cm²） | 稀释比例 | 接种体积 |
| 6孔板 | 9.5 | 1.5–2.0×10⁶ 个细胞/mL | 1 mL |
| 24孔板 | 1.9 | 1.5–2.0×10⁶ 个细胞/mL | 250 μL |
| 48孔板 | 0.95 | 1.5–2.0×10⁶ 个细胞/mL | 150 μL |
| 96孔板 | 0.32 | 1.5–2.0×10⁶ 个细胞/mL | 50–100 μL |
| 表6. 每克组织平均细胞数 | |||
| 物种 | 每克组织平均细胞数 | ||
| Danio rerio | 6,400,000 | ||
| Danio dangila | 1,783,000 | ||
| Devario aequipinnatus | 1,797,000 | ||
| Oncorhynchus mykiss | 66,800 | ||
| 表7. 推荐培养温度 | |||
| 物种 | 温度 | ||
| Danio/Devario spp. | 26–28 °C | ||
| Oncorhynchus/Salmo spp. | 10*–18 °C | ||
| Ambystoma mexicanum | 18°C | ||
| * 较低温度支持较低的增殖速率。 |
参考文献
- Rescan, P. Y., Gauvry, L., Paboeuf, G. A gene with homology to myogenin is expressed in developing myotomal musculature of the rainbow trout and in vitro during the conversion of myosatellite cells to myotubes. FEBS Letters. 362 (1), 89-92 (1995).
- Castillo, J., Codina, M., Martinez, M. L., Navarro, I., Gutierrez, J.
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