电生理记录 果蝇 唇瓣味觉感受器

摘要

本方案描述了对黑腹果蝇（Drosophila）唇瓣味觉神经元动作电位反应进行的细胞外记录。

摘要

利用电生理技术可以深入研究昆虫的外周味觉反应。本文所述方法可使研究人员直接且定量地测量昆虫对味觉刺激的响应，从而反映昆虫神经系统从环境中味觉刺激所接收到的感觉输入。本实验方案详细阐述了实施该技术的全部关键步骤。文中明确了电生理记录装置组装过程中的关键环节，例如必要设备的选择以及适宜记录环境的设置。我们还介绍了如何制备合适的参考电极和记录电极，以及味觉刺激物溶液，以完成记录前的准备工作。我们详细描述了昆虫样本的制备方法，包括将玻璃参考电极插入果蝇体内以固定其喙部的操作步骤。文中展示了味觉神经元在受到糖类和苦味化合物刺激后所产生的电信号轨迹。该实验方案的部分操作具有较高的技术难度，因此我们提供了对一些常见技术问题的详尽说明，例如系统中信号缺失或噪声过强等问题，并提出了可能的解决方案。该技术存在一定的局限性，例如难以施加时间上复杂的刺激、无法在刺激呈现前立即观察到背景放电活动，或难以方便地使用水不溶性味觉化合物。尽管如此，该技术（包括本方案中提及的一些小的变体）仍是记录黑腹果蝇（Drosophila）神经元对味觉化合物响应的标准且广泛接受的实验方法。

引言

味觉使昆虫能够检测大量可溶性化学物质，在识别营养物质或拒绝有害或有毒物质方面发挥着重要作用。味觉还被认为通过信息素的检测在配偶选择中发挥作用^1-5。这些重要而多样的功能使得昆虫味觉系统成为研究感觉系统如何将环境线索转化为相应行为输出的一个极具吸引力的研究对象。

基本单位 黑腹果蝇 味觉系统的味觉毛或感觉器。分子通过感觉器顶端的小孔进入感觉器^2,6. 感觉器分布于唇瓣、足、翅缘和咽部⁶. 唇瓣上的感器数量和位置具有固定模式。根据长度，感器可分为三种形态类型：长型（L）、中等型（I）和短型（S）感器^7,8每个感受器含有两个（I型）或四个（L型和S型）味觉感受神经元（GRNs）⁹不同的味觉受体神经元（GRNs）对不同类别的味觉刺激产生反应：苦味、糖、盐和渗透压^7,10 并表达不同亚群的味觉受体^8,11-13只有I型和S型感器含有对苦味有反应的味觉感受神经元^8,10味觉受体神经元（GRNs）投射至食道下神经节（SOG），其被味觉分子激活的信号被传递至更高级的中枢神经系统进行解码，从而引发行为反应。⁶神经元数量相对较少，且易于进行分子和行为学分析，这使得 黑腹果蝇 味觉系统是研究一般性味觉系统的理想模型。通过基因突变或GAL4-UAS表达系统对该....

方案

以下方案符合耶鲁大学的所有动物护理指南。

1. 试剂与仪器准备

1. 记录设备设置（图1A）。
   1. 选择一个用于搭建实验装置的房间，该房间应避免温度和湿度的大幅波动，并远离冰箱和离心机等电噪声和机械噪声源。
      
      图1. （A）记录装置的总体布局。体视显微镜（a）安装在防震平台（b）上。 参比电极夹（c）通过显微操作器安装在与头级（d）相对的平台上。一根输送加湿气流至果蝇标本的出口塑料管（e）也安装在平台上。头级连接至放大器（f），放大器连接至数字采集系统（DAS）（g），DAS再连接至计算机（h）。（B）电极与出口管的配置：左侧为参比电极，右侧为记录电极，气流出口管朝向果蝇标本。 ....

结果

图5A 显示了L型感器对糖类物质蔗糖的反应。同一感器对苦味化合物小檗碱无反应。图5B 显示，含有对苦味敏感神经元的I型感器在响应小檗碱时产生较大振幅的动作电位，而在响应蔗糖时产生较小振幅的动作电位。L型感器对溶剂对照TCC仅有微弱的基础反应，而I型感器对TCC几乎无反应（图5）。有关唇瓣味觉受体神经元（GRNs）对盐和水反应的更多信息，请参见Hiroi¹⁰。

讨论

由于形态和解剖结构的差异，唇瓣上的感器在记录信号的难易程度上有所不同。有时某个感器对任何味觉刺激物均无反应，即使该刺激物已知可引发阳性反应。这种情况的发生频率因感器类型而异。L型感器的反应通常最为稳定，且因其长度较长而相对容易接触。一般来说，S型感器的反应也较稳定，但由于其较短的长度以及在唇瓣上的位置，实现良好接触较为困难。I型感器的接触难易程度取决于制备样本的角度，可能较易接近，但其无反应的情况更为常见。在任意一只果蝇的制备样本中，I型感器无反应的比例可能高于L型或S型感器。遗传背景也会影响味觉反应的稳定性。例如，某些转基因果蝇的反应稳定性可能低于野生型，推测原因是转基因影响了果蝇的整体健康状况。我们观察到，w^-突变型果蝇尤其难以进行有效记录。

一个常见的技术问题是信号缺失，即 未观察到任何峰电位（图6A）。首先，有时某个特定的感器可能无反应，而同一只果蝇上属于同一类别的其他感器却可能有反应。其次，记录电极或参考电极中可能存在气泡。如果怀疑是记录电极的问题，可通过简单地取出并重新填充玻璃电极，轻轻.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
体视变焦显微镜	Olympus	SZX12 DFPLFL1.6x PF 目镜：WHN10x-H/22	配备长工作距离台式支架，可实现约 150 倍放大
防震台	Kinetic Systems	BenchMate2210
微操纵器	Narishige	NMN-21
磁力支架	ENCO	型号 #625-0930
参比电极夹	Harvard Apparatus	ESP/W-F10N	可安装在 5 ml 移液管上以扩展操作范围
银丝	World Precision Instruments	AGW1510	直径 0.3–0.5 mm
铁架台			通用型
出液塑料管			通用型，直径 1 cm
柔性塑料管	Nalgene	8000-0060	VI 级，内径 1/4 英寸
500 ml 锥形瓶			通用型，带侧臂
水族泵	Aquatic Gardens	Airpump 2000
光纤光源	Dolan-Jenner Industries	Fiber-Lite 2100
白色卡片/纸	Whatman	1001-110
数字采集系统	Syntech	IDAC-4	替代方案：National Instruments NI-6251
前置放大器	Syntech	DTP-1	味觉探针
味觉探针放大器	Syntech	DTP-1	味觉探针
鳄鱼夹	Grainger	1XWN7	任何品牌均可
绝缘电线			通用型
金连接针	World Precision Instruments	5482
个人计算机	Dell	Vostro	需确认与数字采集系统及软件的兼容性
采集软件	Syntech	Autospike	Autospike 适用于 IDAC-4；也可使用 LabView 配合 NI-6251
铝箔和/或法拉第笼			用于电磁噪声屏蔽
硼硅酸盐玻璃毛细管	World Precision Instruments	1B100F-4
拉针仪	Sutter Instrument Company	Model P-87 Flaming/Brown 微量移液管拉针仪
Beadle 和 Ephrussi 林格液			参见实验方案部分的配方
三氯柠檬酸，65%	Sigma	T0252-100G
体视显微镜	Olympus	VMZ 1x–4x	可实现 10–40 倍放大
冰桶			通用型
p200 移液器吸头			通用型
脊髓穿刺针	Terumo	SN*2590
1 ml 注射器	Beckton-Dickenson	301025
果蝇吸取器			由 P1000 移液器吸头、柔性塑料管和网筛组装而成
模型黏土			通用型
镊子	Fine Science Tools By Dumont	11252-00	#5SF（超细尖头）
10 ml 注射器	Beckton-Dickinson	301029
塑料管	Tygon	R-3603