敏感，大规模定量代谢组学的策略

摘要

代谢产物分析一直是宝贵的资产在代谢在健康和疾病的研究。利用正常阶段的液相色谱和高分辨率质谱与极性切换和快速的工作周期，我们描述了一个协议分析生物材料，具有灵敏度高，准确度和分辨率的极性代谢成分。

摘要

代谢产物分析一直是宝贵的资产在代谢在健康和疾病的研究。然而，当前的平台上有不同的限制因素，如劳动密集型样品制剂，低检测限，扫描速度很慢，对于每种代谢物密集的方法优化，以及无法积极地同时测量和在单一实验中带负电荷的离子。因此，一种新的代谢协议可以促进代谢组学研究。基于酰胺的亲水色谱法使极性代谢物的分析，而无需任何化学衍生。高分辨质谱使用Q-Exactive（QE-MS）有所改善离子光学系统，提高了扫描速度（256毫秒的分辨率70,000），并具有进行正/负切换的能力。使用冷甲醇提取策略，并与耦合QE-MS酰胺色谱柱能够稳健检测168有针对性的极性代谢物的附加功能和成千上万的同时进行。 DAT的处理是用市售的软件在一个高度有效的方法，并从质谱图中提取未知功能可以在数据库中进行查询。

引言

代谢组学，定义为同时测量多个代谢物的试验，一直是激烈感兴趣的领域。代谢组学提供了分子生理学的一个直接读出，并提供了见解发育和疾病如癌症^1-4。核磁共振（NMR）和气相色谱-质谱（GC-MS）是最常用的工具^5-9之间。 NMR，尤其是已自重同位素标记的化合物，如¹³ C标记的代谢物用于通量的实验中，都NMR-活性^10,11。然而，这种策略要求比较高的样品纯度和大样本量，这限制了它的应用代谢组学。同时，从核磁共振收集的数据密集型需求分析和复杂的NMR谱复合赋值是困难的。 GC-MS已广泛用于极性代谢物和脂质的研究，但它需要的挥发性化合物 -ds和因此往往衍生的代谢物，这有时会涉及复杂的化学反应，可以是耗时的，并引入实验噪音。

液相色谱（LC），耦合到三重四极杆质谱法使用第一个四极杆选择的完整母离子，然后将其分段中的第二四极，而第三个四极杆被用来选择特征的片段或子离子。该方法中，其中记录了从母体离子，以特定的子离子的过渡，被称为多反应监测（MRM）。 MRM是为小分子和蛋白质定量^12-15,21非常敏感，特异，可靠的方法。然而，MRM也有其局限性。为了实现高特异性的MRM方法需要为每个代谢物兴建。该方法包括确定一个特定的片段和相应的最佳碰撞能量，这就要求PROPE的预先知识感兴趣的代谢物，如化学结构信息的rties。因此，与同一片段的中性丢失一些例外，它是不可能的，以确定未知代谢物与该方法。

在最近几年，高分辨率质谱（HRMS）的仪器已被释放，如LTQ-轨道阱和Exactive系列，QuanTof技术，和的TripleTOF 5600 ^16-18,22。 HRMS可以提供​​质量到几个ppm的误差内充完好离子的比（m / z）表示。因此，通过检测所有的前体离子（ 即全扫描模式）操作的HRMS的仪器可以从精确质量和分析物所产生的元素组成直接获得的结构信息，并且该信息可用于确定潜在的代谢物。确实，可以用一个精确质量来获得关于一种化合物的所有信息，至多结构异构体的水平。此外，全扫描方法不需要的代谢产物以前的知识，也不需要方法的优化。此外，由于m / z为落入扫描范围的所有离子进行分析，HRMS具有几乎无限的容量可量化在单次运行相比，MRM方法代谢物的数量而言。人力资源管理系统也相当于定量容量的三重四极杆MRM由于短的工作周期造成的，可以在一个完整的MS将扫描获得的数据点的数量相媲美。因此，人力资源管理系统提供了定量的代谢组学的另一种方法。近日，人力资源管理系统的改进版本称为Q-Exactive质谱（QE-MS）可以足够快的周期正，负模式在一个单一的方法，扩大了检测范围¹⁹之间的切换下操作。在这里，我们将介绍使用的QE-MS代谢组学我们的策略。

方案

1，准备LC-MS试剂，建立一个色谱法，并建立仪器操作规程

1. 液相色谱溶剂的制备
   1. 制备500mL的流动相。 A为20mM的醋酸铵和15mM的氢氧化铵的3％乙腈/水，最终pH为9.0;和B为100％乙腈。
   2. 松散帽的瓶子，把它放在水浴超声仪，超声10分钟，无需额外加热。 （此步骤是为了确保所有的铵盐的完全溶解和不存在残留气泡。）
   3. 转让250毫升溶剂的250毫升玻璃瓶中用于LC-MS的使用，并保持剩余部分在4℃下的
2. 准备低质量范围的校准解决方案。使用定制的低质量范围的校准混合物代谢组学的应用，以确保准确的群众在低分子量的检测是非常重要的。
   1. 称取5毫克两种SODI的恩氟乙酸和高香草酸和溶解它们到5ml的水中，使其为1毫克/毫升的最终浓度。二嗪磷溶解在甲醇中，制成10毫克/毫升的最终浓度。
   2. 为了准备加入1ml负低质量校准溶液，混匀960毫升用20毫升钠fluoroaceate和高香草酸溶液的热负校准解决方案。至1ml的正向低质量校准溶液，混匀990毫升热正校准溶液和10ml二嗪农的解决方案。 （低质量校准溶液应保存在4℃，将新鲜制备的每2个月。）
3. QE-MS的校准在低质量范围
   1. 之前执行低质量范围内的校准，进行在根据制造商的指示肯定和否定模式标准的质量校准（M / Z，150-2,000）。
   2. 一旦常规质量校正通过，调整扫描范围为60-900 M / Z在仪器控制面板和25伏特为阳性模式和35伏特为负模式源的CID被应用。 （这将使咖啡因碎片离子和硫酸根离子的健壮信号，这里的扫描范围是固定的，因为最后的M / Z应不低于起始为m / z 15倍放大）
   3. 一旦离子源是稳定的，则执行自定义校准。注意:一个稳定的源被定义为总离子电流的变化在正模式的小于10％，并且在负离子模式下小于15％。定制的校准离子和相应的m / z的列于表1。
4. 建立了LC-MS仪器的极性代谢物的分析。 LC耦合到QE-MS进行代谢物的分离和检测。
   1. 装备QE-MS具有加热电喷雾电离探头（H-ESI）。设置相关调谐参数的探头所列:加热器温度120℃;鞘气，30;辅助气体，10;扫气，3;喷涂电压，3.6千伏积极模式和2.5千伏负模式。于55设置在毛细管温度为320℃，S-透镜。
   2. 建立一个完整的扫描方法如下:全扫描范围:60〜900（M / Z）;分辨率:70,000;最大注射时间:200毫秒，约50毫秒的典型注射倍;自动增益控制（AGC）:3,000,000离子。这些设置导致大约550毫秒来进行扫描的正面和负面的模式占空比。
   3. 建立色谱方法。复方分离在室温^13,15聘请酰胺柱（100×2.1 mm内径，3.5毫米）。流动相A为如上所述，并且流动相B为乙腈。使用线性梯度如下:0分钟，85％B; 1.5分钟，85％B，5.5分钟，35％B; 10分钟，35％B，10.5分钟，35％B，14.5分钟，35％B，15分钟，85％B和20分钟，85％B的流速为0.15毫升/分钟从0至10分钟和15至20分钟，和0.3毫升/分钟从10.5到14.5分钟。

2，镨代谢物样品的eparation

1. 准备提取溶剂。混合40ml甲醇（LC-MS）和10毫升的水（LC-MS级）在50毫升管，并将其保存在-80℃冰箱在使用前至少1小时。注意:此过程与下面的步骤可以修改为生物组织和流体样品的提取。
   1. 培养大肠癌细胞HCT 8细胞在310厘米菜肴或6孔板具有完全生长培养基，RPMI 1640补充有10％热灭活胎牛血清和10万个单位/ L的青霉素和100mg / L的链霉素。
   2. 当细胞达到80％汇合，迅速 ​​取出介质，并将其放置在干冰^13,15上方的盘或板。加入1 ml提取溶剂立即（80％甲醇/水），以及所述板转移到-80℃的冰箱中。为10cm的培养皿中，添加3毫升萃取溶剂的每个孔中。 （尝试移除介质，尽可能避免因从中残留盐的离子抑制效应。）
   3. 离开该板15分钟。从冰箱中取出，并刮去细胞到在干冰上的溶剂。将溶液转移到1.7毫升的Eppendorf管中，并以20,000×g离心速度离心在4℃下10分钟。 （准备细胞代谢物从三个不同的菜肴，使三个重复样品。保持两管的目的是有一个作为备份。）
   4. 将上清转移到两个新的Eppendorf管中，并擦干他们在一个速度真空。这大约需要3-6小时，取决于所使用的速度真空。 （样品也可以一夜之间在氮气干燥。）
   5. 后在-80℃下冷冻各试样的干燥，储存管中。准备就绪后，重新组建一个样品20毫升水（LC-MS级），注射5毫升LC-QE-MS进行分析。

采样序列的3。设置

1. 一旦校准已妥善开展了对QE-MS，平衡液相色谱柱为5分钟，85％的流量速度为0.15毫升/分钟，这是LC梯度的起始条件。
2. 以随机顺序设置采样序列。注意:在这种方式，分配由LC-MS引入到每个样品的波动，并确保不同的样品之间更准确的比较。每6个样品中，添加的洗涤运行，其共享相同的质谱法，除LC梯度为95％A和10分钟，然后用5分钟柱平衡在85％A为0.15毫升/分钟的流速。添加空白样品（100％水）每次清洗后运行，以评估该系统的背景和结转的水平。
3. 保存序列，一旦液晶栏显示稳定的压力，约400磅，启动顺序运行。如果没有其他的样品这个序列后运行，然后整理后添加的序列，其中有0毫升/分钟的渐变结束的流速月底停止运行，并选择"待机"的序列。
4. 重新运行相同的样本集校准后12小时。 （这是我秒校准后，以评估质量误差的波动。）

4。后分析仪器清洗和维护

1. 在序列的末尾，以0.2毫升/分钟为2小时的流速用95％A洗柱，并在必要时，洗涤前的反向柱。
2. 除去液相色谱柱，并直接通过一个联合的LC连接到离子源。准备清洗溶剂，水/甲醇/甲酸（体积:体积:V，90:10:0.2），待机模式设置MS和洗涤LC-MS系统以0.1的流量毫升/分钟1小时以除去残留沉淀的盐或其它杂质。降低流速，如果有太多的系统压力。
3. 在50℃下将毛细管温度，并取下离子笼。小心取出离子吹扫锥和离子传输管后的毛细管的温度下降到50℃。使用粗网格，诸如砂纸，除去留下的离子吹扫锥的表面上的杂质。
4. 将离子转移管放入含有10ml 90％水/甲醇和0.1％甲酸15毫升的Falcon管中。超声处理管在水浴超声器20分钟后，滗出溶剂内，它用10毫升纯甲醇替换和超声仪处理20分钟。 （如果需要，超声处理可以在40℃或更高的温度，以达到更好的清洁效果完成。）

LC-MS数据的5。分析

1. 为确保采样序列运行平稳，完成序列中的前两个样品后，检查未知代谢物峰。使用csv文件列出的代谢物名称，中性化学分子式和检测模式（无论是正面的还是负面的），作为输入文件和输出文件包含提取的高峰，在ppm级的质量误差。如果峰形异常或质量误差是关闭的超过5ppm，则需要在序列的其余部分要被停止和故障诊断需要做的事情。
2. 选择"峰对齐的方法和帧提取"的市售软件。从LC-MS和他们组原始数据。挑样品中的运行顺序为峰对齐色谱法，参照样品的中间。上传一个框架种子包括已知的代谢产物为目标代谢产物分析收集到的数据和相应的帧的种子。
3. 在正和负模式分别执行数据分析。使用默认设置其他参数。关闭数据库的搜索功能和运行工作流。导出处理后的数据为包含每一帧的峰面积的Excel工作表。帧的第一个集合对应于在目标列表中的代谢物。注意:对于靶向代谢物的分析，基于以前的研究^13,15得到的代谢信息。
4. 对于一个不相关的代谢产物分析，选择"成分提取"的方法。加载背景扣除空白样品。设置峰值强度阈值的T 10 ^5，10 ppm的和信号的3信噪比M / Z宽度。
5. 对未知化合物鉴定人使用代谢组数据库。使用简历过滤器重复样品中去除大简历的组件。手动通过每个组件，并挑选那些具有良好定义的峰值或在不同类型的样本数据库搜索比较大的差异。与点击导出数据的数据库。 （如果峰值比对分数太低峰值对准可被绕过。）

结果

代谢组数据的精度在很大程度上取决于对LC-QE-MS仪器的性能。评估状况良好仪器是否正在运行，并且应用该方法是否是正确的，几个已知代谢物的LC峰被从总离子色谱图（TIC）萃取， 如图1。极性代谢物，包括氨基酸，糖酵解中间体，三氯乙酸中间体，核苷酸，维生素，ATP，NADP ⁺等有很好的保留在目前的LC条件下的酰胺列的列和良好的峰形。同时，大容量误差测试低质量校准后24小时内完成，如示于图2。6种不同浓度一式三份样品的被校准后运行两次，并在整个时间范围几乎覆盖了24小时。质量错误是由检测到的M / Z相比较，以靶向代谢物的理论M / Z评估。在这里，有针对性的代谢产物具有M / Z从74（甘氨酸），以744（NADP ^+）。这里，Y轴表示代谢物的内一定质量的误差范围的累计百分比。蓝色曲线显示了结果从0-12小时，而红色的曲线示出了从12-24小时收集的数据， 图2清楚地表明，超过90％的代谢物是在5 ppm的质量误差，表示低质量这里开发的范围校准方法足以维持5 ppm的质量误差低质量范围的检测。...

讨论

在使用这种协议的细胞成功代谢物图谱中最关键的步骤是:1）控制所述生长培养基中并小心萃取的细胞; 2）调整液相色谱方法基于MS方法设置，以确保有足够的（通常至少为10）跨数据进行定量峰点; 3）做一个低质量运行校准样品前; 4）注入不超过5毫升到避免保留时间偏移和峰展宽引起的水; 5）准备和运行样品在同一批次，以减少批效果比较。

标准（ 表1）选择这里的低质量范围的校准是可以互换的。用M / Z落入质量扫描范围内的任何已知的化合物，性能良好，在H-ESI源，并且可溶于水，甲醇或乙腈是合理的候选校准标准。强烈建议来存储所有的校准解决方案吨4℃下，以稳定的咖啡因，同时尽量减少甲醇或乙腈的蒸发在校准溶液，使校准性能可以更具有可重复性。相比于常规的质量范围，M / Z为150至2000，低质量范围内的校准需要更频繁地每两天进行，至少一次。

这个工作流程，从提取溶剂，溶剂重组，LC流动相，低质量范围校准和MS扫描范围进行了优化，测量极性代谢物。这包括氨基酸，乙酰基氨基酸，糖酵解途径的中间体，核苷，TCA循...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
正校准混合物	Thermo Scientific	#88323	它是光敏感的。储存在 4 °C
阴性校准混合物	Thermo Scientific	#88324	储存在 4 °C
Diazinon	Sant Cruz Biotechnology	#C0413	它会刺激眼睛，所以在引擎盖里工作。储存在 4 °C
H-ESI 针插入	物 Fisher Scientific	#1303200	如果堵塞，可以用 5% 甲酸/水（去除橡胶圈）替换或清洁。
Xbridge 酰胺色谱柱	Waters	#186004860	Guard 色谱柱来延长色谱柱使用寿命。