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方法文章

近胞体生物胞素标记法用于研究单个皮层神经元的结构-功能关系

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DOI：

10.3791/51359

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2014年2月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Integrative Neurophysiology, Center for Neurogenomics and Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam, VU University Amsterdam

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

为了理解神经元网络的结构，必须对单个神经元进行功能和形态学表征。本文展示了贴附式生物胞素标记技术，该方法可在细胞外构型下进行电生理记录，同时仍能对神经元进行细胞内标记以 术后 临时的 树突和轴突结构的重建

摘要

大脑皮层具有多层结构以及多种不同类型的细胞，这些细胞共同构成网络，负责多种高级认知功能，包括决策、感觉引导的行为和记忆等。为了理解如此复杂的神经网络如何执行这些任务，一个关键步骤是在动物执行相关认知任务时，确定网络中各类细胞的功能（或电活动）。此外，同样重要的是确定该网络的解剖结构以及单个神经元的形态架构，以便对皮层网络进行逆向工程分析。当前可用的技术突破使得能够在清醒且行为活跃的动物体内记录细胞活动，并具备在实验后post hoc识别所记录神经元的宝贵优势。本文中，我们演示了紧贴细胞膜的生物胞素标记技术，该技术采用传统的膜片钳电极，在细胞外（或松散贴附）构型下记录动作电位放电。紧贴细胞膜记录构型相对稳定，适用于多种行为状态，包括麻醉、镇静、清醒固定头部，甚至自由活动的动物。因此，该方法可将动物行为过程中特定细胞类型的动作电位放电与单个神经元的重建，乃至整个皮层微环路的重建联系起来。在本视频论文中，我们展示了在尿烷麻醉的大鼠中，如何利用紧贴细胞膜构型对单个神经元进行生物胞素标记，以实现post hoc识别和形态学重建。

引言

神经元网络由多种细胞类型组成，这些细胞类型具有高度特异的形态学和生理学特性1-7。因此，不同类型的细胞在网络中执行专门的功能（例如参见 Gentet et al.8 和 Burgalossi et al.9）。目前我们才刚刚开始理解神经元网络中各类细胞的特异性功能，仍有许多未知有待探索。为此，许多实验室正在采用一些实验方法，以实现对已获取生理参数的同一神经元群体进行形态学特性的分析1,10-15。本文中，我们演示了紧贴膜外标记技术（juxtasomal labeling technique）16,17，该技术结合了使用传统膜片钳电极在细胞外（即非侵入性）构型下进行电生理记录，并通过生物胞素（biocytin）对所记录神经元进行电穿孔标记。该方法的主要优势在于其非侵入性，可确保在不改变（例如透析）细胞内成分的前提下记录单个神经元的动作电位放电。随后通过电穿孔，紧贴膜外记录法可在实验后（post hoc）实现细胞鉴定与形态重建，从而将功能（生理学）与结构（形态学）关联起来。通常，形态重建包括树突和轴突形态的重建，还可进一步扩展至树突棘和/或突触小结密度的量化分析，甚至可利用电子显微镜在纳米级分辨率下重建神经元形态。紧贴膜外记录技术可用于多种物种皮层各层或皮层下区域中不同类型细胞的体内（in vivo）记录，尽管大多数研究是在小啮齿类动物（如小鼠或大鼠）中应用该技术。我们的研究聚焦于大鼠初级躯体感觉皮层（S1）神经元的记录与标记，包括记录神经元的视觉识别18、树突形态重建并结合在标准化参考框架中的精确定位以逆向解析皮层网络结构4,19，以及轴突结构的精细重建，用以鉴定特定细胞类型的局部及长程投射靶区20。

与其它 体内 记录技术（如细胞内或全细胞记录）相比，紧贴细胞记录具有相对较高的稳定性，因此可应用于多种行为状态，包括麻醉状态21,22、镇静状态14、清醒固定头部状态23，甚至自由活动动物9。本文展示了在乌拉坦麻醉大鼠初级体感皮层（S1）中进行的紧贴细胞标记，但我们强调该技术可广泛适用于多种实验模型。

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方案

1. 动物准备

所有实验操作均依照荷兰法律进行，并经荷兰阿姆斯特丹自由大学当地伦理委员会评估后实施。

  1. 用异氟烷（2-3% 氧气混合）麻醉一只 Wistar 大鼠（P25-P45，♂/♀），随后通过腹腔注射乌拉坦（20% 溶于 0.9% NaCl，1.6-1.7 g/kg）。通过检测夹捏回缩反应、眼睑反射及须毛运动来评估麻醉深度。
  2. 若实验过程中动物未达到足够的麻醉深度或出现胡须抽动，可追加注射乌拉坦（剂量为初始剂量的10%）。
  3. 将麻醉后的动物置于装有加热垫的立体定位仪上，插入直肠温度探针，并通过加热垫将动物体温维持在37.5±0.5 °C。
  4. 将动物头部置于立体定位仪中，使用剪刀修剪头顶毛发，使皮肤可见。
  5. 在手术部位皮下注射 100 µl 1% 利多卡因（溶于 0.9% NaCl）进行局部麻醉，等待 3–5 分钟。沿尾侧至头侧方向切开覆盖颅骨表面的皮肤，并清除残留组织。
  6. 用0.9% NaCl和吸水棉签彻底清洁颅骨。
  7. 确定左半球目标区域的坐标（对于初级体感皮层（S1）：位于前囟后方2.5 mm，外侧5.5 mm）。使用外科皮肤标记笔在颅骨上标记该位置。
  8. 使用牙科钻头从目标区域轻轻刮除骨组织，直至骨质变透明且血管清晰可见。
  9. 使用手术刀（#11）在变薄的颅骨上切出一个0.5 mm × 0.5 mm的颅窗，注意避免损伤硬脑膜和血管。可选：使用外科皮肤标记笔标记颅窗边缘，以提高可视性。
  10. 在干燥的颅骨上涂抹一层薄薄的超级胶水，然后使用牙科水泥构建一个围堰即 记录室（recording chamber）封闭颅骨开窗区域。
  11. 将对侧的胡须修剪至距离毛囊恰好5 mm处。可选：用黑色睫毛膏标记修剪后的胡须。

2. 膜外记录与生物胞素标记

  1. 使用硼硅酸盐玻璃制备尖端内径约为 1 μm 的膜片电极，以获得电阻为 3–5 MΩ 的电极。注意：用于紧贴膜外记录（juxtasomal recording）的理想电极形态应具有逐渐变细的锥形、低锥角以及约 1 μm 的尖端（图 1）。
  2. 根据记录深度（相对于软脑膜表面），应调整记录电极的锥形部分尺寸。至关重要的是，电极进入脑组织时的锥径应小于 75 μm，以避免对记录区域造成机械损伤或应力。这表明，对于浅层皮层记录，需要长度为 300–500 μm、最大外径为 75 μm 的锥形部分（图 1A）；而对于相对较深的皮层层记录，则需要更长的锥形部分（1,500–1,800 μm），同样要求在距电极尖端 1,800 μm 处的最大外径不超过 75 μm。
  3. 用添加了 2% 生物胞素（biocytin）的正常大鼠任氏液（NRR）填充膜片电极（溶液和 试剂见 表 1），并将电极安装在固定于显微操作器上的前置放大器头段上。
  4. 将电极夹持器的角度设置为相对于矢状面 34°，以便特异性地靶向大鼠 S1 区的 D2 柱。
  5. 将头段连接至以桥式模式（i.e. 电流钳模式）工作的放大器。
  6. 将膜片电极移至颅骨开窗附近。用 0.9% NaCl 填充浴液，并通过施加正向电流方波脉冲（1 nA，200 毫秒开/关）测定电极电阻，其值应在 3–5 MΩ 之间。
  7. 建立 100–150 mbar 的正压，以 1 µm 步进方式推进膜片电极，同时施加正向电流方波脉冲（1 nA，200 毫秒开/关）。当电极接触硬脑膜时，监测电阻的显著变化。此时，将显微操作器的坐标设为“零”，以便进行精确的深度测量。
  8. 以 1 µm 步进方式继续推进，直至膜片电极穿透硬脑膜，表现为电极电阻突然下降。随后移除电极的保持压力。
  9. 以 1 µm 步进方式继续推进，搜索单个神经元信号。通过施加 200 毫秒开/关脉冲持续监测电极电阻。电阻升高通常提示接近单个神经元。继续推进电极，直至记录到幅度约为 2 mV 的正向动作电位（AP）波形（图 2A 和 2B）。
  10. 可选：记录神经元的自发放电模式，并通过例如使用压电装置将单根胡须向尾侧偏转 3.3°、持续 200 毫秒的方式，确定胡须诱发的放电活动18。
  11. 继续推进电极，直至电极电阻达到 25–35 MΩ，且动作电位幅度为 3–8 mV，以获得最佳的紧贴膜外填充条件。通过施加正向电流方波脉冲（1 nA，200 毫秒开/关）开始紧贴膜外填充。以 0.1 nA 为步长缓慢逐步增加电流，同时监测动作电位波形和频率（图 2A 和 2B）。
  12. 在方波脉冲的“开”相期间，若动作电位频率明显升高，则提示细胞膜已打开（图 2C）。填充过程中的动作电位波形表现为宽度增加、后超极化减弱（图 2C 和 2D）。其他参数包括噪声增加或出现轻微（1–5 mV）的负向直流偏移。
  13. 在填充过程中根据需要增加或减少电流（1 nA），以维持稳定的生物胞素灌注。当动作电位频率突然升高时，应降低或停止电流脉冲，以避免因细胞外离子（如钠离子）过度内流导致的细胞毒性。注意：每个神经元对电流注入的反应不同，因此紧贴膜外标记参数需根据具体的记录条件进行调整。
  14. 停止电流注入后密切监测信号变化。填充后的动作电位波形通常变宽，且后超极化显著减弱。等待神经元恢复，其标志是动作电位波形恢复至原始特性（i.e. 出现正常的后超极化，图 2）。
  15. 在神经元完全恢复后重复生物胞素填充过程，以增加细胞内生物胞素负荷，提高染色质量。
  16. 以 1 µm 步进方式回撤膜片电极，直至动作电位幅度下降，以减少对细胞的机械应力。回撤后至少等待 1 小时，使生物胞素在细胞内充分扩散，同时密切监测动物的体温和呼吸状况。

3. 灌注动物并取出大脑

  1. 准备好灌注装置，用0.9% NaCl冲洗并预充满管路。
  2. 将动物置于手术托盘上，并用标准标签胶带固定。确保麻醉深度足够；足部夹捏和眼睑反射应消失。
  3. 在肋骨下方稍偏腹侧处沿腹壁从中线向侧方做一5-6 cm的切口，沿后前方向切开，暴露胸骨。将胸骨向前牵拉，并小心分离肝脏与膈肌。
  4. 在膈肌上做一个小切口，剪开下部肋骨，沿腹腔全长继续切开，以暴露心脏。
  5. 去除心包膜。
  6. 将针头插入左心室，并在右心房做一切口。以约8 ml/min的速度灌注0.9% NaCl，直至肝脏完全褪色。
  7. 切换至4%多聚甲醛（PFA）灌注，直至前肢足部和下颌出现明显僵硬。
  8. 使用剪刀将大鼠断头。
  9. 去除颈部残留的肌肉组织，完全暴露颅骨。
  10. 将剪刀置于脑干背侧，沿矢状缝小心剪开颅骨，保持背侧位置。
  11. 用镊子从矢状缝两侧去除颅骨，暴露脑组织。小心去除硬脑膜，避免损伤。
  12. 将钝头 spatula 小心插入脑腹侧，轻柔取出脑组织。
  13. 将完整脑组织在4 °C条件下用PFA固定过夜，随后转移至0.05 M磷酸盐缓冲液（PB）中，4 °C保存。

4. 以切向切片法切取脑组织

  1. 将脑组织从 0.05 M PB 中取出，置于滤纸上，前端朝前。使用锋利的剃刀刀片沿冠状面切除小脑，并沿正中矢状面切开以分离大脑半球。
  2. 在切片固定平台上涂抹瞬间胶，将左半脑以其矢状面朝下固定，前端朝右。将固定平台以 45° 角固定在振动切片机上，并将脑组织浸入 0.05 M PB 溶液中。
  3. 将剃刀刀片固定在振动切片机上，确保刀片首次接触脑组织表面时位于半球前后平面的中点。连续切出 24 片厚度为 100 µm 的切片，并将其收集至含有 0.05 M PB 的 24 孔板中。

5. 组织学实验步骤

  1. 按照先前描述的方法24进行细胞色素氧化酶染色和辣根过氧化物酶-亲和素-生物素法的组织学操作步骤25。可选：使用荧光标记的亲和素/链霉亲和素-Alexa偶联物可视化生物胞素，从而可进一步实现与逆行或顺行示踪技术的双重染色。
  2. 用0.05 M PB缓冲液清洗切片，每次5分钟，共5次；并配制含3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）的溶液用于细胞色素氧化酶染色，以显示S1区第4层（L4）的桶状结构（溶液与试剂见表2）。将自软脑膜起第6至第12层的切片置于预热的溶液中，在37 °C下孵育30–45分钟。
  3. 用0.05 M PB缓冲液冲洗切片，每次5分钟，共6次；随后在室温下将所有切片置于含3% H2O2的0.05 M PB缓冲液中孵育20分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性。
  4. 用0.05 M PB缓冲液冲洗切片，每次10分钟，共5次；然后将切片置于ABC溶液中（溶液与试剂见表3），在4 °C下孵育过夜。
  5. 用0.05 M PB缓冲液冲洗切片，每次10分钟，共5次；并配制DAB溶液以显示含生物胞素的神经元（溶液与试剂见表4）。将切片置于过滤后的溶液中，在室温下孵育45–60分钟。
  6. 用0.05 M PB缓冲液冲洗切片，每次10分钟，共5次；将切片贴附于显微镜载玻片上，并用Mowiol封片（溶液与试剂见表5）。
  7. 使用光学显微镜评估标记质量。

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结果

单个神经元的三维结构的详细知识对于阐明神经网络的组织原则至关重要。本方法包含一个技术流程，可从体内制备样本中获得高质量的生物胞素标记，从而实现事后神经元分类以及对单个神经元树突和轴突结构的高分辨率详细重建。根据邻近标记的质量，神经元在不同位置被回收，其DAB显色强度从微弱到强烈不等，且这些位置与记录位点高度吻合19,26。在本实验室中，经过训练的操作人员在使用乌拉坦麻醉的啮齿类动物上操作时，成功率约为30-40%。这意味着每三次实验中约有一次能够选择一个满足以下标准的神经元进行树突和轴突的重建：1）脑内仅标记一个神经元；2）标记质量优良；3）生物胞素信号沿轴突投射保持恒定，不在远端末梢减弱；4）细胞色素C复染成功，可用于神经元定位注册；5）组织学处理过程中脑切片无损伤。通常的限制因素是生物胞素标记不足，即在约80%的实验（麻醉和/或清醒状态）中，所记录的神经元虽可回收（胞体和树突），但不足以实现轴突结构可靠且完整的重建。在图3中，我们展示了经适当邻近标记后，两个生物胞素标记神经元的DAB显色示例：一个是带棘的锥体神经元（图3A

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讨论

邻近胞体记录法能够以生物素标记所记录的神经元，从而在不同行为状态下（麻醉、清醒固定头部或自由活动）对单个神经元进行体内动作电位放电记录，并可在记录后（post hoc）对细胞类型进行分类和/或进行三维重建。该方法的主要优势在于，可在细胞外（即非侵入性）记录模式下获取生理参数，同时仍能通过生物素对神经元进行细胞内标记16,17,32。除生物素标记外，该技术还可用于向神经元内注射DNA、RNA、蛋白质或荧光染料33,34。该方法最明显的缺点可能是缺乏对标记质量的可视化控制，因此无法在实验过程中评估标记效果。然而，可通过记录条件特别是动作电位的波形来判断标记操作是否成功。例如，当电流脉冲期间放电频率显著升高，伴随后超极化消失以及动作电位波形变宽时，更有可能获得具有密集生物素-DAB标记的神经元（见图2）。此外，生物素标记的质量与多次独立标记时间的总和直接相关，多次长时间填充（>60秒）相比单次短时间填充（<30秒）可获得更佳的组织学标记效果。最后，示踪剂扩散的存活时间将决定远端结构中标记的强度。通常情况下...

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披露

作者 无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Huibert Mansvelder教授和Bert Sakmann教授提供的大力支持，感谢Marcel Oberlaender博士富有成效的讨论及提供的神经元示踪数据，以及Brendan Lodder提供的技术协助。数据采集使用了R. Bruno（美国纽约哥伦比亚大学）慷慨提供的基于LabView的ntrode VI系统。本研究得到了马克斯·普朗克学会和图宾根伯恩斯坦计算神经科学中心（由德国联邦教育与研究部（BMBF；资助号：01GQ1002）资助）（R.T.N.）、神经基因组学与认知研究中心（CNCR）、阿姆斯特丹神经科学园区（NCA）对C.P.J.d.K.的资助（NWO-ALW #822.02.013 和 ENC-Network #p3-c3）以及阿姆斯特丹自由大学的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SM-6 控制系统Luigs & Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 操纵器模块 X2
Lynx-8 放大器Neuralynx
Axoclamp-2B 放大器Axon Instruments
Osada 型号 EXL-M40Osada, Inc.
压电装置Physik InstrumentePL140.10
LabViewNational Instruments, Austin, TX, USALabView 采集软件
Ntrode 虚拟仪器 R. Bruno, Columbia Univ., NY
Sugi 吸水棉签Kettenbach30601
马心细胞色素 CSigmaC2506
牛肝过氧化氢酶SigmaC9322
DABSigmaD5637
H2O2Boom7047
Vectastain 标准 ABC 试剂盒VectorPK6100
Triton X100SigmaT9284
尿烷SigmaU2500
异氟烷Pharmachemie45.112.110
利多卡因SigmaL5647
Simplex 快速牙科水泥KemdentACR308/ACR924
生物胞素Molekula36219518
多聚甲醛（PFA）Merck Millipore8187151000
Trizma 基础缓冲液SigmaT4661
Mowiol 4-88Aldrich81381
分析纯甘油Fluka49767
HEPESSigmaH3375
NaClSigma Aldrich31434
KClSigma Aldrich60130
CaClSigma Aldrich22,350-6
MgCl2Fluka63072

参考文献

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