Juxtasomal生物胞素标记来研究单个皮层神经元的结构与功能的关系

Summary

要了解神经网络的结构，单个神经元的功能和形态特征是必要的。在这里，我们证明juxtasomal生物胞素标记，其允许电生理记录在胞外结构，但保持对胞内标记的神经元为事后重建的树突和轴突体系结构的能力。

Abstract

大脑皮质的特征是多层次和许多不同的细胞类型，它们共同作为网络负责许多高级认知功能，包括决策，感官引导行为或内存。为了理解如何这样复杂的神经元网络执行这样的任务，一个关键的第一步是确定在网络中的单个细胞类型的函数（或电活性），优选当动物正在执行一个相关的认知任务。另外，为了确定单个神经元网络和形态学的架构，以允许反向工程皮质网络的解剖结构是同样重要的。可今天的技术突破允许录制清醒细胞活性，动物行为与事后识别记录神经元的有价值的选择。在这里，我们展示了juxtasomal生物胞素标记技术，它涉及到记录动作电位人在细胞外（或宽松的补丁）配置扣球使用传统的补丁移液器。该juxtasomal记录配置是横跨行为条件相对稳定且适用，包括麻醉，镇静，清醒头固定，并且即使在可自由移动的动物。因此，这种方法允许在动物的行为来重建单个神经元，最终，整个皮质微电路的连接细胞类型特异性动作电位扣球。在这个视频稿件，我们将展示如何在juxtasomal配置单个神经元可在氨基甲酸乙酯麻醉大鼠的事后鉴定和形态重构被贴上生物胞素。

Introduction

神经网络由多种细胞类型，其特点是高度特异性的形态和生理特性^1-7。因此，个别细胞类型的网络内执行专门任务的（参见例如Gentet 等人 ⁸和Burgalossi 等 ^9）。我们才刚刚开始了解整个神经网络的细胞类型特异性的功能现在还是有很多被发现。为此，许多实验室正在实施的实验方法，使从生理参数已取得^1,10-15相同的神经元群的形态特征进行分析。在这里，我们展示了juxtasomal标记技术^16,17涉及与所记录的神经元与生物胞素的电结合使用传统的补丁移液器在细胞外（因此无创）配置电生理记录。该这种方法的主要优点是，非侵入性的性质确保了单个神经元的动作电位扣球被记录而不改变（ 如透析）的细胞的细胞内含量。其次是电，在juxtasomal方法提供事后细胞识别和重建的选项链接功能（生理），以结构（形态）。通常情况下，形态重构涉及重建的树突和轴突的形态，可以延长至脊柱和/或布顿密度的定量，甚至在用电子显微镜纳米级分辨率重建神经元形态的。该juxtasomal记录技术可以用于各种细胞类型跨越皮质层或子皮质区的范围内的物种的体内录音，虽然大多数研究已应用于该技术在小型啮齿动物如小鼠或大鼠。我们的研究重点是记录和标记的神经元从大鼠初级躯体感觉皮层（S1）和涉及视觉识别记录的神经元^18，与精确定位在一个标准化的参考帧组合树突重建逆向工程皮质网络^4,19和轴突结构的详细的重建来表征细胞类型特异性地方和远距离投射目标^20。

相比其它体内记录技术（细胞内或细胞的全细胞），juxtasomal录音是相对稳定的，因此可以被跨越行为状态应用包括麻醉^21,22，镇静剂^14，醒头固定^23，或什至可自由移动的动物⁹ 。这里，我们表明在聚氨酯麻醉大鼠S1 juxtasomal标签，虽然我们强调该技术的普遍适用性来选择的许多制剂。

Protocol

1。动物的制备

所有实验步骤都进行了按照荷兰法律和评估后，由当地的伦理委员会，在阿姆斯特丹VU大学，荷兰。

1. 麻醉Wistar系大鼠（P25-P45，♂/♀）用异氟烷（在氧气2-3％），随后与氨基甲酸乙酯（20％在0.9％NaCl，1.6〜1.7克/公斤）通过腹膜内注射。通过监测捏撤出，眼睑反射消失，并且触须运动评估麻醉深度。
2. 的情况下施用额外剂量的尿烷（初始剂量的10％）的动物未达到足够的麻醉深度或每当触须抽搐都在实验过程中观察到的。
3. 将麻醉的动物的立体框架装有加热垫，插入直肠温度探头和通过加热垫保持动物的体温在37.5±0.5°C。
放置动物的头在立体框架，用剪刀来呈现皮肤可见修剪头顶头发。
4. 注入100微升1％利多卡因（在0.9％NaCl）皮下注射局部麻醉在操作现场，等待3-5分钟。通过切割在尾至头端方向去除皮肤覆盖颅骨的表面和清洁剩余的组织。
5. 用0.9％NaCl和吸水拖把打扫广泛的头骨。
6. 确定目标区域的左侧半球（初级躯体感觉皮层（S1）:2.5毫米后5.5 mm处至前囟门）的坐标。与手术皮肤记号笔标记头骨上的位置。
7. 刮去骨轻轻地从感兴趣区域牙钻，直到骨变得透明和血管清晰可见。
8. 作为0.5mm×0.5毫米开颅通过切割在减薄的颅骨窗用手术刀（＃11），以避免损坏硬膜和血管。可选:采用外科皮肤记号笔提高知名度纪念开颅手术的边缘。
9. 取适量涂抹于干燥的头骨，然后牙科水泥薄薄的一层强力胶来构造一个浴（ 即录音室）封闭的开颅手术。
10. 修剪胡须在对侧到正好是5毫米的晶须卵泡。可选:突出修剪胡须与黑色睫毛膏。

2。 Juxtasomal录音和生物胞素标记

1. 使硼硅玻璃的补丁移液器〜1微米的内顶圆直径，以获得电极用3-5MΩ电阻。注意:理想移液器形态为juxtasomal记录是一个渐进的细长锥形，低锥角和〜1μm的末端（ 图1）。
2. 根据记录的深度（相对于软脑膜表面）时，记录电极的锥形尺寸应调整。极为重要的是，吨他锥度的直径应小于75微米的点在大脑中的条目以避免机械损伤或应力的记录区域。这表明，对于浅表皮层录音，300-500微米带的最大75微米的外径的锥度是必需的（ 图1A），而记录从相对较深的皮质层要求的1,500-1,800微米的较长的锥度，又具有最大外直径为75μm（在1,800μm的从电极头）。
3. 加载补丁吸管与正常大鼠铃声（NRR）添加2％生物胞素（ 见表1解决方案和试剂），并安装补丁吸管的头阶段固定在显微操作。
4. 电极架的角度设置为34°相对于矢状平面专门针对大鼠S1的D2柱。
5. 头段连接到网桥模式的放大器（ 即电流钳）。
6. 定位补丁吸取邻近的开颅手术。填补浴用0.9％NaCl和确定电极的电阻应是3-5兆欧，通过施加矩形脉冲​​具有正电流注入（1 nA的，200毫秒开/关）之间分摊。
7. 建立100-150毫巴超压，推进补丁吸管在1微米的步骤，同时施加正电流的方波脉冲（1 nA的，200毫秒开/关）。监视健壮的电阻变化时建立与硬脑膜接触。在这一点上，设置微操作的坐标为"零"，以允许准确的深度测量。
8. 推进1微米步模式，直到补丁吸管穿透由电极电阻突然下降显示硬膜。取出吸移管的夹持压力。
9. 搜索单个单位，而在1微米的步骤前进。通过施加200毫秒的通/断脉冲持续监测电极电阻。在电极电阻表型增长盟友表示单个神经元的接近。推进电极，直到正动作电位（AP）的〜2毫伏的波形记录（ 图2A和2B）。
10. 可选:记录神经元的自发扣球图案和确定晶须诱发扣球通过，例如，尾侧偏转为200毫秒个别晶须以3.3°的角度使用压电装置^18。
11. 推进电极，直到阻力25-35MΩ和尖峰有3-8 mV的幅度得到juxtasomal灌装的最佳条件。通过施加矩形脉冲​​的正电流（nA的1，200毫秒的开启/关闭）开始juxtasomal填充。同时监测AP的波形和频率（ 图2A和2B）慢慢地，逐渐增加电流步长为0.1 nA的。
12. 监测过程中的导通相位的块脉冲（ 图2C的膜孔中的AP的频率明显增加）。加注期间的尖峰波形示出了增加的宽度和减小后超极化（ 图2C和2D）。其他参数包括增加噪音或小（1-5毫伏）负直流偏移。
13. 增加或减少电流（1 NA）却使以维持稳定的生物胞素滴注。减少或根据该AP的频率突然增加停止的电流脉冲，以避免毒性通过细胞外离子，如钠离子过量涌入。注意:每个神经元会向电流注入和juxtasomal标记参数需要根据个别拍摄条件进行调整，有不同的反应。
14. 停止当前注射后密切监测信号。经过灌装届穗波形通常是变宽，呈超极化后大大减少。等待的神经元，这是明显的，当尖峰波形返回到其原有的特性（ 即存在的恢复正常的后超极化， 图2）。
15. 重复生物胞素神经元的完全恢复后充填阶段，以增加生物胞素负荷，以提高染色质量。
16. 收回补丁吸管，步长为1微米，直到尖峰幅度减小，以减少任何机械应力的单元格。等待至少1小时的生物胞素弥漫在细胞内，同时密切监测动物的体温和呼吸。

3。灌注动物及取出脑

1. 准备灌注安装，冲洗，并预装有0.9％的NaCl油管。
2. 放置动物在手术托盘和标准标签胶带将其固定。确保麻醉足够的深度，脚捏和眼睑反射应该缺席。
3. 使内侧穿过腹壁只是肋骨下方到外侧切口（5-6厘米），并继续在后前方向，露出胸骨。向前拉胸骨，仔细从隔膜分离肝脏。
4. 作一个小切口隔膜，通过下部肋骨切开并继续沿腹腔暴露心脏的整个长度的切口。
5. 取出心包。
6. 将针头插入左心室，并在右心房切口。灌注用0.9％的NaCl（约8毫升/分钟），直到肝脱色完成。
7. 输液切换到4％多聚甲醛（PFA），直到前爪的刚度和下颚是显而易见的。
8. 用剪刀斩首鼠
9. 除去剩余的颈部肌肉完全暴露颅骨。
10. 定位在脑干的剪刀上的背侧并小心切骨沿矢状缝，保持背侧的位置。
11. 从矢状缝两侧取出骨头使用镊子，露出大脑。小心取出硬脑膜避免Ð豪悦国际。
12. 小心地将钝铲到大脑的腹侧，轻轻取出大脑。
13. 后修复整个大脑过夜PFA在4°C大脑切换到0.05M磷酸盐缓冲液（PB）和储存于4℃。

4。切片大脑中切段

1. 就拿大脑出了0.05M的PB，并把它放在眼前面临的滤纸。用锋利的剃刀刀片来切断小脑沿冠状面和沿中间矢状面切割分离半球。
2. 应用强力胶安装平台上安装左半球其与前朝右矢状面。固定安装平台45°的vibratome角和淹没大脑在0.05M PB。
3. 固定在vibratome刀片，并确保在第一与脑表面接触是在半球体的前 - 后平面的中间。削减24 100微米节，并收集他们在含有0.05M PB 24孔板。

5。组织程序

1. 根据先前描述的方法^25，用于细胞色素氧化酶染色²⁴和 ​​抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶方法进行组织学协议。可选:可视化生物胞素使用荧光亲和素/链霉亲和Alexa的结合物。这还允许双重染色逆行或顺行追踪技术。
2. 洗部5×5分钟用0.05M PB和准备3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）含有用于细胞色素氧化酶染色来可视化桶层4的S1（L4）的溶液（ 见表2溶液和试剂）。在孵育30-45分钟的预热的溶液部分6-12由软脑膜，于37℃下
3. 冲洗切片用0.05M PB为6×5分钟和孵育所有部分在3％H ₂解渴内源性过氧化物酶的活性 O ₂在0.05M PB为20分钟，在室温（RT）。
4. 冲洗切片用0.05M PB为5×10分钟。在孵育ABC-解决方案的部分（ 见表3解决方案和试剂）一夜之间在4°C。
5. 冲洗切片用0.05M PB为5×10分钟，并准备民建联溶液以可视化的生物胞素填充神经元（ 见表4解决方案和试剂）。在孵育过滤后的溶液部分在室温为45-60分钟。
6. 冲洗切片用0.05M PB为5×10分钟。山路段在显微镜玻片和盖玻片用的Mowiol（ 见表5解决方案和试剂）。
7. 确定使用光学显微镜的标签质量。

Results

详细的知识对单个神经元的三维结构对于阐明神经元网络的组织原则至关重要。我们的方法包括一个管道，以实现高品质的生物胞素标记从体内制备，从而使事后神经元分类和树突和单个神经元，在高分辨率的轴突架构的详细重建。根据juxtasomal标签的质量，神经元恢复与不同的DAB-强度，从微弱到可以非常精确地对应于记录位置^19,26位置激烈的DAB信号。在我们的实验室，一个训练有素的实验者在操作中氨基甲酸乙酯麻醉的老鼠成功率的30-40％。这表明一个神经元被选择为树突和轴突重建中三分之一的实验，则满足以下条件:1）只有一个神经元填充在大脑，2）优良的质量标签，3）生物胞素信号是沿轴突突起恒定和不降低在远侧末梢，4）细胞色素c复染是成功的，以允许神经元的注册，和5）无组织学过程中的脑切片的损伤。限制因素通常是生物胞素标记不足，这意味着在〜80％，所有的实验（麻醉和/或清醒），记录下来的神经元将被收回（胞体和树突）。这是足够的细胞类型分类，但不可靠的，完整的轴突结构的重建。在图3中，我们将展示生物胞素标记的神经元经过适当juxtasomal标签DAB信号的两个例子，...

Discussion

该juxtasomal方法允许记录在体内动作电位扣球来自全国各地的行为条件的单台（麻醉，清醒头固定或自由活动）与生物胞素标记的神经元记录为事后的细胞类型分类和/或三维重建的选项。主要的优点是能够获得在细胞外（因此非侵入性）构型的生理参数，还能够与生物胞素^16,17,32细胞内标记的神经元。除了 ​​生物胞素标记，这种技术可以用于注射神经元与DNA，RNA，蛋白质，或荧光染料^33,34。这种方法的最明显的缺点是可能缺少标记质量的视觉控制的，因此没有办法在实验过程中检查标记的质量。然而，记录条件，特别是动作电位的形状，可用于评估该标记过程的成功。对于斯塔考，恢复神经元密集生物胞素-DAB标签的可能性增大时，在电流脉冲的尖峰频率显着增加，并伴有的后超极化动作电位的波形和展宽（参见图2）消失。此外，生物胞素标记的质量直接相关的单独的标记会话的长度相加，使得几个长填充阶段（> 60秒），将导致更好的组织学质量相比，单个短填充会话（<30秒） 。最后，存活时间为示踪剂的扩散会认真确定远端舱室的标记强度。一般来说，经过高品质电...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SM-6 控制系统	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 机械手块 X2
Lynx-8 放大器	Neuralynx
Axoclamp-2B 放大器	Axon Instruments
Osada 型号 EXL-M40	Osada， Inc.
压电器件	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments， Austin， TX， USA		LabView 采集软件
Ntrode 虚拟仪器	R. Bruno，纽约
Sugi 吸收拭	Kettenbach	30601
来自马心脏的细胞色素 C	Sigma	C2506
来自牛肝的过氧化氢酶	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain 标准品 ABC 试剂盒	载体	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
氨基甲酸酯	Sigma	U2500
异氟醚	Pharmachemie	45.112.110
利多卡因	Sigma	L5647
单工快速牙科水泥	Kemdent	ACR308/ACR924
生物胞素	Molekula	36219518
	PFA 默克 Millipore	8187151000
Trizma 碱	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
分析级甘油	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22,350-6
MgCl2	Fluka	63072