Juxtasomal生物胞素标记来研究单个皮层神经元的结构与功能的关系

Summary

要了解神经网络的结构，单个神经元的功能和形态特征是必要的。在这里，我们证明juxtasomal生物胞素标记，其允许电生理记录在胞外结构，但保持对胞内标记的神经元为事后重建的树突和轴突体系结构的能力。

Abstract

大脑皮质的特征是多层次和许多不同的细胞类型，它们共同作为网络负责许多高级认知功能，包括决策，感官引导行为或内存。为了理解如何这样复杂的神经元网络执行这样的任务，一个关键的第一步是确定在网络中的单个细胞类型的函数（或电活性），优选当动物正在执行一个相关的认知任务。另外，为了确定单个神经元网络和形态学的架构，以允许反向工程皮质网络的解剖结构是同样重要的。可今天的技术突破允许录制清醒细胞活性，动物行为与事后识别记录神经元的有价值的选择。在这里，我们展示了juxtasomal生物胞素标记技术，它涉及到记录动作电位人在细胞外（或宽松的补丁）配置扣球使用传统的补丁移液器。该juxtasomal记录配置是横跨行为条件相对稳定且适用，包括麻醉，镇静，清醒头固定，并且即使在可自由移动的动物。因此，这种方法允许在动物的行为来重建单个神经元，最终，整个皮质微电路的连接细胞类型特异性动作电位扣球。在这个视频稿件，我们将展示如何在juxtasomal配置单个神经元可在氨基甲酸乙酯麻醉大鼠的事后鉴定和形态重构被贴上生物胞素。

Introduction

神经网络由多种细胞类型，其特点是高度特异性的形态和生理特性^1-7。因此，个别细胞类型的网络内执行专门任务的（参见例如Gentet 等人 ⁸和Burgalossi 等 ^9）。我们才刚刚开始了解整个神经网络的细胞类型特异性的功能现在还是有很多被发现。为此，许多实验室正在实施的实验方法，使从生理参数已取得^1,10-15相同的神经元群的形态特征进行分析。在这里，我们展示了juxtasomal标记技术^16,17涉及与所记录的神经元与生物胞素的电结合使用传统的补丁移液器在细胞外（因此无创）配置电生理记录。该这种方法的主要优点是，非侵入性的性质确保了单个神经元的动作电位扣球被记录而不改变（ 如透析）的细胞的细胞内含量。其次是电，在juxtasomal方法提供事后细胞识别和重建的选项链接功能（生理），以结构（形态）。通常情况下，形态重构涉及重建的树突和轴突的形态，可以延长至脊柱和/或布顿密度的定量，甚至在用电子显微镜纳米级分辨率重建神经元形态的。该juxtasomal记录技术可以用于各种细胞类型跨越皮质层或子皮质区的范围内的物种的体内录音，虽然大多数研究已应用于该技术在小型啮齿动物如小鼠或大鼠。我们的研究重点是记录和标记的神经元从大鼠初级躯体感觉皮层（S1）和涉及视觉识别记录的神经元^18，与精确定位在一个标准化的参考帧组合树突重....

Protocol

1。动物的制备

所有实验步骤都进行了按照荷兰法律和评估后，由当地的伦理委员会，在阿姆斯特丹VU大学，荷兰。

1. 麻醉Wistar系大鼠（P25-P45，♂/♀）用异氟烷（在氧气2-3％），随后与氨基甲酸乙酯（20％在0.9％NaCl，1.6〜1.7克/公斤）通过腹膜内注射。通过监测捏撤出，眼睑反射消失，并且触须运动评估麻醉深度。
2. 的情况下施用额外剂量的尿烷（初始剂量的10％）的动物未达到足够的麻醉深度或每当触须抽搐都在实验过程中观察到的。
3. 将麻醉的动物的立体框架装有加热垫，插入直肠温度探头和通过加热垫保持动物的体温在37.5±0.5°C。
放置动物的头在立体框架，用剪刀来呈现皮肤可见修剪头顶头发。
4. 注入100微升1％利多卡因（在0.9％NaCl）皮下注射局部麻醉在操作现场，等待3-5分钟。通过切割在尾至头端方向去除皮肤覆盖颅骨的表面和清洁剩余的组织。
5. 用0.9％NaCl和吸水拖把打扫广泛的头骨。
6. 确定目标区域的左侧半球（初级躯体感觉皮层（S1）:2.5毫米后5.5 mm处至前囟门）的坐标。与手术皮肤记号笔标记头骨上的位置。
7. 刮去骨轻轻地从感兴趣区域牙钻，直到骨变得透明和血管清晰可见。
8. 作为0.5mm×0.5毫米开颅通过切割在减薄的颅骨窗用手术刀（＃11），以避免损坏硬膜和血管。可选:采用外科皮肤记号笔提高知名度纪念开颅....

Results

详细的知识对单个神经元的三维结构对于阐明神经元网络的组织原则至关重要。我们的方法包括一个管道，以实现高品质的生物胞素标记从体内制备，从而使事后神经元分类和树突和单个神经元，在高分辨率的轴突架构的详细重建。根据juxtasomal标签的质量，神经元恢复与不同的DAB-强度，从微弱到可以非常精确地对应于记录位置^19,26位置激烈的DAB信号。在我们的实验室，一个训练有素的实验者在操作中氨基甲酸乙酯麻醉的老鼠成功率的30-40％。这表明一个神经元被选择为树突和轴突重建中三分之一的实验，则满足以下条件:1）只有一个神经元填充在大脑，2）优良的质量标签，3）生物胞素信号是沿轴突突起恒定和不降低在远侧末梢，4）细胞色素c复染是成功的，以允许神经元的注册，和5）无组织学过程中的脑切片的损伤。限制因素通常是生物胞素标记不足，这意味着在〜80％，所有的实验（麻醉和/或清醒），记录下来的神经元将被收回（胞体和树突）。这是足够的细胞类型分类，但不可靠的，完整的轴突结构的重建。在图3中，我们将展示生物胞素标记的神经元经过适当juxtasomal标签DAB信号的两个例子，.......

Discussion

该juxtasomal方法允许记录在体内动作电位扣球来自全国各地的行为条件的单台（麻醉，清醒头固定或自由活动）与生物胞素标记的神经元记录为事后的细胞类型分类和/或三维重建的选项。主要的优点是能够获得在细胞外（因此非侵入性）构型的生理参数，还能够与生物胞素^16,17,32细胞内标记的神经元。除了 ​​生物胞素标记，这种技术可以用于注射神经元与DNA，RNA，蛋白质，或荧光染料^33,34。这种方法的最明显的缺点是可能缺少标记质量的视觉控制的，因此没有办法在实验过程中检查标记的质量。然而，记录条件，特别是动作电位的形状，可用于评估该标记过程的成功。对于斯塔考，恢复神经元密集生物胞素-DAB标签的可能性增大时，在电流脉冲的尖峰频率显着增加，并伴有的后超极化动作电位的波形和展宽（参见图2）消失。此外，生物胞素标记的质量直接相关的单独的标记会话的长度相加，使得几个长填充阶段（> 60秒），将导致更好的组织学质量相比，单个短填充会话（<30秒） 。最后，存活时间为示踪剂的扩散会认真确定远端舱室的标记强度。一般来说，经过高品质电.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
SM-6 控制系统	Luigs Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 机械手块 X2
Lynx-8 放大器	Neuralynx
Axoclamp-2B 放大器	Axon Instruments
Osada 型号 EXL-M40	Osada， Inc.
压电器件	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments， Austin， TX， USA		LabView 采集软件
Ntrode 虚拟仪器	R. Bruno，纽约
Sugi 吸收拭	Kettenbach	30601
来自马心脏的细胞色素 C	Sigma	C2506
来自牛肝的过氧化氢酶	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain 标准品 ABC 试剂盒	载体	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
氨基甲酸酯	Sigma	U2500
异氟醚	Pharmachemie	45.112.110
利多卡因	Sigma	L5647
单工快速牙科水泥	Kemdent	ACR308/ACR924
生物胞素	Molekula	36219518
	PFA 默克 Millipore	8187151000
Trizma 碱	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
分析级甘油	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22,350-6
MgCl2	Fluka	63072