近胞体生物胞素标记法用于研究单个皮层神经元的结构-功能关系

摘要

为了理解神经元网络的结构，必须对单个神经元进行功能和形态学表征。本文展示了贴附式生物胞素标记技术，该方法可在细胞外构型下进行电生理记录，同时仍能对神经元进行细胞内标记以 术后 临时的 树突和轴突结构的重建

摘要

大脑皮层具有多层结构以及多种不同类型的细胞，这些细胞共同构成网络，负责多种高级认知功能，包括决策、感觉引导的行为和记忆等。为了理解如此复杂的神经网络如何执行这些任务，一个关键步骤是在动物执行相关认知任务时，确定网络中各类细胞的功能（或电活动）。此外，同样重要的是确定该网络的解剖结构以及单个神经元的形态架构，以便对皮层网络进行逆向工程分析。当前可用的技术突破使得能够在清醒且行为活跃的动物体内记录细胞活动，并具备在实验后post hoc识别所记录神经元的宝贵优势。本文中，我们演示了紧贴细胞膜的生物胞素标记技术，该技术采用传统的膜片钳电极，在细胞外（或松散贴附）构型下记录动作电位放电。紧贴细胞膜记录构型相对稳定，适用于多种行为状态，包括麻醉、镇静、清醒固定头部，甚至自由活动的动物。因此，该方法可将动物行为过程中特定细胞类型的动作电位放电与单个神经元的重建，乃至整个皮层微环路的重建联系起来。在本视频论文中，我们展示了在尿烷麻醉的大鼠中，如何利用紧贴细胞膜构型对单个神经元进行生物胞素标记，以实现post hoc识别和形态学重建。

引言

神经元网络由多种细胞类型组成，这些细胞类型具有高度特异的形态学和生理学特性^1-7。因此，不同类型的细胞在网络中执行专门的功能（例如参见 Gentet et al.⁸ 和 Burgalossi et al.⁹）。目前我们才刚刚开始理解神经元网络中各类细胞的特异性功能，仍有许多未知有待探索。为此，许多实验室正在采用一些实验方法，以实现对已获取生理参数的同一神经元群体进行形态学特性的分析^1,10-15。本文中，我们演示了紧贴膜外标记技术（juxtasomal labeling technique）^16,17，该技术结合了使用传统膜片钳电极在细胞外（即非侵入性）构型下进行电生理记录，并通过生物胞素（biocytin）对所记录神经元进行电穿孔标记。该方法的主要优势在于其非侵入性，可确保在不改变（例如透析）细胞内成分的前提下记录单个神经元的动作电位放电。随后通过电穿孔，紧贴膜外记录法可在实验后（post hoc）实现细胞鉴定与形态重建，从而将功能（生理学）与结构（形态学）关联起来。通常，形态重建包括树突和轴突形态的重建，还可进一步扩展至树突棘和/或突触小结密度的量化分析，甚至可利用电子显微镜在纳米级分辨率下重建神经元形态。紧贴膜外记录技术可用于多种物种皮层各层或皮层下区域中不同类型细胞的体内（in vivo....

方案

1. 动物准备

所有实验操作均依照荷兰法律进行，并经荷兰阿姆斯特丹自由大学当地伦理委员会评估后实施。

1. 用异氟烷（2-3% 氧气混合）麻醉一只 Wistar 大鼠（P25-P45，♂/♀），随后通过腹腔注射乌拉坦（20% 溶于 0.9% NaCl，1.6-1.7 g/kg）。通过检测夹捏回缩反应、眼睑反射及须毛运动来评估麻醉深度。
2. 若实验过程中动物未达到足够的麻醉深度或出现胡须抽动，可追加注射乌拉坦（剂量为初始剂量的10%）。
3. 将麻醉后的动物置于装有加热垫的立体定位仪上，插入直肠温度探针，并通过加热垫将动物体温维持在37.5±0.5 °C。
4. 将动物头部置于立体定位仪中，使用剪刀修剪头顶毛发，使皮肤可见。
5. 在手术部位皮下注射 100 µl 1% 利多卡因（溶于 0.9% NaCl）进行局部麻醉，等待 3–5 分钟。沿尾侧至头侧方向切开覆盖颅骨表面的皮肤，并清除残留组织。
6. 用0.9% NaCl和吸水棉签彻底清洁颅骨。
7. 确定左半球目标区域的坐标（对于初级体感皮层（S1）：位于前囟后方2.5 mm，外侧5.5 mm）。使用外科皮肤标记笔在颅骨上标记该位置。
8. 使用牙科钻头从目标区域轻轻刮除骨组织，直至骨质变透明且血管清晰可见。
9. 使用手术刀（#11）在变薄的颅骨上切出一个0.5 mm × 0.5 mm的颅窗，....

结果

详细了解单个神经元的三维结构对于阐明神经网络的组织原则至关重要。我们的方法包括一个流程，可实现高质量的生物胞素标记，从而获得单个神经元 体内 制备，从而允许 术后 临时的 神经元分类及单个神经元树突和轴突结构的高分辨率详细重建。根据贴附膜片标记的质量，可在记录位置处回收到不同DAB染色强度的神经元，其DAB信号从微弱到强烈不等，且染色位置与记录位点高度吻合^19,26在我们的实验室中，训练有素的实验人员在使用乌拉坦麻醉的啮齿类动物中操作的成功率为30%–40%。这意味着每三次实验中约有一次能成功选取一个满足以下全部标准的神经元进行树突和轴突的重建：1）脑组织中仅标记出单个神经元；2）标记质量极佳；3）生物胞素信号在轴突投射全程保持稳定，且在远端末梢无减弱现象；4）细胞色素C（Cyt C）复染成功，可用于神经元定位配准；5）组织学处理过程中脑片未受损伤。通常情况下，限制性因素是生物胞素标记不足，因此在约80%的实验（无论麻醉或清醒状态）中，仅能回收记录到的神经元（胞体和树突）。这足以用于细胞类型的分类，但不足以实现轴突结构的可靠且完整的重建。在 图3

讨论

邻近胞体记录法能够以生物素标记所记录的神经元，从而在不同行为状态下（麻醉、清醒固定头部或自由活动）对单个神经元进行体内动作电位放电记录，并可在记录后（post hoc）对细胞类型进行分类和/或进行三维重建。该方法的主要优势在于，可在细胞外（即非侵入性）记录模式下获取生理参数，同时仍能通过生物素对神经元进行细胞内标记^16,17,32。除生物素标记外，该技术还可用于向神经元内注射DNA、RNA、蛋白质或荧光染料^33,34。该方法最明显的缺点可能是缺乏对标记质量的可视化控制，因此无法在实验过程中评估标记效果。然而，可通过记录条件特别是动作电位的波形来判断标记操作是否成功。例如，当电流脉冲期间放电频率显著升高，伴随后超极化消失以及动作电位波形变宽时，更有可能获得具有密集生物素-DAB标记的神经元（见图2）。此外，生物素标记的质量与多次独立标记时间的总和直接相关，多次长时间填充（>60秒）相比单次短时间填充（<30秒）可获得更佳的组织学标记效果。最后，示踪剂扩散的存活时间将决定远端结构中标记的强度。通常情况下.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SM-6 控制系统	Luigs & Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 操纵器模块 X2
Lynx-8 放大器	Neuralynx
Axoclamp-2B 放大器	Axon Instruments
Osada 型号 EXL-M40	Osada, Inc.
压电装置	Physik Instrumente	PL140.10
LabView	National Instruments, Austin, TX, USA		LabView 采集软件
Ntrode 虚拟仪器	R. Bruno, Columbia Univ., NY
Sugi 吸水棉签	Kettenbach	30601
马心细胞色素 C	Sigma	C2506
牛肝过氧化氢酶	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain 标准 ABC 试剂盒	Vector	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
尿烷	Sigma	U2500
异氟烷	Pharmachemie	45.112.110
利多卡因	Sigma	L5647
Simplex 快速牙科水泥	Kemdent	ACR308/ACR924
生物胞素	Molekula	36219518
多聚甲醛（PFA）	Merck Millipore	8187151000
Trizma 基础缓冲液	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
分析纯甘油	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22,350-6
MgCl2	Fluka	63072