丙型肝炎病毒复制分析方案

摘要

丙型肝炎病毒（HCV）是一种导致肝脏疾病（包括肝硬化和肝癌）的重要人类病原体。HCV感染性细胞培养系统对于理解HCV复制的分子机制以及开发新的治疗方法至关重要。本文中，我们描述了一种用于研究HCV复制周期各个阶段的实验方案。

摘要

丙型肝炎病毒（HCV）影响全球3%的人口，可导致严重的肝脏疾病，包括 慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。HCV 是一种有包膜的 RNA 病毒，属于黄病毒科 黄病毒科目前的治疗方法尚未完全有效，且会引起不良副作用。尚无可用的丙型肝炎病毒（HCV）疫苗。因此，仍需持续努力以开发疫苗和更有效的治疗手段。HCV细胞培养系统对于研究HCV生命周期的各个阶段至关重要，包括病毒进入、基因组复制、包装及释放。在本实验方案中，我们使用了一种野生型同基因型2a嵌合病毒FNX-HCV，以及一种携带报告基因的重组病毒FNX-Rluc 海肾 荧光素酶报告基因以研究病毒复制。采用一种人肝癌细胞系（基于Huh-7）进行转染 体外 转录的HCV基因组RNA。在转染后的不同时间点收集无细胞培养上清液、蛋白裂解物和总RNA，以评估HCV的生长情况。通过定量RT-PCR和检测HCV双链RNA的存在来评价HCV基因组的复制状态。使用针对HCV NS3和NS5A蛋白的特异性抗体，通过Western印迹和免疫荧光实验验证HCV蛋白的表达。转染HCV RNA的细胞可向培养上清液中释放具有感染性的病毒颗粒，并测定病毒滴度。利用荧光素酶报告实验评估报告HCV的复制水平和感染性。总之，我们介绍了多种病毒学检测方法，用于表征HCV复制周期的不同阶段。

引言

丙型肝炎病毒（HCV）可导致肝硬化和肝癌。全球约有1.7亿人感染该病毒，每年约有35万人因此死亡^1-3。HCV是一种正义单链RNA病毒，基因组大小为9.6 kb。HCV基因组被翻译成一个约含3,000个氨基酸残基的单一大分子多聚蛋白，随后由多种宿主细胞和病毒自身的蛋白酶进行蛋白水解切割，生成10种多肽。HCV是丙型肝炎病毒属（Hepacivirus）的代表病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）⁴。感染后，HCV在80%的个体中会建立慢性感染。该感染大多无明显症状，及时诊断有助于采取治疗措施以防止肝脏功能恶化。目前的治疗方法尚不理想，且尚无可用疫苗^5,6。

丙型肝炎的病因最早于1989年被描述⁷。研究丙型肝炎病毒（HCV）的复制对于丙型肝炎疫苗和治疗研究具有重要意义，但长期以来由于缺乏高效的病毒培养系统而受到阻碍。已有研究表明，HCV的分子克隆在经肝内接种后可在黑猩猩中引发感染⁸。随后，研究人员构建了HCV亚基因组复制子，使得在细胞培养系统中解析病毒基因组复制阶段成为可能^9,10。能够感染细胞培养物的基因型2a HCV分离株JFH-1（Japanese Fulminant hepatitis-1）的发现，为HCV复制研究开辟了新的途径^11-13。目前已有基于基因型2a JFH-1株的基因间和基因内嵌合....

方案

该实验方案的总体流程如图 1所示。

1. 细胞

1. 配制完全培养基，其中包含10-15%胎牛血清（FBS）、10 mM非必需氨基酸、10 mM Hepes、青霉素（100单位/毫升）、链霉素（100毫克/毫升）和2 mM L-谷氨酰胺。
2. 维持 Huh-7.5.1 细胞¹³ 在含有上述添加剂的完全生长培养基中 体外 丙型肝炎病毒复制周期的分析
3. 在37 °C、5% CO₂条件下，使用指定的添加补剂的生长培养基在Huh-7.5.1细胞中培养病毒株₂.

2. 病毒与质粒构建

1. 将HCV RNA逆转录为互补DNA（cDNA）形式，并将其克隆至质粒载体中，以便于遗传操作。注：日本暴发性肝炎1型（JFH-1，基因型2a HCV）分离株的发现对HCV研究至关重要，目前主要用于研究HCV的复制周期^11-13。基于JFH-1 HCV构建的种间和种内嵌合病毒在研究中被广泛使用^14-18。此前已有报道合成种内基因型2a嵌合病毒FNX-HCV及单顺反子嵌合报告病毒株的构建方法¹⁹，其具体构建细节不在本实验方案的讨论范围内。
2. 使用pFNX-HCV种内基因型2a病毒，....

结果

丙型肝炎病毒是一种RNA病毒。因此，为了进行遗传操作，已将HCV基因组cDNA克隆至细菌质粒载体中。在HCV基因组5’端的前方插入了T7 RNA聚合酶启动子序列。HCV分析工作流程的总体示意图见图1。为了生成具有精确3’末端的HCV基因组RNA，使用XbaI限制性内切酶对含有HCV基因组的质粒进行酶切，并通过绿豆芽核酸酶消化将产生的单链突出末端钝化。通过琼脂糖凝胶电泳评估线性化HCV质粒的质量（图2B）。随后，HCV DNA经T7 RNA聚合酶介导的体外转录反应生成RNA，所得RNA产物大小为9.6 kb（图2C）。

我们检测了基因型2a HCV的种内生长动力学图 3）。Huh-7.5.1 细胞通过电穿孔转染 体外 野生型（WT）和聚合酶缺陷型病毒的转录RNA。我们通过RT-qPCR检测了病毒正义基因组的复制情况。结果显示，WT病毒能够高效复制其基因组（图 3A.......

讨论

本图示描述了一种分析丙型肝炎病毒（HCV）复制周期的方法。HCV 是一种人类病原体，必须严格遵守规定的生物安全操作规程。此前已有文献报道过具有感染性的 HCV 细胞培养系统^11-13,16,17。在执行本图示所示方案时，我们实施了几个关键步骤。首先，获得高质量、完整全长的病毒基因组 RNA 对后续研究至关重要。携带病毒 cDNA 的输入质粒必须经过仔细的线性化和末端钝化处理。XbaI 酶切后产生的突出末端使用绿豆芽苗核酸酶进行钝化，该酶为非特异性核酸酶，若孵育时间过长，将导致病毒基因组 3’ 端受损或降解。在指定的 30 分钟孵育结束后，必须立即通过苯酚-氯仿抽提或阴离子交换柱纯化去除该核酸酶。不建议对经核酸酶处理的 DNA 进行凝胶回收，因为在凝胶电泳过程中该酶仍具有活性。

对于后续 体外 RNA转录步骤通常还需采取广谱预防措施以尽量减少核糖核酸酶（RNase）污染。所有使用的试剂和材料均应无RNase。为获得高质量、RNA链断裂最少的基因组RNA，在纯化及后续操作过程中应尽量减少物理应力，避免剧烈涡旋和反复移液。RNA转.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM）	费舍尔科技公司	10-017-CV
非必需氨基酸	费舍尔科技公司	MT25025CI
HEPES	生命技术公司	15630080
Glutamax	生命技术公司	35050061
Opti-MEM 低血清培养基，无酚红	生命技术公司	11058-021
Huh-7.5.1	斯克里普斯研究所		该细胞系由 Francis Chisari 博士在斯克里普斯研究所与中国塞达斯西奈医学中心签署的 MTA 协议下，慷慨提供给 Arumugaswami 博士
质粒（pFNX-HCV、pFNX-HCV Pol null、pFNX-Rluc 和 pFNX-Rluc Pol null）	塞达斯西奈医学中心		HCV 质粒由 Arumugaswami 博士使用重叠寡核苷酸合成。
XbaI	新英格兰生物实验室公司	R0145S
绿豆芽核酸酶	新英格兰生物实验室公司	M0250S
T7 RiboMAX Express 大规模 RNA 合成系统	普洛麦格公司	P1320
RNeasy Mini 试剂盒	凯杰公司	74104
Nanodrop 2000	赛默飞世尔科技公司	Nanodrop 2000
电穿孔比色皿（4 mm）	Bioexpress 公司	E-5010-4
Gene Pulser Xcell 全系统	伯乐公司	165-2660
小鼠单克隆抗双链 RNA 抗体 J2	English & Scientific Consulting Kft. 公司	10010200
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488	生命技术公司	A11008
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 594	生命技术公司	A11020
PVDF 膜包	伯乐公司	162-0263
印迹级封闭剂，脱脂奶粉	伯乐公司	170-6404XTU
Tween-20	伯乐公司	170-6531XTU
抗丙型肝炎病毒 NS3 抗体 [8 G-2]	Abcam 公司	ab65407
抗丙型肝炎病毒 NS3 抗体 [H23]	Abcam 公司	ab13830
与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠 IgG	杰克逊免疫研究实验室公司	115-035-003
Amersham ECL Prime 西部印迹检测试剂	GE 医疗生命科学公司	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	生命技术公司	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	生命技术公司	11744500
ViiA 7 实时 PCR 系统	生命技术公司	NA
海肾荧光素酶检测试剂盒	普洛麦格公司	E2810
无 RNase 的 DNase	普洛麦格公司	M6101
GloMax-Multi 检测系统（发光仪）	普洛麦格公司