丙型肝炎病毒复制分析方案

摘要

丙型肝炎病毒（HCV）是一种导致肝脏疾病（包括肝硬化和肝癌）的重要人类病原体。HCV感染性细胞培养系统对于理解HCV复制的分子机制以及开发新的治疗方法至关重要。本文中，我们描述了一种用于研究HCV复制周期各个阶段的实验方案。

摘要

丙型肝炎病毒（HCV）影响全球3%的人口，可导致严重的肝脏疾病，包括 慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。HCV 是一种有包膜的 RNA 病毒，属于黄病毒科 黄病毒科目前的治疗方法尚未完全有效，且会引起不良副作用。尚无可用的丙型肝炎病毒（HCV）疫苗。因此，仍需持续努力以开发疫苗和更有效的治疗手段。HCV细胞培养系统对于研究HCV生命周期的各个阶段至关重要，包括病毒进入、基因组复制、包装及释放。在本实验方案中，我们使用了一种野生型同基因型2a嵌合病毒FNX-HCV，以及一种携带报告基因的重组病毒FNX-Rluc 海肾 荧光素酶报告基因以研究病毒复制。采用一种人肝癌细胞系（基于Huh-7）进行转染 体外 转录的HCV基因组RNA。在转染后的不同时间点收集无细胞培养上清液、蛋白裂解物和总RNA，以评估HCV的生长情况。通过定量RT-PCR和检测HCV双链RNA的存在来评价HCV基因组的复制状态。使用针对HCV NS3和NS5A蛋白的特异性抗体，通过Western印迹和免疫荧光实验验证HCV蛋白的表达。转染HCV RNA的细胞可向培养上清液中释放具有感染性的病毒颗粒，并测定病毒滴度。利用荧光素酶报告实验评估报告HCV的复制水平和感染性。总之，我们介绍了多种病毒学检测方法，用于表征HCV复制周期的不同阶段。

引言

丙型肝炎病毒（HCV）可导致肝硬化和肝癌。全球约有1.7亿人感染该病毒，每年约有35万人因此死亡^1-3。HCV是一种正义单链RNA病毒，基因组大小为9.6 kb。HCV基因组被翻译成一个约含3,000个氨基酸残基的单一大分子多聚蛋白，随后由多种宿主细胞和病毒自身的蛋白酶进行蛋白水解切割，生成10种多肽。HCV是丙型肝炎病毒属（Hepacivirus）的代表病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）⁴。感染后，HCV在80%的个体中会建立慢性感染。该感染大多无明显症状，及时诊断有助于采取治疗措施以防止肝脏功能恶化。目前的治疗方法尚不理想，且尚无可用疫苗^5,6。

丙型肝炎的病因最早于1989年被描述⁷。研究丙型肝炎病毒（HCV）的复制对于丙型肝炎疫苗和治疗研究具有重要意义，但长期以来由于缺乏高效的病毒培养系统而受到阻碍。已有研究表明，HCV的分子克隆在经肝内接种后可在黑猩猩中引发感染⁸。随后，研究人员构建了HCV亚基因组复制子，使得在细胞培养系统中解析病毒基因组复制阶段成为可能^9,10。能够感染细胞培养物的基因型2a HCV分离株JFH-1（Japanese Fulminant hepatitis-1）的发现，为HCV复制研究开辟了新的途径^11-13。目前已有基于基因型2a JFH-1株的基因间和基因内嵌合病毒，以及基于基因型1 HCV的感染性培养系统^14-18。

我们已成功利用 JFH-1 毒株及HCV 2a基因型内嵌合病毒，获得了病毒蛋白结构域及cis-作用RNA元件的高分辨率功能图谱^19,20。基于此，本文介绍了一种常规使用的高效培养系统，可用于研究HCV复制周期的各个阶段以及宿主与病原体之间的相互作用。我们展示了用于评估HCV 2a基因型内病毒基因组复制能力及de novo感染性的病毒学检测方法，以及基于Renilla荧光素酶报告系统的HCV检测方法。

方案

该实验方案的总体流程如图 1所示。

1. 细胞

1. 配制完全培养基，其中包含10-15%胎牛血清（FBS）、10 mM非必需氨基酸、10 mM Hepes、青霉素（100单位/毫升）、链霉素（100毫克/毫升）和2 mM L-谷氨酰胺。
2. 维持 Huh-7.5.1 细胞¹³ 在含有上述添加剂的完全生长培养基中 体外 丙型肝炎病毒复制周期的分析
3. 在37 °C、5% CO₂条件下，使用指定的添加补剂的生长培养基在Huh-7.5.1细胞中培养病毒株₂.

2. 病毒与质粒构建

1. 将HCV RNA逆转录为互补DNA（cDNA）形式，并将其克隆至质粒载体中，以便于遗传操作。注：日本暴发性肝炎1型（JFH-1，基因型2a HCV）分离株的发现对HCV研究至关重要，目前主要用于研究HCV的复制周期^11-13。基于JFH-1 HCV构建的种间和种内嵌合病毒在研究中被广泛使用^14-18。此前已有报道合成种内基因型2a嵌合病毒FNX-HCV及单顺反子嵌合报告病毒株的构建方法¹⁹，其具体构建细节不在本实验方案的讨论范围内。
2. 使用pFNX-HCV种内基因型2a病毒，因其包含J6CF亲本株（NCBI登录号 AF177036）的5'非翻译区（5'NTR）、结构区和p7，以及NS2非结构区的一部分（核苷酸1至2878），同时也包含JFH-1病毒株（NCBI登录号 AB047639）的非结构区组分。注：FNX-HCV是基于此前报道的Jc1种内基因型2a嵌合HCV序列合成的¹⁵。
3. 以pFNX-HCV病毒株（如上步骤2.2所述）为基础，通过在5' NTR与核心基因之间（核苷酸388与389之间）插入Renilla荧光素酶基因，构建单顺反子嵌合报告病毒载体pFNX-Rluc。随后，使用口蹄疫病毒2A（F2A）肽序列连接该载体中的荧光素酶基因与核心基因，该序列可作为切割信号发挥作用。
4. 以pFNX-HCV或pFNX-Rluc病毒背景为基础，构建RNA聚合酶缺失（Pol-）的病毒载体。将上述任一病毒骨架中NS5B聚合酶的催化残基GDD（氨基酸2759-2761；核苷酸8615-8623）替换为AAG氨基酸残基。

3. 体外 HCV RNA 转录

1. 使用基因型2a的嵌合病毒FNX-HCV及FNX-HCV聚合酶缺陷型（Pol-）HCV评估病毒复制（图 2A）。
2. 用XbaI限制性内切酶对病毒质粒进行线性化，随后用绿豆芽核酸酶处理以产生平末端。通过阴离子交换色谱法纯化消化后的质粒。通过琼脂糖凝胶电泳检测线性质粒的完整性（图 2B）。
3. 使用T7 RNA聚合酶对线性质粒进行体外转录。
4. 使用RNA纯化试剂盒纯化新合成的经DNase处理的RNA。
5. 通过琼脂糖凝胶电泳验证RNA的生成（图 2C）。
6. 通过分光光度法对RNA进行定量。
7. 将制备的RNA以10 μg的工作分装量保存于-80 °C。注意：为尽量减少实验设计中RNA质量的差异，应同时转录每种病毒样本及对照组的所有RNA。

4. HCV RNA 转染与样品采集

1. 使用胰蛋白酶消化收集 Huh-7.5.1 细胞。
2. 为洗涤细胞，将细胞悬液用冷的低血清培养基重悬后，离心，并重复洗涤两次。最后将细胞重悬于低血清培养基中，浓度为 1 × 10⁷ 个细胞/毫升。
3. 将总共 10 μg 体外转录的病毒 RNA 与 400 μl 重悬的细胞（4 × 10⁶ 个细胞）混合，加入 0.4 cm 电穿孔比色皿中。采用 270 V、100 Ω 和 950 μF 的参数进行电穿孔转染。
4. 将电穿孔后的细胞重悬于 10 ml 含 15% 胎牛血清（FBS）的完全生长培养基中。注意：当 Huh-7.5.1 细胞在含 15% 胎牛血清的培养基中培养时，电穿孔后细胞的存活率更高。
5. 在以下各时间点（4、48 和 96 小时），将细胞分别接种至 T-25 培养瓶（约每瓶 1.2 × 10⁶ 个细胞）和 48 孔板（每孔 1 × 10⁴ 个细胞）中。
6. 转染后 4–8 小时更换培养基，使用含 10% FBS 的新鲜补充培养基，以去除培养瓶和培养板中的死亡细胞碎片。
7. 在 48 和 96 小时时间点收集细胞培养上清液，并在 4 ºC 条件下以 1,500 rpm 离心 10 分钟，去除样品中的细胞碎片。
8. 将去除了细胞的上清液储存于 -80 ºC。在指定时间点裂解细胞，用于后续蛋白质和 RNA 的分析，包括 Western blot 和逆转录定量 PCR。

5. 用于评估HCV基因组拷贝数的逆转录定量PCR（RT-qPCR）

1. 采用两步法RT-qPCR检测HCV基因组RNA拷贝数。
2. 使用逆转录酶和特异性针对HCV正义链的引物（该引物结合于5'NTR区，序列：5’CCTATCAGGCAGTACCACA-3’）对1 μg总细胞RNA进行逆转录；同时使用针对看家基因肽基脯氨酰异构酶G（PPIG）的特异性引物（PPIG R：5’-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3’）进行逆转录。此外，使用HCV正义链引物对已知基因组拷贝数（10¹至10⁹拷贝标准品）的FNX-HCV RNA（在步骤3中制备）进行逆转录。
3. 取50 ng逆转录所得cDNA，使用特异性HCV引物（JFH RTQ F：5’CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3’；JFH RTQ R：5’CCTATCAGGCAGTACCACA-3’）及含DNA结合绿色染料的qPCR超混合液进行qPCR扩增。同时对看家基因PPIG进行qPCR扩增（引物PPIG F：5’-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3’；PPIG R：5’-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3’）。注意：为准确计算各样本中细胞内HCV RNA水平，需以细胞看家基因PPIG的表达水平（Ct值）作为标准化依据，并以FNX-HCV基因组的拷贝数作为拷贝数测定的标准曲线。
4. 进行qPCR检测HCV RNA拷贝数时，采用以下反应条件：95 ºC预变性15秒，60 ºC退火延伸30秒，共40个循环，使用实时荧光定量PCR系统。
5. 参见图3A和图3B中的基因组复制结果。

6. 检测HCV蛋白表达的蛋白质印迹分析（图3C）

1. 使用转染后96小时的病毒RNA转染细胞裂解液进行蛋白质免疫印迹分析。
2. 采用SDS-PAGE分离细胞裂解液，并将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。
3. 使用含5%脱脂奶粉、0.2% Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBS）封闭膜。
4. 将膜与一抗小鼠单克隆抗体NS3（1:1,000稀释）和β-actin（1:5,000稀释）孵育。
5. 加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（1:5,000稀释），通过化学发光法检测信号。

7. 免疫荧光检测（IFA）

1. 使用甲醇在 -20 ºC 下固定 HCV 感染和转染的细胞 30 分钟，用于免疫荧光检测。
2. 用 PBS 洗涤细胞三次，并用 IFA 封闭缓冲液进行封闭。
3. 使用兔多克隆抗 NS5A 一抗（由加州大学洛杉矶分校 Dr. Dasgupta 惠赠）或小鼠单克隆抗 dsRNA 抗体 J2，按 1:200 稀释（1 μg/ml），在 4 ºC 下孵育 5 小时至过夜。
4. 一抗孵育后，用 PBS 洗涤细胞三次。
5. 加入 1:1,000 稀释（1 μg/ml）的 goat anti-rabbit IgG-488 多克隆二抗或 goat anti-mouse IgG-594 多克隆二抗，在室温下孵育 1 小时。
6. 用 PBS 洗涤细胞三次，使用 Hoechst 染料对细胞核染色，并用荧光显微镜观察（图 3D）。

8. 测定病毒滴度

1. 使用96孔板，以每孔约3 × 10³个细胞的密度接种未处理的Huh-7.5.1细胞。次日，用生长培养基对转染HCV RNA的细胞所收获的无细胞培养上清液进行10倍系列稀释，并将各稀释度以三复孔方式接种至Huh-7.5.1细胞。
2. 感染后72 小时，用甲醇（-20 ºC下作用30分钟）固定细胞，并按照第7节所述方法对HCV NS5A蛋白进行免疫染色。
3. 选择最高稀释度计数NS5A阳性病灶，计算每毫升中平均焦点形成单位（FFU）数量。HCV滴度测定结果参见图 4。

9. 用于病毒基因组复制与感染性的Renilla荧光素酶报告基因检测

1. 为评估病毒基因组复制，将转染HCV RNA的Huh-7.5.1细胞以每孔1 × 10⁴个细胞的密度接种于48孔板中，每组设三个重复孔。
2. 在转染后6小时、48小时和96小时，用75 μl被动裂解缓冲液裂解细胞。
3. 室温下轻柔振荡孵育15分钟，随后将样品保存于-80 ºC。
4. 为检测Renilla荧光素酶的酶活性，将蛋白裂解液和Renilla荧光素酶检测试剂解冻至室温。
5. 每孔取20 μl蛋白裂解液加入96孔白色发光检测板中，并将该板放入化学发光仪中。
6. 每孔加入100 μl Renilla荧光素酶检测试剂（腔肠素底物 + 缓冲液），在预读2秒延迟后，积分采集发光信号10秒。
7. 根据生物学重复三次的荧光素酶检测值计算各样本的平均值和标准差，并对数据进行统计学分析（图 5）。
8. 为评估感染性，将HCV RNA转染细胞在指定时间点（48小时和96小时）收集的无细胞上清液各500 μl，分别以三个重复孔接种至48孔板中的 naïve Huh-7.5.1 细胞。
9. 感染后6 小时，每孔更换为500 μl新鲜培养基。
10. 在感染后48小时裂解细胞，并按照步骤8.2至8.7所述方法进行Renilla荧光素酶检测（图 5）。

10. 统计分析

1. 图中的误差线表示标准差（SD）。P 值通过非配对 t 检验计算得出。

结果

丙型肝炎病毒是一种RNA病毒。因此，为了进行遗传操作，已将HCV基因组cDNA克隆至细菌质粒载体中。在HCV基因组5’端的前方插入了T7 RNA聚合酶启动子序列。HCV分析工作流程的总体概述见图 1。为了生成具有精确3’末端的HCV基因组RNA，使用XbaI限制性内切酶对含有HCV基因组的质粒进行切割，并通过绿豆芽核酸酶消化将产生的单链突出端钝化。通过琼脂糖凝胶电泳评估线性化HCV质粒的质量（图 2B）。随后将HCV DNA用于T7 RNA聚合酶介导的体外转录，所得RNA产生一条大小为9.6 kb的单一产物（图 2C）。

我们检测了基因型2a HCV的复制动力学图 3）。Huh-7.5.1 细胞通过电穿孔转染 体外 野生型（WT）和聚合酶缺失病毒的转录RNA。我们通过RT-qPCR检测了病毒正义基因组的复制情况。结果显示，WT病毒能够高效复制其基因组（

讨论

本图示描述了一种分析丙型肝炎病毒（HCV）复制周期的方法。HCV 是一种人类病原体，必须严格遵守规定的生物安全操作规程。此前已有文献报道过具有感染性的 HCV 细胞培养系统^11-13,16,17。在执行本图示所示方案时，我们实施了几个关键步骤。首先，获得高质量、完整全长的病毒基因组 RNA 对后续研究至关重要。携带病毒 cDNA 的输入质粒必须经过仔细的线性化和末端钝化处理。XbaI 酶切后产生的突出末端使用绿豆芽苗核酸酶进行钝化，该酶为非特异性核酸酶，若孵育时间过长，将导致病毒基因组 3’ 端受损或降解。在指定的 30 分钟孵育结束后，必须立即通过苯酚-氯仿抽提或阴离子交换柱纯化去除该核酸酶。不建议对经核酸酶处理的 DNA 进行凝胶回收，因为在凝胶电泳过程中该酶仍具有活性。

对于后续 体外 RNA转录步骤通常还需采取广谱预防措施以尽量减少核糖核酸酶（RNase）污染。所有使用的试剂和材料均应无RNase。为获得高质量、RNA链断裂最少的基因组RNA，在纯化及后续操作过程中应尽量减少物理应力，避免剧烈涡旋和反复移液。RNA转...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基（DMEM）	费舍尔科技公司	10-017-CV
非必需氨基酸	费舍尔科技公司	MT25025CI
HEPES	生命技术公司	15630080
Glutamax	生命技术公司	35050061
Opti-MEM 低血清培养基，无酚红	生命技术公司	11058-021
Huh-7.5.1	斯克里普斯研究所		该细胞系由 Francis Chisari 博士在斯克里普斯研究所与中国塞达斯西奈医学中心签署的 MTA 协议下，慷慨提供给 Arumugaswami 博士
质粒（pFNX-HCV、pFNX-HCV Pol null、pFNX-Rluc 和 pFNX-Rluc Pol null）	塞达斯西奈医学中心		HCV 质粒由 Arumugaswami 博士使用重叠寡核苷酸合成。
XbaI	新英格兰生物实验室公司	R0145S
绿豆芽核酸酶	新英格兰生物实验室公司	M0250S
T7 RiboMAX Express 大规模 RNA 合成系统	普洛麦格公司	P1320
RNeasy Mini 试剂盒	凯杰公司	74104
Nanodrop 2000	赛默飞世尔科技公司	Nanodrop 2000
电穿孔比色皿（4 mm）	Bioexpress 公司	E-5010-4
Gene Pulser Xcell 全系统	伯乐公司	165-2660
小鼠单克隆抗双链 RNA 抗体 J2	English & Scientific Consulting Kft. 公司	10010200
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488	生命技术公司	A11008
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 594	生命技术公司	A11020
PVDF 膜包	伯乐公司	162-0263
印迹级封闭剂，脱脂奶粉	伯乐公司	170-6404XTU
Tween-20	伯乐公司	170-6531XTU
抗丙型肝炎病毒 NS3 抗体 [8 G-2]	Abcam 公司	ab65407
抗丙型肝炎病毒 NS3 抗体 [H23]	Abcam 公司	ab13830
与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的山羊抗小鼠 IgG	杰克逊免疫研究实验室公司	115-035-003
Amersham ECL Prime 西部印迹检测试剂	GE 医疗生命科学公司	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	生命技术公司	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	生命技术公司	11744500
ViiA 7 实时 PCR 系统	生命技术公司	NA
海肾荧光素酶检测试剂盒	普洛麦格公司	E2810
无 RNase 的 DNase	普洛麦格公司	M6101
GloMax-Multi 检测系统（发光仪）	普洛麦格公司