一个协议，用于分析丙型肝炎病毒复制

Summary

丙型肝炎病毒 （HCV） 是一种主要的人类病原体，可导致肝硬化和癌症等肝脏疾病。HCV 感染性细胞培养系统对于了解 HCV 复制的分子机制和开发新的治疗方法至关重要。在这里，我们描述了一种研究 HCV 复制周期各个阶段的协议。

Abstract

丙型肝炎病毒（HCV）影响世界人口的3％，并导致严重的肝脏疾病，包括慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌。丙型肝炎病毒是属于黄病毒科的包膜RNA病毒。目前的治疗是不充分有效的，并导致不利的副作用。没有丙型肝炎病毒疫苗可用。因此，需要开发一种疫苗和更好的治疗持续的努力。的HCV细胞培养体系是研究HCV生长的不同阶段，包括病毒进入，基因组复制，包装和出口的关键。在当前的程序提出，我们用野生型intragenotype 2a中的嵌合病毒，FNX-HCV和重组FNX-的Rluc病毒携带的Renilla荧光素酶报道基因来研究病毒的复制。一个人肝癌细胞株（Huh-7型）用于体外转录转染丙型肝炎病毒基因组RNA的。无细胞培养物上清液，蛋白裂解液和叔OTAL核糖核酸收获的不同时间点转染后，以评估HCV生长。丙型肝炎病毒基因组的复制状态是由定量RT-PCR和可视化HCV的存在双链RNA进行评估。丙型肝炎病毒蛋白的表达，用特异性HCV NS3和NS5A蛋白的抗体，Western blot和免疫荧光试验验证。感染性颗粒释放到培养上清液中和病毒滴度的HCV RNA转染的细胞进行测定。荧光素酶检测被用于评估记者丙型肝炎病毒的复制水平和传染性。总之，我们提出的各种病毒学检测表征丙型肝炎病毒复制周期的不同阶段。

Introduction

丙型肝炎病毒（HCV）导致肝硬化和肝癌。它影响1.7亿人在全球拥有35万人，每年死于^1-3。 HCV是正链RNA病毒为9.6 kb的基因组大小。 HCV基因组被翻译成的〜3000氨基酸残基被蛋白水解由各种细胞和病毒蛋白酶裂解成10多肽的单个蛋白。 HCV是原型病毒属中的肝炎病毒，属于黄病毒科 ^4。曝光后，建立了丙型肝炎病毒慢性感染者中80％的个体。这种感染大多是无症状的，及时的诊断可以允许治疗性干预，以防止肝恶化。目前的治疗是不理想的，没有疫苗可用^5,6。

丙型肝炎的病因在1989年⁷年首次描述。学习丙型肝炎病毒复制是丙型肝炎的疫苗和治疗研究的重要，但它一直由缺少一种有效的病毒培养体系的长期阻碍。丙型肝炎病毒的分子克隆被证明是在感染后肝内接种⁸只黑猩猩。随后，HCV亚基因组复制子进行了说明，其中允许解剖病毒基因组的复制阶段中的细胞培养系统^9,10。一个基因型2a丙型肝炎病毒的发现隔离JFH-1（日本暴发性肝炎-1），能够感染细胞培养中打开丙型肝炎病毒复制的研究^11-13新途径。基因型2a株JFH-1基于跨内和基因型嵌合病毒基因型1丙型肝炎病毒感染的基础培养体系可作为以及^14-18。

我们已成功地使用JFH-1株和HCV intra....

Protocol

该协议的一个大致轮廓示于图1。

1。细胞

1. 制备包含10〜15％的胎牛血清（FBS），10mM的非必需氨基酸，10mM的HEPES，青霉素（100单位/ ml），链霉素（100毫克/毫升），和2mM L-谷氨酰胺的完全生长培养基。
2. 在包含用于体外分析丙型肝炎病毒复制周期的上述补充完全生长培养基维持咦-7.5.1细胞^13。
3. 培养的病毒株在Huh-7.5.1细胞用指定的补充生长培养基，在37℃，5％的CO _2。

2，病毒和质粒构建

1. 产生的互补DNA（cDNA）形式的HCV RNA，并克隆至为便于基因操作的质粒​​载体。注:日本的暴发性肝炎1的发现，JFH-1（基因型2a丙型肝炎病毒），隔离一直为HCV研究的关键，并且是主要用于研究丙型肝炎病毒复制周期^11-13。根据JFH-1 HCV间和intragenotypic嵌合病毒常用于研究^14-18。合成intragenotype 2A嵌合病毒，FNX-HCV，和一个单顺反子嵌合记者株的构建先前¹⁹和施工细节超出了本协议的范围被描述。
2. 使用pFNX - HCV intragenotype 2a中的病毒，因为它包含一个....

Results

丙型肝炎病毒是一种RNA病毒。因此，对于遗传操作的目的，所述HCV基因组cDNA已被克隆到细菌质粒载体。甲T7 RNA聚合酶启动子序列立即被引入HCV基因组的5'末端之前。 HCV的分析工作流程的一般概述示于图1，生成HCV基因组RNA具有精确的3'末端含有质粒HCV基因组被切割用 XbaⅠ限制性内切酶和所产生的单链突出端补平用绿豆核酸酶消化。线性化的质粒的HCV的质量通过琼脂糖凝胶电泳（ 图2B）进行评估。中的HCV DNA进行T7 RNA聚合酶体外转录介导，将所得的RNA在9.6千碱基（ 图2C），得到一个单一的产品。

我们测试的intragenotype 2A丙型肝炎病毒（ 图中的生长动力学60，3）。本的Huh-7.5.1细胞用体外转录的野生型（WT）和聚合酶空病毒的RNA。我们通过RT-qPCR的评估病毒检测基因组的复制。结果表明，野生型病毒复制的基因组中有效（ 图3A.......

Discussion

此图描述了用于分析丙型肝炎病毒复制循环的方法。丙型肝炎病毒是一种人类病原体和规定的生物安全议定书将必须严格遵守。感染性HCV细胞培养系统之前已经^11-13,16,17说明。有下列图示的协议，当我们实现几个关键点。首先，它是非常重要，以有完整的全长病毒基因组RNA质量好于下游的研究。输入质粒携带的病毒cDNA要进行线性化处理，并仔细减弱。的绿豆核酸酶来生硬的Xba I位悬是一种非特异性核酸酶和延长温育将导致病毒基因组的3'末端的损坏或退化。核酸酶已被指定的温育30分钟以酚 - 氯仿提取或阴离子交换柱纯化后，立即取出。凝胶提取核酸酶处理的DNA可能不会被推荐为酶是活跃在电泳过程。

体外转录RNA的后续步骤，一般，一会还采取广谱的预防措施，尽量减少核糖核酸酶（RNA酶）的污染。所有使用的试剂和材料应无RNA酶的。为了生成高质量的基因组RNA具有最小的RNA链的断裂，该RNA必须通过避免纯化和下游处理步骤中苛刻的涡流和反复移液经受更少的物理应力。 RNA转录完成后，将输入的质粒DNA模板具有从转录的RNA的混合通过DNA酶.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
杜尔贝科s 修改后的鹰's 培养基 （DMEM）	Fisher Scientific	10-017-CV
非必需氨基酸	Fisher Scientific	MT25025CI
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
Opti-MEM 还原血清培养基，无酚红	Life Technologies	11058-021
Huh-7.5.1	斯克里普斯研究所		该细胞系由 Francis Chisari 博士根据斯克里普斯研究所和 Cedars-Sinai 医学中心
质粒（pFNX-HCV、pFNX-HCV Pol null、pFNX-Rluc 和 pFNX-Rluc Pol null）	Cedars-Sinai 医学中心		HCV 质粒由 Arumugaswami 博士使用重叠的寡核苷酸合成。
XbaI	新英格兰生物实验室公司	R0145S
绿豆核酸酶	New England Biolabs Inc.	M0250S
T7 RiboMAX Express 大规模 RNA 生产系统	Promega	P1320
Rneasy 迷你试剂盒	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
电穿孔比色皿 （4 mm）	Bioexpress	E-5010-4
基因脉冲器 Xcell 总系统	Bio-Rad	165-2660
小鼠抗 dsRNA 单克隆抗体 J2	中文 &Scientific Consulting Kft.
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 488	Life Technologies	A11008
山羊抗兔 IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
PVDF 膜套装	Bio-Rad	162-0263
印迹级阻断剂 非脂奶粉	Bio-Rad	170-6404XTU
吐温-20	Bio-Rad	170-6531XTU
抗丙型肝炎病毒 NS3 抗体 [8 G-2]	Abcam	ab65407
抗丙型肝炎病毒 NS3 抗体 [H23]	Abcam	ab13830
羊抗小鼠 IgG 与辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联	杰克逊免疫研究实验室公司	115-035-003
Amersham ECL Prime 蛋白质印迹检测试剂	GE Healthcare 生命科学	RPN2236
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
含 ROX 的 SYBR QPCR SUPERMIX	Life Technologies	11744500
ViiA 7 实时荧光定量 PCR 系统	Life Technologies	NA
海肾荧光素酶检测系统试剂盒	Promega	E2810
无 RNase DNase	Promega	M6101
GloMax-Multi 检测系统（光度计）	普罗梅加