组织化学染色 拟南芥 次生细胞壁组分

摘要

植物细胞壁的组成因组织类型而异，可能包含木质素、纤维素、半纤维素和果胶。已有多种染色技术被开发用于在细胞类型水平上观察这些差异。本文汇编了常用的细胞壁染色技术。

摘要

Arabidopsis thaliana 是一种模式生物，常用于研究和调控植物中的多种细胞过程，在次生细胞壁形成的研究中被广泛使用。次生细胞壁的沉积发生在初生细胞壁构建完成之后，该过程仅由特定类型的特化细胞完成，例如导管和纤维组织中的细胞。大多数次生细胞壁由纤维素（40–50%）、半纤维素（25–30%）和木质素（20–30%）组成。已有多个影响次生细胞壁生物合成的突变体被分离获得，相应的突变体可能表现出明显的生化成分变化或可视表型，也可能不表现，因为这些突变效应可能被补偿性反应所掩盖。染色技术历来被用于在细胞水平上显示差异。这些方法完全是视觉分析手段，但其在快速而关键的分析中具有重要意义。刚果红和荧光增白剂 Calcofluor White 用于检测多糖，而 Mäule 染色和间苯三酚（phloroglucinol）染色常用于鉴定木质素的差异，甲苯胺蓝 O（toluidine blue O）则可用于对多糖和木质素进行差异染色。看似简单的切片、染色和成像技术，对初学者而言可能具有挑战性。本研究以 A. thaliana 为模型，从样品制备开始，详细描述了多种可轻松实施的染色方法，用于观察植物次生细胞壁中细胞和组织的结构与排列。

引言

植物细胞壁的各个组分中蕴含着大量信息，这些组分包括：木质素、纤维素、半纤维素（木聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖、混合连接葡聚糖或甘露葡聚糖）以及果胶。组织学技术在研究次生细胞壁在组织和细胞水平上的差异时，提供了重要的可视化线索。尽管文献中已开发出多种组织学技术，但对于初学者而言，这些技术往往具有挑战性且耗时，因为极少有提供详细步骤和简单图示说明的实验方案。本研究的目的是提供组织学染色技术的简易指南，以获得高质量的图像。

对茎组织进行切片是观察细胞壁和细胞形态的第一步。尽管徒手切片成本较低且制备时间较短，但使用振动切片机（vibratome）可提供更高的重复性，并获得高质量的图像。利用振动切片机能够生成厚度均匀的切片，从而提高数据质量，获得清晰的图像，并显著降低因样品制备不佳而导致样本间出现假性差异的风险。使用树脂固定新鲜样品对于初学者而言可能具有挑战性，即使对于专家，在需要快速完成分析时也可能耗时较长。此外，一旦样品被包埋在树脂中，便无法再检测其任何生物学活性。一种采用琼脂糖和自制模具的简易技术可用于茎组织的包埋，该方法也可应用于其他需要解剖软组织的实验场景。与树脂包埋法相比，该方法的优势在于能够保持组织的活性，并减少对样品的操作。通过振动切片机对组织进行切片具有高度精确性，可产生均一的切片，根据研究目的的不同，这些切片可进一步结合多种不同的染色技术进行使用。

可视化木质素及其他芳香族化合物的最简单方法是....

方案

1. 茎部包埋

1. 制备7%的琼脂糖水溶液（7 g电泳级琼脂ose溶于100 ml蒸馏水中）。通过高压灭菌20分钟或在最低功率下微波加热20分钟以溶解琼脂糖。例如，1,250 瓦功率的 10% 强度 微波炉）。
2. 使用塑料离心管制备用于包埋茎段的自制模具。
   1. 使用剃须刀片切下2 ml螺口离心管（A部分）的圆锥形底部。用注射器针头在管盖上穿刺一个孔，孔径略大于待包埋茎段的直径。接着，从0.6 ml离心管底部切下0.5 cm（B部分）。
   2. 将0.6 ml微量离心管预先切去0.5 cm的管段插入已切开的2 ml微量离心管中。用Parafilm密封两部分连接处。图1）。注意：需将管底剪掉，以便在琼脂糖凝固后取出包埋的样品。管盖上的孔有助于在将茎部包埋于琼脂糖中时固定茎部。模具用于承载琼脂糖，并在包埋过程中保持茎部直立。Parafilm 将用于固定 A 和 B 两部分，直至琼脂糖凝固且茎部完成包埋。
   3. 使用剃须刀片从目标区域切取一段茎组织，（例如 第一茎节间中段）。注意：理想情况下，应在包埋前立即切割茎组织，以避免因脱水造成损伤。 alternatively，可将茎暂时存放于含有经水浸湿的滤纸的培养皿中，并将培养皿置于冰上，直至准备包埋，以防止组织脱水和变形。若在无高湿度条件下存放超过30分钟，茎组织将会干燥。
3. 在微....

结果

茎段包埋与切片：
使用自制塑料模具将茎段包埋于7%琼脂糖中，操作快速且简便（图1）。包埋管系统的两个部分（A和B；图1）使得包埋在琼脂糖中的茎段易于释放，因为琼脂糖不会黏附到由惰性材料制成的管体部件上，从而保持系统清洁。这些管体可多年重复使用。包埋后茎段的储存也十分方便，有利于后续步骤的进行。为节省时间，可将相似的包埋茎段（最多3个）集中于同一张切片板上进行切片。

在紫外光下观察芳香族化合物：
将茎段置于载玻片上的蒸馏水中，在紫外光下进行观察。细胞中的芳香族化合物（包括木质素）可通过其在紫外光下的自发荧光进行可视化。木质部（Xy）和髓间纤维（Fi）在紫外光照射下显示出自发荧光，而髓部（Pi）、皮层或表皮（Ep）则无此现象（图2），原因是木质素作为一种芳香族聚合物，是在次生细胞壁生物合成过程中沉积形成的。在某些情况下，当植物在液泡中积累大量芳香族化合物（例如，花青素）时，可在皮层细胞中观察到荧光（数据未显示）。茎横切面在5X、10X、20X和40X放.......

讨论

A. thaliana 茎切片广泛用于研究次生细胞壁中细胞的排列结构，并对野生型与转基因植株之间的差异进行定性分析。常用的切片技术包括直接徒手切片；或者当样品包埋在琼脂糖或固定剂中时，可使用振动切片机或切片机进行切片。与徒手切片相比，后两种方法能够降低因样品厚度不均或表面不平整等制样不当所导致的假性差异风险。这些方法各有优缺点。我们选择将样品包埋于琼脂糖中，随后使用振动切片机进行切片，原因如下：琼脂糖包埋操作简便，处理时间短，无需对新鲜组织进行复杂的前处理。此外，我们自制的模具制作简单、成本低廉，能够固定茎秆保持笔直，可长期重复使用，并有助于样品轻松脱模而不造成混乱。溶解高浓度琼脂糖并获得均一溶液（如100 ml水中完全溶解7 g琼脂糖而不形成团块颗粒）的最佳方法是高压灭菌或以最低功率微波加热。茎组织应尽快新鲜切割，或 alternatively 将其置于冰上并用加水润湿的滤纸包裹的培养皿中保存，以防止组织脱水和变形。若茎组织在湿度不足的条件下存放超过30分钟，会导致茎秆干燥。在将茎包埋前，琼脂糖的温度应控制在约50 °C。琼脂糖倒入小瓶后必须检查是否存在气泡，因为气泡会在模具中形成空隙，从而导致切片不均匀。可在倾倒前.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	EMD	MERC2125	CAS 编号: 9012-36-6
间苯三酚	Sigma	P 3502	1,3,5-三羟基苯 [CAS 编号: 108-73-6]
盐酸	EMD	HX0603-75	CAS 编号: 7647-01-0
氢氧化铵	EMD	AX1303-6	CAS 编号: 1336-21-6
甲苯胺蓝 O	Sigma	T3260	布吕特蓝氯化物，甲苯胺氯化物 [CAS 编号 92-31-9]
高锰酸钾	Sigma	223468	CAS 编号 7722-64-7
190 证明乙醇	KOPTEC	V1401	CAS 编号: 64-17-5
刚果红	Sigma	C6277	二钠 3,3'-[[1,1'-联苯]-4,4'-二基双(偶氮)]双(4-氨基萘-1-磺酸盐) [CAS 编号 573-58-0]
荧光增白剂 28 / 卡尔科弗卢尔白染色剂	Sigma	F3543	4,4'-双[[4-[双(2-羟乙基)氨基]-6-苯胺基-1,3,5-三嗪-2-基]氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸 [CAS 编号 4404-43-7]
振动切片机	Leica	Leica 振动刀片切片机 VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/
剃刀	American Safety Razor 公司	货号 # 60-0139-0000	不锈钢双刃刀片（Personna Super）
螺帽微量离心管（2 ml）	VWR	16466-044
微量离心管（0.6 ml）	Axygen Scientific	MCT-060-C
隔热手套	Bel-Art	380000000	SCIENCEWARE  热手防护手套
组织粘合剂	Ted Pella 公司	10033	4 °C 或 20 °C 下保存 3 个月或更长时间
微波炉	Panasonic	NN-SD762S	PELCO Pro CA 44 即时组织粘合剂
无机械快门的 CCD 芯片相机	Hamamatsu	C4742-95
高速彩色相机	QImaging	MicroPublisher 5.0 RTV
相机软件	Molecular Devices	MetaMorph 版本 7.7.0.0
图像分析	Adobe	Photoshop CS4
方形显微盖玻片，1 号	VWR	48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8") — 盖玻片耐腐蚀，厚度均匀且平整。1 号厚度为 0.13 至 0.17 mm。
磨砂显微载玻片，1 mm	VWR	48312-003	75 x 25 mm - 1 mm
Parafilm M	Alcan 包装公司	BRNDPM998
TX2 滤光立方体	Leica	11513851/11513885	用于刚果红分析的滤光片，带通为 560/40。