生物层干涉测量的蛋白质 - 蛋白质相互作用和变构配体反应动力学的影响

摘要

这里的协议描述的蛋白质 - 蛋白质相互作用与生物层干涉动力学分析。 F型ATP合成酶，它参与了细胞的能量代谢，可通过在细菌中的ε亚基抑制。我们已经适应生物层干涉研究催化复杂的相互作用与ε的抑制C端结构域。

摘要

我们描述了使用生物层干涉的研究ε亚基的抑制的相互作用与大肠杆菌 ATP合酶的催化复杂。细菌F型ATP合酶 是一个新的，FDA批准的抗生素对抗耐药结核病的目标。由亚基ε的C-末端结构域理解菌特异性自动抑制ATP合酶可以提供一个新的方法对目标酶对发现的抗菌药物。 ε的C端结构域发生时的有效和无效状态，和催化位点的配体之间的转换酶能影响其中ε的构象主要是一个戏剧性的构象变化。 ε的绑定/解离与催化剂络合物，并间接MEA的检测措施，动力学SURES酶结合ε的移位，并从表面上nondissociable抑制性构象。生物层干涉测量信号不是过于敏感，溶液组合物，因此它也可以被用于监视的催化位点的配位体上的ε的构象变化的变构效应。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用是重要的，许多生物过程和无标记光学方法，如表面等离子体共振（SPR）已被用于在体外研究的结合和解离动力学^1。大多数无标记方法固定在传感器表面1的生物分子，并使用一个光信号，从溶液中检测结合配偶体，因为它与固定的生物分子¹相关联。而SPR是一种高度灵敏的方法，很容易产生干扰的变化导致流过传感器²的溶液的折射率。虽然不如SPR，生物层干涉测量（BLI）作为敏感较少受样本结构改变^1,3。 BLI使用具有在前端的专有生物相容性涂层光纤生物传感器。这里使用（八位-RED96）系统包含八个分光光度计。白光通过管道输送到某行上移动机械臂探头。光纤传感器ARË拾起探头和转移到含有样品96孔板。一种靶分子被固定在生物传感器表面。然后传感器被移动到包含在溶液中的结合配偶体的孔中。劳保局监察与固定化分子的结合合作伙伴的关联，然后移动传感器解决方案，而约束力的合作伙伴后，监控解离。分子结合到生物传感器表面导致其反射回分光光度仪从内部表面和从传感器和溶液之间的外部接口的光波之间的变化的光学干涉。这些变化中的干扰可以被量化，并用于确定结合和解离，总结在图1所示的动画动力学速率。

我们已申请BLI测量细菌ATP合酶的催化复杂，其ε亚基，它可以自动抑制酶之间的相互作用。 ATP学年nthase是膜嵌入旋转纳米发动机，其催化合成与ATP的水解^4。该催化复合物（F _1）可以分离的，因为可以作为一个ATP酶的可溶形式。亚基ε具有两个结构域:N-末端结构域（NTD）是必要的适当组件和所述酶的功能性偶联，但不直接与催化亚基相互作用;的C-末端结构域（CTD）可以通过与相互作用抑制酶多重催化亚基^5,6。这ε-介导的调控是针对细菌的ATP合成酶和线粒体同源没有观察到。 ATP合酶已经成为了抗菌药物的目标，如由bedaquiline治疗耐药结核病⁷近期FDA的批准。因此，靶向药物发现ε的抑菌作用可能产生抗菌素不抑制线粒体ATP合酶。与孤立的催化性复合物（F _1），ε成为一个可分离的亚基。然而，随着ε绑定到F _1，εCTD可经历戏剧性的构象变化，部分地插入到酶的中央空腔，并形成有抑制作用的状态是不太可能直接^6,8解离。我们使用BLI测量F ₁ /ε结合和解离动力学，间接，审查的催化位点配体对ε的构象变构效应。

在我们的系统中，ε自BLI信号（如SPR）被选择用于固定在传感器表面上是对分子的表面结合的质量敏感。 ε亚基是小（约15 kDa）的相对于所述主F ₁复合物（〜347 kDa）的。从而，一个更大的BLI信号将导致选自F ₁的结合固定化的ε。为了监测F ₁的解离，它可以是非常慢，ε必须被牢固地固定。因此，我们选择了生物素化以及它固定在链亲和素包被的生物传感器。蛋白质可以通过（i）随机修饰表面的赖氨酸⁹的，用生物素-马来酰亚胺试剂¹⁰或（iii）基因中加入特定的生物素受体 ​​肽，它是在酶促生物素化的独特的天然或改造的半胱氨酸（II）的反应是生物素化在标签的蛋白¹¹的体内表达。在我们的系统中，ε是用方法^（ⅲ）8生物素化。一旦生物素标记的ε固定在链霉亲和传感器，劳保局可以测量的结合和F ₁的解离已耗尽亚基ε（F _{1（-ε））}的。对于这里描述的实验中，初步试验已经完成，以确定合理的量的生物素化的蛋白质与固定在传感器上。这可以有所不同，这取决于蛋白质的分子量和其结合配偶体，但目标是确定的固定化蛋白质吨最小量帽子（i）提供可接受的信号与噪声的结合动力学与结合配偶体（下面_杀敌D）的低浓度和结合动力学与结合配偶体的附近的饱和浓度（ⅱ）最小的失真。此外，生物素化的化学计量可能会有所不同（但要避免> 1摩尔生物素/摩尔蛋白），所以一些初步的分析可能需要为每一批新的生物素化的蛋白质，以确认一致劳保局信号可以固定化过程中实现对链霉亲和涂层传感器。

方案

1。对仪器进行编程的BLI分析

打开仪器至少一小时提前让灯泡预热，这是必要的，以减少噪音和实验过程中漂移的光信号。通过仪器标签设定所需温度，以prewarm样品板支架。然后设置实验设计中的数据采集软件。在实验向导选项卡中选择"新建动力学实验"。这给那些必须在定义的所有步骤的选项卡式菜单。

1.1。板定义

定义列要在96孔样品板使用。指定列包含缓冲，固定蛋白质或约束力的合作伙伴。对于每个协会以及输入绑定的合作伙伴所使用的浓度。注意:在图2所示的板定义为具有不同的试验方案。

1.2。法定义

ontent">定义所需的检测的所有步骤。这些包括:（i）基线（若干），（二）装载，（三）协会和约束力的合作伙伴（四）解离，然后，如下所述，链接各个实验步骤，在样品板的孔中通过选择在相应的列中的检测步骤，然后双击之列。此方案的传感器就可以从孔中的一列在试验过程中移动到下一个。

1. 底线
   首先简要基线的步骤（≥60秒），并在测定缓冲液中的传感器（ 图2中 ，第1列），以建立初始BLI信号在96孔板中。
2. 中 （固定在传感器上的生物素化的蛋白质）
   向孔中，将含有生物素化的蛋白（ 图2，第2列），分配的传感器。使用阈值函数来实现的结合预定的水平（见简介）。设置阈值选项，这样所有的传感器将举d，来井的下一列时，传感器中的任何一个达到阈值。
3. 底线
   包含在缓冲区中的另一基线的步骤（ 图2，第3列;通常> 5分钟），以从传感器洗去未固定的生物素化的蛋白质，并建立新的，稳定的基线信号。对于基本的结合/解离测定仅（ 如图3），包括前协步骤与在缓冲液中的新井中的传感器一个额外的基线的步骤（60秒）（ 图2，第4栏）。
4. 协会 （绑定合作伙伴，固定化蛋白质）
   对于一个基本的结合/解离吸附测定（如在图3），选择的范围内结合配偶体的浓度以用于不同的传感器/孔（ 图2，第5列）。调整步骤的时间，使得至少一个饱和的结合配偶体的浓度应接近平衡结合信号。对于实验测试的小配体对蛋白质-蛋白质复合物（ 如图5）的解离变构效应，选择一个高浓度的具有约束力的合作伙伴（〜10倍以上，估计_杀敌D）在所有关联井使用。
5. 解离 （绑定合作伙伴）
   对于一个基本的结合/解离测定仅（ 如图3），指定该传感器返回到第4列（ 图2），作为用于协会之前的额外基线的相同缓冲液的孔中。对于一个测定测试的小配体的变构效应，而不是指定的传感器移动到第6列（ 图2），其中，每个孔可以包含缓冲液加不同的变构配体。

1.3。传感器分配

表明在传感器托盘将包含预湿传感器，用于测定的位置。识别任何空位置，因为该实验将辉l如果没有传感器被拾起。

1.4。回顾实验

可视化所有计划的步骤来检查错误并返回到纠正。

1.5。运行试验

输入必要的细节，包括数据文件的位置。输入的实验所需的温度。如果传感器仍需要预湿，选择延迟在实验开始的选项。最后，当所有的样品制备完成后（步骤2），这两个样品板和传感器托盘在仪器被加载，点击Go按钮来运行检测。

2。样品制备

1. 准备一个合适的分析缓冲液。缓冲器用于在图3和图5所示的实验:20mM的MOPS（3 - （N-吗啉）丙磺酸），Tris（三（羟甲基）氨基甲烷）（加入以调节pH至8.0），50mM的氯化钾。包含BSA（牛血清白蛋白，脂肪酸游离，0.5mg / ml的终浓度）在缓冲液中的所有测定法的步骤和对生物素化的蛋白或结合配偶体，以尽量减少蛋白的非特异性结合到传感器的所有稀释液。
2. 在测定缓冲液中稀释的生物素化的蛋白质（ε），以适当的浓度（参见引言）。
3. 准备结合合作伙伴（F _{1（-ε））}的分析缓冲液（见讨论的浓度使用范围）的稀释液。
4. 预湿的链亲和素包被的传感器，至少10分钟，以去除其保护蔗糖涂层。从传感器托盘中取出传感器内置型架以及在托盘的底部插入一个96孔板中，在托盘上滑动的板的一个角向定向槽口。对于要使用的传感器的列中，在96孔板中的该列中添加200微升测定缓冲液，每孔。返回传感器的机架在正确的方向托盘（带选项卡的插槽）。
5. 如步骤1在编程过程中分配，填写井ØF中的样品板与测定缓冲液中或相应的蛋白稀释液，如在图2中 。避免引入气泡，因为它们会导致噪音的光信号中。包括一个或多​​个基准井省略或者（i）生物素化的蛋白质或（ii）结合配偶体。
6. 打开仪器的门，将传感器托盘走上舞台（左），与插入的阶段插槽托盘的标签。插入样品板到所述板支架（右）;确保板落座平面和以正确的方向，作为该板夹持器上表示。关上门，从数据采集程序（步骤1.5）开始检测。

3。数据处理

1. 该试验运行后，打开数据分析软件，并加载包含数据的文件夹。点击"处理"选项卡中看到一个逐步处理菜单（左）和原始动力学数据，每个传感器（AH）分配不同的颜色（参见图3）。
2. 在"数据选择"，点击"传感器选择"按钮。在"样品板图"，指定为参考井的井为1或2控制传感器（G，H在图3的分析）。在Processing菜单，勾选"减法"框中，选择"参考井"，从每一个其他传感器的信号中减去参考信号（单个或平均值）。
3. 通过使用"对齐Y轴"步骤中的所有痕迹对齐到Y = 0。选择"基线"作为对准步骤（这是之前的关联步骤的最后底线）。对于"时间范围"，进入最后10秒的基线（ 即 50〜60秒，60秒的基线， 如图三 ）。
4. 勾选"跨一步修正"框，以尽量减少该协会与解离步骤之间的信号变化。选择对齐基线或解离。
5. 在大多数情况下，选择Savitzky-Golay滤波功能，然后单击"进程的数据！"以继续。目视检查最终处理的数据（右下图）。随着检测用于全局数据分析（ 如图4），如果信号迹线显示协会及分解步骤之间有显著转变，改变解离或基线为"跨一步修正"的评选，并进行到以前的数据重新处理数据分析。

4。数据分析

点击"分析"选项卡中数据分析开始。注意:下面的例子中的步骤是对多个结合/解离曲线全局分析（ 如图3）。

1. 对于"步骤来分析"，选择结合和解离。为"Model"，选择1:1。注:其他有限选项可供选择。
2. 对于"拟合"，选择环球（完整版）。对于"分组依据"中选择颜色（如在图上）。选择"R _最大未链接到传感器"，让R _最大的独立配件（饱和后面值的约束性最大的信号响应tner与固定化的蛋白）。注:我们这样做对大多数检测，如传感器略有不同蛋白质的固定化量（ 见图3，加载）。
3. 上所示的表，确保所有传感器的痕迹进行分析具有相同的颜色，所以他们会作为一个全球性集进行分析。如果需要，选择一个或多个传感器的痕迹，从全局拟合省略:在"包含"一栏，所需的传感器位置单击鼠标右键，选择"排除井"。
4. 点击"拟合曲线"！启动非线性回归分析。检查拟合结果，其中包括与传感器的数据痕迹回归曲线（ⅰ）的覆盖（ 如图4），（ⅱ）重复拟合的残差，以及（iii）与所确定的参数值（速率常数，R _最大的表， _杀敌D）和统计（参数标准误差，卡方检验，R ^2）。
5. 在"数据导出"，单击"导出表到。csv文件"拯救拟合结果。对于GRAP兴或与其他软件的数据/拟合曲线进一步分析，单击"导出拟合结果"来保存每个传感器的数据和拟合曲线在一个文本文件中。

结果

实时结合和解离劳保局动力学如图3所示。这个实验是在结合和解离与分析缓冲液进行。该实验开始10分钟基线的步骤，因为这些传感器已被预先润湿仅简要介绍。接着，生物素化的ε被加载在传感器上。 ε中没有检测到发生解离整个从参考曲线（G）因无约束力的合作伙伴加入所看到的所有剩余的步骤。第二个参考传感器（H）为缺乏固定的蛋白质，呈现出结合合作伙伴的低非特异性结合。不同浓度的传真_:1（-ε）被用于对自动对焦感应器的关联步骤，以适应全球范围内的结果，并得到_K A，K _d和杀敌的最佳值。结果被处理为在协议中，得到的数据轨迹（蓝色）在图4中。在这种情况下，基准传感器迹H是得自样品TR减去高手在校正结合伴侣和系统信号漂移的非特异性结合。在数据分析的步骤，所有的曲线都适合全球使用1:1模式（单K _A，单个K _D）"全球（完整版）"适合承担具有约束力的合作伙伴完全解离（信号将返回到零上无限时间）（ 图4中 ，红色）。需要注意的是，与F _{1（-ε）...}

讨论

对于BLI目前可用的工具允许用于检测生物分子相互作用显著吞吐量和灵活性。各种溶液的样品被分配在一个黑色微量滴定板的孔中，和一组平行的BLI传感器被编程以来回移动孔在板的列之间。将样品通过轨道振荡整个测定搅拌。这里所使用的系统具有8个传感器，并且使用96孔样品盘，但另一个系统采用16个传感器和一个384孔的样品板。因此，一个传感器固定化的生物分子，并在溶液中的结合配偶体之间的相互作用可以在不同的条件下，在平行的多个传感器下进行测试。例如，在这里提出与固定的抑制ε亚基的第一个试验中，相互作用的测量与六种不同浓度的酶（结合配偶体）的平行（ 图3和4）。这使得一个全球性的分析，以determiNE一对速率常数（K _{A，K d）}就净约束力和分解，从而平衡解离常数（K _D = K _D / K _一 ），这与抑制常数密切同意（K _I）由下式确定酶抑制^ε8的解决方案分析。第二种类型的实验（ 图5）表明，BLI还可以监视的小配...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Octet-RED96	Pall/FortéBio	30-5048
牛血清白蛋白	Sigma	A6003-10G	无脂肪酸
生物传感器/链霉亲和素	Pall/FortéBio	18-5019	托盘 96 个传感器
微量滴定板	Greiner Bio-one	655209	黑色，聚丙烯
数据采集软件	Pall/FortéBio	版本 6.4	可用较新版本
数据分析软件	Pall/FortéBio	版本 6.4	提供更新的版本