烟草树与杨树作为生物基产业原料的转录组与代谢物谱分析

摘要

植物生物质是一种可再生资源，可用于生产多种产品，包括燃料、饲料、食品以及各种材料。本文研究了烟草树（Nicotiana glauca）和杨树作为生物炼制工艺路线的适宜原料的特性。

摘要

全球对食品、饲料、能源和水资源日益增长的需求，给未来几代人带来了前所未有的挑战。显然，必须建立强有力的平台以探索可再生资源，方能应对这些挑战。在多国合作项目MultiBioPro的框架下，我们正在开发生物炼制工艺管线，以最大化利用植物生物质。更具体而言，我们以杨树和烟草树（Nicotiana glauca）作为目标作物物种，旨在提高其糖化效率、异戊二烯含量、长链烃含量、纤维质量以及木栓质和木质素含量。获取上述结果所采用的方法包括气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）以及RNA测序平台。代谢物分析管线是生成此类数据的成熟工具，但其局限性在于仅能检测已明确表征的代谢物。深度测序技术将使我们能够涵盖烟草树叶片发育各阶段存在的全部转录本，但需将其回贴至Nicotiana tabacum的基因组序列。通过上述研究体系，我们旨在深入理解相关生物学过程的基础机制，并建立可将研究成果产业化的技术框架。从更长远的角度来看，我们相信本研究所产生的数据将为以杨树和烟草树为原料的可持续生物炼制工艺提供科学依据和技术支持。截至目前，样本中代谢物的基础水平已得到分析，本文提供了所使用的技术方案与实验流程。

引言

人口和经济增长导致对食物、水和燃料的需求日益增加。这些资源的生产、加工和运输在很大程度上依赖石油等有限的化石资源。然而，显然这种做法不可持续，因此开发替代资源将具有重要意义¹。目前，风能、水流动能、太阳能、地热能和波浪能等多种可再生资源已在不同程度上得到开发利用。另一种可持续但尚未充分开发的资源是植物生物质。该资源还提供了一种将太阳能高效转化为燃料的低成本途径²。除了提供生物基燃料外，植物生物质还为生产塑料、洗涤剂和高价值化学品等替代产品提供了独特的机会。

植物细胞壁主要由基于糖的聚合物构成，占据了植物生物量的大部分，目前人们正投入大量努力以实现其向生物乙醇的高效转化。剩余的生物量随后可进一步加工为沼气和与油相关的产品³。许多多年生植物物种，包括禾草类和树木，能够产生大量纤维素类生物量，通常在温带地区生长最佳。然而，约有20%的陆地面积属于半干旱地区，因此容易遭受干旱影响⁴。显然，若能在这些干旱土地上种植能够有效促进能源和材料可持续生产的植物，将具有重要意义。这类植物需要具备最优的水分利用效率和抗旱能力，其中包括烟草树（Nicotiana glauca）以及龙舌兰属（Agave）的物种。

MultiBioPro 联盟旨在利用两种重要的作物物种——杨树和烟草树，建立一个集成的生物炼制工艺流程。杨树作为一种有前景的生物燃料作物，因其生长迅速、易于无性繁殖，并且对广泛的气候和土壤条件具有高度适应性而受到关注。此外，它还能提供多种木材、纤维、薪柴及其他林产品⁵。烟草树也被认为是适用于生物燃料和生物炼制的适宜植物。它通常能产生大量生物质，含有丰富的非结构性碳水化合物⁶，并且具有罕见的能力，可积累大量易于提取的非食用油类（包括长链饱和烃 C₂₉-C₃₁ 及三萜类化合物），这些成分适合用于生物柴油的生产。此外，烟草树易于进行遗传改良，萌芽能力强，能够在不适合粮食生产的半干旱土壤上良好生长。因此，杨树和烟草树均显示出作为多用途作物的内在潜力，即作为整合性生物基产业的新一代高价值原料。本文重点探讨一系列不同的研究方法，以阐明烟草树如何沉积长链烃类物质。

为了鉴定烟草叶片上饱和长链烃类物质生成与分泌的潜在分子机制，我们采用了基于现代“组学”的技术手段。这包括对发育过程中的叶片系列（十个阶段）进行RNA测序，以及利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）进行多平台代谢物谱型分析（用于极性与非极性代谢物及脂质组学分析）。这些数据将用于挖掘与上述分子生物合成启动相关或先于其发生的基因表达模式。通过上述研究筛选出的有潜力的基因和代谢通路，将在模式物种拟南芥中进行功能验证，并最终有望应用于烟草树的生物技术工程改造。

方案

1. 植物材料

培养 尼古丁烟草（Nicotiana glauca） 直径30厘米花盆中种植的植物，使用M2专业栽培基质。 在温室中种植植物，白天温度控制在20-25 °C，夜间温度为15 °C。采用16小时光照和8小时黑暗的补光周期。

2. 样品制备

1. 初级代谢物提取：
   1. 采集植物材料（N. glauca 的叶片和茎），并立即冷冻。
   2. 将冷冻的植物材料进行冷冻干燥，持续三天。
   3. 使用球磨仪配合金属球研磨冻干样品。
   4. 将研磨后的细粉状干燥材料分装至 2 ml 离心管或玻璃小瓶中。
2. 次级代谢物提取：
   1. 采集植物组织，并立即冷冻。
   2. 使用球磨仪配合不锈钢球或研钵与研杵研磨冷冻的植物组织。
   3. 将研磨后的细粉状组织分装至 2 ml 离心管中（约 20 mg 湿重）。

3. 采用气相色谱-质谱法进行初级代谢物代谢谱分析的提取方案

1. 将研磨后的干燥植物材料（10 mg 叶片和 20 mg 茎组织）分装至 2 ml 带螺旋盖的圆底离心管中。
2. 加入 1,400 µl 100% 甲醇，涡旋振荡 10 秒。
3. 加入60 µl核糖醇（0.2 mg/ml溶于H₂O）作为内参定量标准，涡旋10秒。
4. 加入一个不锈钢（或氧化锆）研磨珠，使用混合球磨机以25 Hz频率研磨2分钟。
5. 将混合物在11,000 × g条件下离心10分钟。
6. 将上清液转移至玻璃小瓶中。
7. 加入 750 µl 氯仿。
8. 加入 1,500 µl 的 H₂O，并涡旋混合10秒。
9. 将150 µl上层相（极性相）转移至新的1.5 ml离心管中。
10. 使用真空浓缩仪干燥样品。必须将样品干燥3至24小时，直至无任何残留液体。
11. 加入40 µl甲氧胺盐酸盐（20 mg/ml，溶于吡啶）。
12. 在37 °C下，于水平加热块摇床中振荡混合物2小时。
13. 加入 70 µl N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺 MSTFA 混合物
14. 在37 °C下振荡混合物2小时。
15. 通过短时离心沉淀盖玻片上的液滴，约 11,000 x g 离心 1 分钟。
16. 将液体转移至适用于气相色谱-质谱分析的玻璃小瓶中。

4. 通过液相色谱-质谱法进行次级代谢物代谢谱分析的提取

1. 向冷冻的研磨样品中加入 500 µl 甲醇。
2. 在 70 °C 条件下使用恒温混匀仪振荡 15 分钟（1,000 sec^-1）。
3. 将样品离心（5 分钟，20,000 x g），并转移液相至 1.5 ml 离心管中。
4. 使用离心浓缩仪（speedvac）对液相进行冻干。
5. 向干燥的沉淀物中加入 100 µl 环己烷和 100 µl milliQ 水。
6. 在室温下振荡样品 5 分钟（使用涡旋振荡器）。
7. 将样品离心（5 分钟，20,000 x g）。
8. 取 80 µl 水相（下层相）转移至带有锥形底的 LC-MS 进样瓶中，用于 LC-MS 分析。

5. 数据分析

1. 配置 Xcalibur、MarkerLynx、Metalign⁷ 或 XCMS⁸，并选择待处理的数据分析方法。
2. 根据表1中的化合物类别，整理出目标检测峰的表格。
3. 通过标准品的共洗脱来鉴定峰。
4. 随后利用 MSn 分析、结构表征算法^9,10、文献调研以及代谢物数据库检索^11,12对检测到的峰进行注释。

6. 烃类提取¹³

1. 将新鲜采收的 N. glauca 叶片（约 200 mg）浸入溶剂（甲醇、乙醇、氯仿、正己烷或石油醚（沸程 40-60 °C 或 60-80 °C））（5 ml；HPLC 级）中，浸泡 2 至 20 分钟。
2. 取出叶片，并通过旋转蒸发完全除去溶剂。
3. 将样品重新悬浮于正己烷（1 ml；HPLC 级）中。
4. 使用气相色谱仪联用 5973MSD 进行 GC-MS 分析。操作条件如下：载气为氦气，流速为 0.9 ml min^-1/11 psi。在 280 °C 下使用不分流进样器进样（1 µl）。气相色谱柱温箱初始温度保持在 70 °C，维持 5 分钟，随后以 4 °C/min 的升温速率升至 320 °C，最终温度保持 10 分钟，总运行时间为 67.5 分钟。质谱接口温度设为 280 °C，采用 70 eV 电子轰击电离正离子模式（EI+）进行全扫描，质荷比扫描范围为 10 至 800 D。
5. 首先通过自动质谱解卷积与鉴定系统处理色谱峰组分，并利用 NIST 98 质谱库进行化合物鉴定。
6. 通过与已知标准品的保留时间和典型裂解模式比对，确认饱和长链烷烃（二十六醇、二十九烷、三十烷、二十八醇、二十九醛、三十一烷、三十二烷和三十三烷）的鉴定结果。
7. 通过将积分峰面积与由标准品建立的剂量响应曲线（0.07 至 2.5 mg）进行比较，定量测定烃类含量。
8. 使用 Excel 软件计算均值及均值标准误（SEM）。

7. 异戊二烯类化合物的分析¹⁴

1. 按照第2节所述进行匀浆。称取10 mg冻干匀浆粉末，放入离心管中。
2. 依次向粉末中加入250 µL甲醇，混匀，然后加入500 µL氯仿（分析纯），并通过涡旋混合。
3. 将样品置于冰上避光静置20分钟。
4. 向悬浮液中加入250 µL Tris-HCl缓冲液（100 mM，pH 7.5）或水（HPLC级），并通过涡旋混合。
5. 将混合物在12,000 rpm（13,523 × g）下离心5分钟，以分离非极性相和水相。含有类异戊二烯提取物的非极性氯仿相位于底部。
6. 将下层相转移至新的离心管中。
7. 向水相中再加入500 µL氯仿，按上述方法通过涡旋和离心进行第二次提取。
8. 合并氯仿提取液，并使用蒸发仪将样品完全干燥，于-20 °C保存直至分析。
9. 向干燥的类异戊二烯提取物中加入50 µL乙酸乙酯（HPLC级），重新溶解样品。
10. 使用UPLC Acquity分离模块，将3 µL样品注入C18色谱柱。用于分离色素的梯度条件如下：A相为甲醇/H₂O（50:50），B相为乙腈/乙酸乙酯（75:25）；初始条件为A相30%（v/v），B相70%（v/v），在6分钟内线性梯度升至100% B相。流速设为0.6 mL/min。
11. 使用光电二极管阵列（PDA）检测器对洗脱液进行连续监测，波长范围为250至600 nm。
12. 通过与标准品共色谱及光谱比对来鉴定组分，标准品包括β-胡萝卜素（维生素A原）、番茄红素、叶黄素和玉米黄质。
13. 根据剂量-响应曲线进行定量分析。
14. 使用LC-MS确认化合物；采用相似的色谱条件。检测使用APCI电离源，正离子模式，仪器为Q-Tof。
15. 进行生育酚测定时，使用25 mg冻干材料，经提取后在50 °C条件下用6% KOH进行皂化处理1.5小时。

8. 用于RNA测序的RNA提取

本方案结合Trizol RNA提取与RNeasy试剂盒，以获得高质量RNA。

1. 使用金属球在2 ml离心管中通过混合研磨机研磨100 mg冷冻植物材料。
2. 加入1 ml Trizol。
3. 在4 °C条件下，以12,000 × g离心10分钟。
4. 将上清液转移至新的反应管中。
5. 加入200 µl氯仿，反复倒置管子数次，并在室温下孵育3分钟。
6. 在4 °C条件下，以12,000 × g离心混合物15分钟。
7. 将上层水相（约700 µl）转移至新的反应管中。
8. 加入约2.5倍体积的乙醇（100%），反复倒置管子数次，并在-80 °C下孵育30分钟。
9. 将样品（包括任何沉淀）转移至试剂盒中的离心柱中。
10. 以8,000 × g离心柱15秒，并弃去穿流液。
11. 向离心柱中加入700 µl RW1缓冲液，以8,000 × g离心15秒，弃去穿流液。
12. 向离心柱中加入500 µl RPE缓冲液，以8,000 × g离心15秒，弃去穿流液。
13. 向离心柱中加入500 µl RPE缓冲液，以8,000 × g离心2分钟。
14. 将离心柱放入新的1.5 ml反应管中，加入50 µl无RNase的水。
15. 以8,000 × g离心1分钟以洗脱RNA。
16. 根据制造商说明书，使用Ambion DNA-free试剂盒去除残留DNA。
17. 测定RNA质量。RNA的完整性数值（RIN）应高于8。
18. 将RNA送样进行下一代测序。

结果

图1中的高效液相色谱（HPLC）图谱展示了N. glauca叶片提取物中类异戊二烯分析的代表性结果。使用光电二极管阵列（PDA）检测器检测到C40及以上不同类异戊二烯化合物。色谱峰的注释基于与标准品（包括β-胡萝卜素（维生素A原）、番茄红素、叶黄素和玉米黄质）的共洗脱及光谱比对结果。图2中的两个质谱（MS）色谱图分别展示了来自N. glauca叶片和茎组织的初级代谢物分析结果。图中还以丝氨酸对应的峰（用箭头标示）为例，展示了其质谱图。图3展示了用于评估RNA质量的生物分析仪及其代表性输出结果。色谱图中对应于18 S和25 S核糖体RNA的两个主峰表明样品中的RNA保持完整；若RNA发生部分或严重降解，则会出现额外的核糖体RNA降解片段峰。

图1. HPLC图谱显示N. glauca叶片提取物中存在的异戊二烯类化合物。 大多数C40及以上异戊二烯类化合物不适合进行GC-MS分析。因此，我们采用带有光电二极管阵列检测器的HPLC分离方法。图中显示的是在450 nm处记录的典型色谱图。这些类胡萝卜素色素是光合组织的典型成分，其中以叶黄素为主。此外还含有玉米黄质，这种成分在叶片组织中通常很少见，除非植物处于高光强胁迫条件下。该样品中玉米黄质的含量使其成为这种高价值化合物的良好来源。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2. N. glauca 组织提取物的质谱色谱图与质谱图。 展示了通过气相色谱-质谱法（GC-MS）测定的叶片和茎提取物的总离子流色谱图（TIC，70–600 m/z）。GC-MS 分析按先前所述方法进行¹⁵。使用质谱标签文库对检测到的峰进行注释。图中以丝氨酸（2TMS）的质谱图为例。质谱色谱图：X 轴和 Y 轴分别表示保留时间（min）和信号强度（丰度）；质谱图：X 轴和 Y 轴分别表示质荷比（M/Z）和信号强度（丰度）。点击此处查看高清图像。

图3. 用于N. glauca叶片材料RNA测序的RNA样品的Bioanalyzer检测结果。 为获得RNA测序所需的高纯度RNA，我们使用Trizol试剂提取RNA，随后利用RNeasy Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国）中的柱子对RNA进行纯化。我们使用Bioanalyzer（Agilent，Waldbronn，德国）测定RNA质量，其检测界面显示在左侧，右侧为一个典型的Bioanalyzer输出示例。样品中的两个主要峰代表18 S和25 S核糖体RNA。我们的样品RNA完整性数值（RIN）为9.2，远高于所需的最低值8。点击此处查看大图。

讨论

本文所述的实验方案为分析烟草树叶中的代谢物和转录本提供了一个全面的框架。预计这些综合研究手段将使我们对这类组织中碳氢化合物及高价值化合物的合成与分泌过程有新的认识。因此，这些方法应能帮助我们更深入地理解这些化合物的合成机制。除了针对烟草树的研究外，本工作还旨在改良杨树的生物量，特别是针对次生细胞壁结构的木质化过程，同时也探索是否可利用树皮提取有价值的化合物。

本文所述方法是对标准化代谢物分析方法的轻微改进。这些方法当然仅限于已知的代谢谱，且有可能获得若干新的代谢峰，而这些代谢峰所对应的化合物尚不明确。我们希望通过整合代谢物和转录本在发育时间序列中的变化行为，将这些化合物与其他代谢物关联起来进行分析。

本文所介绍的方法与植物材料常规使用的方法相比并无显著改变。其关键之处在于多种方法的组合应用，以解析烟草树叶中长链烃类物质生成与修饰的基本框架。获取此类信息的关键步骤之一，是后续对不同类型数据的整合分析。我们预计，初步分析将根据代谢物/转录本在发育过程中的变化模式，将数据划分为不同的聚类，并利用这些数据推断转录本与代谢物之间的行为关系，同时有可能将特定代谢物归入相应的代谢通路。此外，还计划开展更复杂的基于网络的分析，以挖掘其中的因果关系。

本文所述的分析方案还将为生物质的田间试验和工业开发提供基础。为此，MultiBioPro 联盟包含多家具备进一步开发生物质能力的工业合作伙伴，旨在生产生物柴油、生物乙醇及其他高价值化合物。此类生物质开发利用将基于以下方面进行评估：（1）测试所生产生物产品的稳定性和质量（将开展典型的工业标准测试，以确保所生成产品具备良好的市场价值）；（2）利用文献资料、访谈以及田间试验和中试工厂生物炼制评估过程中产生的材料，对相关技术进行经济、社会和环境影响评价。这些工作将包括成本效益分析和生命周期分析、环境档案编制，以及市场与商业策略制定。我们相信，该技术路线将成为学术界、应用科学与工业开发的有效结合，进一步推动杨树和烟草树生物质在消费终端产品中的应用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Trizol 试剂	Invitrogen	15596-026
氯仿	Merck	102445
乙醇	Merck	101986
RNeasy Mini 试剂盒	Qiagen	74104
TURBO DNase	Invitrogen	AM2238
RNA 6000 Nano 试剂盒	Agilent	G2938-90034
2100 电泳生物分析仪	Agilent	G2939AA
1.5 ml 和 2 ml 安全锁扣管	Eppendorf	0030 120.086, 0030 120.094
钢珠	Geyer Berlin GmbH	VA2mm
混合研磨仪 MM 300	Retsch	YO-04182-09
微量离心机	Eppendorf	5424