描述了用于植物提取物薄层色谱（TLC）分离及接触生物自显影以鉴定抗菌代谢物的方法。这些方法应用于筛选抑制高活性的红三叶草酚类化合物 牛瘤胃中固有的产氨细菌（HAB）。
本文内容
摘要
摘要
一种常见的植物抗菌化合物筛选方法是通过纸层析法或薄层层析法（PC 或 TLC）分离植物提取物，将层析图谱暴露于微生物悬液（例如 液体培养基或琼脂中的真菌或细菌）中，在湿润环境中孵育以允许微生物生长，随后观察无微生物生长的区域。 这种被称为生物自显影的筛选方法的有效性，取决于层析分离的质量以及微生物培养条件的控制。 本文描述了用于薄层层析和接触式生物自显影的标准操作流程 ，并将其新颖地应用于氨基酸发酵细菌的检测。提取物在柔性（铝箔背衬）硅胶薄层层析板上分离，并在紫外（UV）光下观察条带。 将显示条带的区域剪下，倒置贴于接种了测试微生物的琼脂平板上进行孵育。 通过四氮唑红染色琼脂平板以显现出具有抑制作用的条带。 该方法应用于红三叶草（Trifolium pratense cv. Kenland）酚类化合物的分离，并筛选其对Clostridium sticklandii的抑制活性；后者是一种产高浓度氨的细菌（HAB），天然存在于牛瘤胃中。 该薄层层析方法适用于多种类型的植物提取物 ，若适当调整培养条件以满足不同物种的生长需求，则可将其他细菌种类（需氧或厌氧）以及真菌作为测试生物使用。
引言
检测植物中的抗菌化合物需要分离植物提取物的组分，将测试微生物暴露于这些组分，并确定微生物的生长是否受到任何化合物的抑制。纸层析或薄层层析（PC 或 TLC）分离方法较为便捷，因为多种化合物可在平面载体上实现分离。分离基于极性差异，某些化合物会紧密吸附于吸附剂上（PC 中为纤维素，TLC 中则为多种吸附剂），迁移距离较短1。图1展示了酚类化合物在硅胶薄层层析板上分离后，极性与非极性化合物相对位置的示例。
图1. 硅胶薄层色谱（TLC）板上不同极性化合物分离后分布示意图。 以红车轴草（Trifolium pratense L.）中的酚类化合物为例。极性化合物（如克罗沃酰胺）对极性吸附剂（如硅胶）具有较强亲和力，因而停留在原点（O....
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方案
1. 植物提取物的制备
- 参见 Kagan 和 Flythe10 用于从 红车轴草 品种肯兰德
- 要提取其他植物中的化合物，请查阅植物化学分析文献中针对特定植物或代谢物的提取方法（已有大量方法被描述），或参考Khurram等人提供的相关实验方案。 等7,8 哪一个 分离多种具有广泛极性的化合物。
2. 薄层板的制备
- 使用一种或多种极性中性溶剂展开薄层色谱板，以将吸附的污染物从展开区域移除，从而清洁薄层色谱板。
- 在通风橱中，准备足量的清洗溶剂（例如 在薄层色谱展开室底部加入15-100 ml体积比为2:1的乙酸乙酯-甲醇溶液，以浸没置于室内的薄层色谱板的底边。
- 使用市售的玻璃薄层色谱展开槽（有不同尺寸，带盖）或铝箔包裹的派热克斯烧杯或广口瓶。
- 使用剪刀裁剪铝箔或塑料背衬（柔性）硅胶板，这些硅胶板有多种尺寸（20 cm × 20 cm 及更小的尺寸），以适配现有的展开室。（注意： 二氧化硅吸入后可能对肺部造成损伤。应在通风橱中操作，并戴手套处理薄层色谱板，以避免皮肤油脂污染二氧化硅。
- 将培养板插入培养 chamber 中，板的顶部靠在 chamber 的壁上。 培养....
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结果
红三叶草的代表性硅胶薄层色谱分离Trifolium pratense cv. Kenland）提取物（含酚类化合物）如图所示 图2. 在乙酸乙酯-正己烷（9:1，v/v）体系中对红三叶草提取物进行分离，展开8.5 cm，得到五个条带，其中一个条带在原点处未完全分离图 2A）。然而， 图2B 表明，当使用红三叶草提取物的另一样品（来自同一品种，但在同一家农场的不同地块种植）进行分离时，若分离距离更长（15 cm 而非 8.5 cm），并采用两种不同的溶剂系统连续展开，则显示出的条带数量约为之前的两倍。该色谱图的 图2B 首先在乙酸乙酯-正己烷（9:1，v/v）体系中展开，随后干燥并用乙酸乙酯-甲醇（78:22，v/v）体系进行分离。这些结果表明，薄层色谱板的尺寸以及溶剂系统（或一系列溶剂系统）的选择均会影响色谱图上分离出的化合物数量。在本案例中，通过对同一提取物的其他薄层色谱分离条带进行洗脱及高效液相色谱（HPLC）分析证实，滞留于原点或靠近原点的化合物主要为与极性基团（如氨基酸衍生物、.......
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讨论
本方案描述了一种将提取物分离为不同化合物组分，并通过接触式生物自显影法对这些组分进行活性检测的简便方法。 该方法与Chomnawang 等15用于筛选抑制淋病致病菌的植物代谢产物的方法非常相似。用于筛选植物抗菌化合物的生物自显影类型取决于多种因素，包括测试微生物、实验室条件以及进行生物测定人员的偏好。 本研究所采用的接触式生物自显影法曾受到批评，因其依赖于化合物向接种培养基中扩散的能力12。 在低浓度下或扩散能力较弱的化合物周围可能无法观察到抑菌圈，特别是当在扩散物下方的琼脂中仍发生微生物生长时。 此外，某一色带产生的抑菌圈可能超出其初始边界，从而可能掩盖邻近化合物所产生的抑菌区域14。然而，接触式生物自显影法操作简便，且培养皿可堆叠放置，节省空间。 此外，将薄层色谱（TLC）色带直接贴于琼脂表面，可避免将TLC板覆盖接种琼脂或喷洒测试微生物时可能出现的色带溶解和扩散问题。
获取上述任何类型生物自显影的信息均依赖于色谱条件、测试微生物的浓度以及培养/.......
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披露
文中提及的商标名称或商业产品仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部（USDA）推荐或认可这些产品。作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢已故的肯塔基大学植物与土壤科学系诺姆·泰勒（Norm Taylor）博士，允许我们使用他红三叶草试验地块的样品进行本研究。本项目由美国农业部资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 硅胶 F254 TLC 板，铝背板，厚度 0.2 mm，尺寸 20 cm × 20 cm | EMD Chemicals | 5554/7 | 这些板涂有在 254 nm 处发出荧光的指示剂硅胶。 在荧光绿色背景下，吸收该波长的化合物呈现暗色。 其他可选供应商包括 Analtech、Selecto Scientific、Fluka。 可能需要使用除硅胶以外的吸附剂。 根据所用溶剂的不同，塑料背板板也可能适用。 |
| 锋利的重型剪刀 | 任意缝纫用品公司 | 类似于 Fiskars 175800-1002 | 用于切割 TLC 板。 也可使用带有锋利刀片的纸张切割器。 切勿吸入硅胶粉尘。 |
| 100 °C 的干燥烘箱（机械对流） | Thermo Scientific | PR305225M | Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com)；Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com) |
| TLC 展开槽 | Kimble Chase | 416180-0000 | 其他可选来源： Aldrich。Pyrex 烧杯或广口瓶可用于小尺寸板（例如 5 cm × 10 cm）。 用铝箔覆盖（罐盖可能含有可被溶剂蒸气萃取的材料）。 |
| 50 µl 带平头针头的注射器 | Hamilton | 80965 | 用于加样量超过 5–10 µl 的标准品或样品。 其他供应商产品等效。 |
| 微量移液器 | Drummond | 2-000-001 | 用于加样少量标准品或样品。 其他可选来源： VWR。 此外，也可用本生灯加热拉伸巴斯德移液管，使其直径更细。 |
| 滤纸（#1 级） | Whatman | 1001 917 | 用作展开槽中的吸水芯。 其他级别的滤纸也可使用。 此尺寸可根据容纳 20 cm × 20 cm 板的展开槽进行裁剪。 |
| 烧杯夹 | Fisher Scientific | 15-186 | 用于将板放入或取出大型 TLC 展开槽。 其他可选来源：VWR |
| 平头镊子 | Fisher Scientific | 10-275 | 用于将板放入或取出小型展开槽。其他可选来源：VWR |
| 小型便携式紫外灯，配备 4 W 或 6 W 灯管，用于短波和长波紫外光照射（分别为 254 和 365 nm） | Ultraviolet Products | 95-0271-01 | 其他可选来源：Spectronics Corporation (www.spectroline.net) |
| 与手持式紫外灯配合使用的观察柜 | Ultraviolet Products | Chromato-Vue C-10E | 若可将板置于其中，更易于圈出紫外活性条带。 其他可选来源：Spectronics Corporation。 |
| 配备顶部紫外灯和可见光灯的图像记录系统 | Kodak | Gel Logic 200 | 其他可选来源：Ultraviolet Products (www.uvp.com)。 参见自制替代方案的实验步骤。 |
| 厌氧培养箱，A 型，乙烯基材质 | Coy | 7150000 | 该培养箱适用于如Clostridium sticklandii等厌氧菌的培养，如文中所述。 然而，培养条件需根据实验所用生物体进行调整。 若使用病原体，应采取生物安全柜及其他防护措施。其他可选来源：Anaerobe Systems、BioRad、Plas Labs 等 |
| 四氮唑红 | Sigma-Aldrich | T8877 | 其他可选来源：MP Biomedicals、Santa Cruz Biotechnology、Alfa Aesar |
| HAB 培养基成分 | |||
| 吡哆胺 · 2HCl | Sigma-Aldrich | P9380 | 本表中所有试剂，包括此项，其他供应商产品均等效。 |
| 核黄素 | Sigma-Aldrich | R4500 | |
| 盐酸硫胺素 | Sigma-Aldrich | T3902 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | N3376 | |
| 右旋泛酸钙 | Sigma-Aldrich | C8731 | |
| 硫辛酸 | Sigma-Aldrich | T5625 | |
| 对氨基苯甲酸 | Sigma-Aldrich | A9878 | |
| 叶酸 | Sigma-Aldrich | F8798 | |
| 生物素 | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| 钴胺素 | Sigma-Aldrich | C3607 | |
| 盐酸吡哆醛 | Sigma-Aldrich | P9130 | |
| 吡哆醇 | Sigma-Aldrich | P5669 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| 硫酸亚铁 · 7H2O | Sigma-Aldrich | F8263 | |
| 硫酸锌 · 7H2O | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
| 氯化锰 · 4H2O | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| 氯化钴 · 6H2O | Sigma-Aldrich | C8661 | |
| 氯化铜 · 2H2O | Sigma-Aldrich | 459097 | |
| 氯化镍 · 6H2O | Sigma-Aldrich | 203866 | |
| 钼酸钠 · 2H2O | Sigma-Aldrich | 331058 | |
| 胰蛋白胨（酪蛋白的胰酶消化物） | Thermo Fisher | B11921 | |
| 无水磷酸二氢钾 | Thermo Fisher | P284 | |
| 碳酸钠 · H2O | Thermo Fisher | S636 | |
| 琼脂 | Thermo Fisher | 50841063 | |
| 硫酸镁 · 6H2O | Thermo Fisher | 7791-18-6 | |
| 氯化钙 · 2H2O | Thermo Fisher | BP510 | |
| 盐酸半胱氨酸 | Thermo Fisher | 19464780 | |
| 无水磷酸氢二钾 | Thermo Fisher | P290 | |
| 氯化钠 | Thermo Fisher | BP358 |
参考文献
- Stahl, E., Ashworth, M. R. F. Thin-layer chromatography. , Springer. (1969).
- Marston, A. Thin-layer chromatography with biological detection in phytochemistry. J. Chromatogr. A. 1218 (19), 2676-2683 Forthcoming.
- Homans, A. L., Fuchs, A.
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