薄层色谱法（TLC）分离与植物提取物的生物活性测定以鉴定抗菌化合物

摘要

描述了用于植物提取物薄层色谱（TLC）分离及接触生物自显影以鉴定抗菌代谢物的方法。这些方法应用于筛选抑制高活性的红三叶草酚类化合物 牛瘤胃中固有的产氨细菌（HAB）。

摘要

一种常见的植物抗菌化合物筛选方法是通过纸层析法或薄层层析法（PC 或 TLC）分离植物提取物，将层析图谱暴露于微生物悬液（例如 液体培养基或琼脂中的真菌或细菌）中，在湿润环境中孵育以允许微生物生长，随后观察无微生物生长的区域。 这种被称为生物自显影的筛选方法的有效性，取决于层析分离的质量以及微生物培养条件的控制。 本文描述了用于薄层层析和接触式生物自显影的标准操作流程 ，并将其新颖地应用于氨基酸发酵细菌的检测。提取物在柔性（铝箔背衬）硅胶薄层层析板上分离，并在紫外（UV）光下观察条带。 将显示条带的区域剪下，倒置贴于接种了测试微生物的琼脂平板上进行孵育。 通过四氮唑红染色琼脂平板以显现出具有抑制作用的条带。 该方法应用于红三叶草（Trifolium pratense cv. Kenland）酚类化合物的分离，并筛选其对Clostridium sticklandii的抑制活性；后者是一种产高浓度氨的细菌（HAB），天然存在于牛瘤胃中。 该薄层层析方法适用于多种类型的植物提取物 ，若适当调整培养条件以满足不同物种的生长需求，则可将其他细菌种类（需氧或厌氧）以及真菌作为测试生物使用。

引言

检测植物中的抗菌化合物需要分离植物提取物的组分，将测试微生物暴露于这些组分，并确定微生物的生长是否受到任何化合物的抑制。纸层析或薄层层析（PC 或 TLC）分离方法较为便捷，因为多种化合物可在平面载体上实现分离。分离基于极性差异，某些化合物会紧密吸附于吸附剂上（PC 中为纤维素，TLC 中则为多种吸附剂），迁移距离较短¹。图1展示了酚类化合物在硅胶薄层层析板上分离后，极性与非极性化合物相对位置的示例。

图1. 硅胶薄层色谱（TLC）板上不同极性化合物分离后分布示意图。 以红车轴草（Trifolium pratense L.）中的酚类化合物为例。极性化合物（如克罗沃酰胺）对极性吸附剂（如硅胶）具有较强亲和力，因而停留在原点（OR）附近；而极性较小的化合物（如靠近溶剂前沿（SF）的三种异黄酮）则更容易分配进入溶剂相（除非加入水、酸或碱，否则溶剂极性通常低于硅胶），并在板上迁移得更远。

在薄层色谱板上分离提取物后，可将测试微生物暴露于板上的所有化合物，从而加快鉴定提取物中活性成分的速度²若将真菌或细菌培养物暴露于色谱图上，微生物将在除含有抑菌化合物区域以外的各处生长。若使用真菌进行检测，可通过观察菌丝生长区与无生长区之间的对比来识别抑菌圈。³ 或通过喷洒在活细胞还原或水解时会变色的化合物⁴尽管纸层析或薄层层析图谱用于抗菌试验最初是应用于抗生素⁵ 和杀菌剂^3,6，植物提取物现在经常使用此方法筛选抗菌化合物，该方法通常被称为生物自显影。本文所述方案适用于薄层色谱图的生物自显影。薄层色谱（TLC）被广泛应用，因其相对快速且可在不同吸附剂上进行（例如 二氧化硅、淀粉、氧化铝），并具有良好的分辨率和灵敏度¹.

植物提取物可通过多种方法制备用于薄层色谱（TLC）。常用方法包括使用醇-水混合液（如80%乙醇^7,8）提取植物材料，有时可加入酸或碱⁹。在使用含有水分且可能呈酸性或碱性的溶剂进行提取后，必须将提取物浓缩，以便以最小体积点样到TLC板上。醇-水提取物的浓缩可通过与水不相混溶的有机溶剂进行液-液萃取实现⁸，或使用此类溶剂的混合物（如乙酸乙酯-乙醚（1:1, v/v））^10,11。不同极性的植物代谢物会进入不同的有机溶剂中。为确保在此步骤中植物有机酸或碱能有效转入有机相，可通过水溶性酸或碱调节醇-水提取液的pH值，使解离态的分析物转化为非解离态，从而溶于中性有机溶剂⁹。随后，有机相可在减压或氮气流下蒸发，并调整至适合TLC分析的体积。由于分析物已分配至中性溶剂、最终体积较小，且在色谱分离前已在TLC板上挥发，提取物的pH值通常不会对生物测定中的微生物产生致死作用。

在植物提取物的生物自显影中，真菌和细菌均被用作测试微生物²。Cladosporium cucumerinum等某些真菌的孢子，若以营养液喷洒于薄层色谱（TLC）板上，并在湿润环境中孵育数天，可在板上萌发（抑制区域除外）³。C. cucumerinum在无抑制区域形成的深色菌丝与未生长菌丝的区域形成鲜明对比。尽管细菌也可采用相同方式施加于薄层色谱（TLC）板上^4,12，但也可通过琼脂覆盖层将细菌倾注于TLC板表面^13,14。酵母菌如Candida albicans同样可通过琼脂覆盖层施加¹⁴。此外，也可将TLC板正面朝下放置于接种了细菌^10,15或酵母⁸的琼脂表面，该方法称为接触式生物自显影²。

我们描述了一种用于筛选红三叶草（Trifolium pratense cv. Kenland）中抗菌酚类化合物的接触生物自显影方法。试验所用微生物为梭杆菌属的Clostridium sticklandii，这是一种瘤胃中高产氨细菌（HAB），且为专性厌氧菌。尽管所用分离技术无法完全解析提取物中的所有组分，但有助于识别具有抗菌活性的区域，从而缩小潜在抗菌化合物的范围。本方案采用标准的薄层色谱（TLC）操作流程¹，同时介绍了此类检测中培养专性厌氧菌所需的部分技术、接触生物自显影的应用¹⁵，以及使用四氮唑盐对活细胞进行染色显影的方法^2,4。

方案

1. 植物提取物的制备

1. 参见 Kagan 和 Flythe¹⁰ 用于从 红车轴草 品种肯兰德 
2. 要提取其他植物中的化合物，请查阅植物化学分析文献中针对特定植物或代谢物的提取方法（已有大量方法被描述），或参考Khurram等人提供的相关实验方案。 等^7,8 哪一个  分离多种具有广泛极性的化合物。

2. 薄层板的制备

1. 使用一种或多种极性中性溶剂展开薄层色谱板，以将吸附的污染物从展开区域移除，从而清洁薄层色谱板。
   1. 在通风橱中，准备足量的清洗溶剂（例如 在薄层色谱展开室底部加入15-100 ml体积比为2:1的乙酸乙酯-甲醇溶液，以浸没置于室内的薄层色谱板的底边。
   2. 使用市售的玻璃薄层色谱展开槽（有不同尺寸，带盖）或铝箔包裹的派热克斯烧杯或广口瓶。
   3. 使用剪刀裁剪铝箔或塑料背衬（柔性）硅胶板，这些硅胶板有多种尺寸（20 cm × 20 cm 及更小的尺寸），以适配现有的展开室。（注意： 二氧化硅吸入后可能对肺部造成损伤。应在通风橱中操作，并戴手套处理薄层色谱板，以避免皮肤油脂污染二氧化硅。
   4. 将培养板插入培养 chamber 中，板的顶部靠在 chamber 的壁上。 培养皿之间不应相互接触。 盖上层析缸，使溶剂通过毛细作用沿板上升。
   5. 当溶剂前沿到达板的顶端时，将板从展开槽中取出，并置于通风橱内直立位置，直至溶剂完全挥发。
   6. 检查是否有杂质迁移至薄层色谱板顶部，可通过可见光下观察黄色条带，或在紫外光（UV）下观察荧光条带（参见“杂质前沿”或 IF） 图2B). 如果培养皿大部分区域仍有黄色痕迹，则需重复清洗步骤。
   7. 从展开槽中取出薄层色谱板后，弃去溶剂。在用于方案2之前，需让残留溶剂完全挥发。
   8. 去除硅胶上可能影响化合物迁移的残留水分¹⁶将平板直立放置于100 °C的干燥烘箱中  （20厘米×15厘米，10-15分钟） 20 cm 培养皿，7 cm × 5 min 10 cm 培养皿
   9. 如果无法提供100 °C的干燥箱，可在较低温度下使用加热板加热更长时间（即 60 °C 下 40 分钟。
   10. 平板干燥后，需冷却至室温再进行上样。

3. 提取物分离用展开室的制备

1. 使用剪刀裁取一张滤纸，其高度略低于层析缸高度，宽度约为层析缸周长的一半。 该滤纸作为灯芯，可将溶剂沿缸壁向上输送，使层析缸内充满溶剂蒸气，从而提高分离结果的重复性¹。
2. 在通风橱中配制溶剂（本研究中使用乙酸乙酯-甲醇 4:1, v/v）。将溶剂混合物倒入层析缸中 并盖上盖子。待整个滤纸灯芯完全浸润，表明层析缸内蒸气已饱和，此时方可将薄层板放入层析缸中。

4. 薄层色谱板的点样与展开

1. 用铅笔轻轻标记原点。 若薄层色谱板的吸附剂较软且易损坏，可在板的边缘做标记。将板放入展开槽时，样品点应位于展开剂液面之上。
2. 将提取物溶解于足够的有机溶剂（本实验中为甲醇）中，制成浓溶液，避免形成浑浊的悬浮液。
3. 使用微量注射器或毛细管微量移液器将样品和标准品点样成狭窄的条带，板的两侧应留出1 cm的边缘。让条带自然干燥（可用风扇吹或在通风橱中操作以加速干燥）。
4. 若需要在板上增加样品浓度，可在已干燥的条带上重复点样，即进行"重叠点样"。
5. 用镊子或夹子将板放入已饱和的薄层色谱展开槽内。 板不应接触滤纸芯，因为接触点可能提供额外溶剂，从而改变化合物的迁移路径。 盖上展开槽盖子，让板展开。

5. 生物测定用平板的制备

1. 在溶剂前沿到达薄层色谱板顶部之前，将板从薄层色谱缸中取出，并用铅笔标记溶剂前沿的高度。 将板置于通风橱中晾干。
   1. 在同一个薄层色谱缸中展开其余的薄层色谱板，只要保持密闭，该色谱缸通常可全天使用。 若缸内溶剂量明显减少，则需重新配制展开溶剂混合液。
2. 待板完全干燥后，在可见光或紫外光下观察斑点，并用铅笔勾画出各斑点轮廓。 使用带有便携式紫外灯的观察室较为方便，尤其当该灯可同时在254 nm（短波紫外）和365 nm（长波紫外）下检测化合物时。
   注意：在此步骤或下一步之后，可将板用塑料膜包裹，再覆以铝箔，并于-20 °C保存。最长保存时间取决于化合物的稳定性。由于硅胶并非中性，某些化合物在薄层色谱板上可能发生降解。
3. 对板进行拍照或绘图记录。
   1. 若有配备顶部紫外光和/或可见光源的凝胶成像系统，可使用该系统进行拍照。
   2. 若无商用成像系统，可在内衬黑色纸张或布料的盒子内进行拍摄，相机置于三脚架上，便携式紫外灯固定于铁架台上¹⁷。拍摄不含荧光指示剂的薄层板时，应在相机镜头前加装蓝色滤光片以改善条带成像效果¹⁷。
4. 为辅助斑点的定性分析，可通过测量化合物迁移距离与溶剂前沿迁移距离，将前者除以后者来计算比移值（R_f）（图2A）。

6. 细菌培养与检测

1. 在厌氧条件下制备并接种培养基。 本案例中使用的培养物为 Clostridium sticklandii 菌株SR，购自美国纽约州伊萨卡市康奈尔大学James B. Russell的菌种保藏中心。
   1. 参见 Flythe 和 Kagan¹³ 以及材料列表中对 HAB 培养基的描述。
2. 将培养物培养至对数期或稳定期。操作厌氧微生物时，须采用无菌厌氧技术。
3. 将培养物（1% v/v）接种到熔化的琼脂中，此时琼脂（0.75% w/v）温度已降至60℃以下 °C. 轻柔混匀，并立即放入厌氧室（95% CO₂₂-5% H₂ 用于HAB培养基的倾注大气环境）
4. 倒入15 mm x 100 mm 塑料培养皿，静置凝固。
5. 用剪刀将薄层色谱板剪成含有目标条带的区域。 将条带正面朝下放置于琼脂平板上，用记号笔在平板背面标记条带位置，以记录其在薄层层析板上的原始方向。 将一条未使用的TLC条放置于琼脂平板上作为对照。
6. 将琼脂平板倒置（琼脂面朝下）放入厌氧培养箱中孵育（24小时，39 °C）。

7. 生物测定琼脂平板的可视化

1. 用镊子在厌氧培养箱内从琼脂平板上取下胶带。
2. 将溶于水的1% (w/v) 四氮唑红逐滴加至琼脂平板表面。 显色至少20分钟，或直至对照平板完全变为红色后再从厌氧培养箱中取出。厌氧细菌一旦离开厌氧培养箱即开始失去活性，但显色结果在24小时以上仍保持稳定。
3. 在可见光下拍照。

结果

红三叶草的代表性硅胶薄层色谱分离Trifolium pratense cv. Kenland）提取物（含酚类化合物）如图所示 图2. 在乙酸乙酯-正己烷（9:1，v/v）体系中对红三叶草提取物进行分离，展开8.5 cm，得到五个条带，其中一个条带在原点处未完全分离图 2A）。然而， 图2B 表明，当使用红三叶草提取物的另一样品（来自同一品种，但在同一家农场的不同地块种植）进行分离时，若分离距离更长（15 cm 而非 8.5 cm），并采用两种不同的溶剂系统连续展开，则显示出的条带数量约为之前的两倍。该色谱图的 图2B 首先在乙酸乙酯-正己烷（9:1，v/v）体系中展开，随后干燥并用乙酸乙酯-甲醇（78:22，v/v）体系进行分离。这些结果表明，薄层色谱板的尺寸以及溶剂系统（或一系列溶剂系统）的选择均会影响色谱图上分离出的化合物数量。在本案例中，通过对同一提取物的其他薄层色谱分离条带进行洗脱及高效液相色谱（HPLC）分析证实，滞留于原点或靠近原点的化合物主要为与极性基团（如氨基酸衍生物、...

讨论

本方案描述了一种将提取物分离为不同化合物组分，并通过接触式生物自显影法对这些组分进行活性检测的简便方法。 该方法与Chomnawang 等¹⁵用于筛选抑制淋病致病菌的植物代谢产物的方法非常相似。用于筛选植物抗菌化合物的生物自显影类型取决于多种因素，包括测试微生物、实验室条件以及进行生物测定人员的偏好。 本研究所采用的接触式生物自显影法曾受到批评，因其依赖于化合物向接种培养基中扩散的能力¹²。 在低浓度下或扩散能力较弱的化合物周围可能无法观察到抑菌圈，特别是当在扩散物下方的琼脂中仍发生微生物生长时。 此外，某一色带产生的抑菌圈可能超出其初始边界，从而可能掩盖邻近化合物所产生的抑菌区域¹⁴。然而，接触式生物自显影法操作简便，且培养皿可堆叠放置，节省空间。 此外，将薄层色谱（TLC）色带直接贴于琼脂表面，可避免将TLC板覆盖接种琼脂或喷洒测试微生物时可能出现的色带溶解和扩散问题。

获取上述任何类型生物自显影的信息均依赖于色谱条件、测试微生物的浓度以及培养/...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硅胶 F254 TLC 板，铝背板，厚度 0.2 mm，尺寸 20 cm × 20 cm	EMD Chemicals	5554/7	这些板涂有在 254 nm 处发出荧光的指示剂硅胶。  在荧光绿色背景下，吸收该波长的化合物呈现暗色。  其他可选供应商包括 Analtech、Selecto Scientific、Fluka。  可能需要使用除硅胶以外的吸附剂。  根据所用溶剂的不同，塑料背板板也可能适用。
锋利的重型剪刀	任意缝纫用品公司	类似于 Fiskars 175800-1002	用于切割 TLC 板。  也可使用带有锋利刀片的纸张切割器。  切勿吸入硅胶粉尘。
100 °C 的干燥烘箱（机械对流）	Thermo Scientific	PR305225M	Quincy Lab, Inc, Chicago, IL (www.quincylab.com)；Cascade Technical Sciences, Hillsboro, OR (www.cascadetek.com)
TLC 展开槽	Kimble Chase	416180-0000	其他可选来源：  Aldrich。Pyrex 烧杯或广口瓶可用于小尺寸板（例如 5 cm × 10 cm）。  用铝箔覆盖（罐盖可能含有可被溶剂蒸气萃取的材料）。
50 µl 带平头针头的注射器	Hamilton	80965	用于加样量超过 5–10 µl 的标准品或样品。  其他供应商产品等效。
微量移液器	Drummond	2-000-001	用于加样少量标准品或样品。  其他可选来源：  VWR。  此外，也可用本生灯加热拉伸巴斯德移液管，使其直径更细。
滤纸（#1 级）	Whatman	1001 917	用作展开槽中的吸水芯。  其他级别的滤纸也可使用。  此尺寸可根据容纳 20 cm × 20 cm 板的展开槽进行裁剪。
烧杯夹	Fisher Scientific	15-186	用于将板放入或取出大型 TLC 展开槽。  其他可选来源：VWR
平头镊子	Fisher Scientific	10-275	用于将板放入或取出小型展开槽。其他可选来源：VWR
小型便携式紫外灯，配备 4 W 或 6 W 灯管，用于短波和长波紫外光照射（分别为 254 和 365 nm）	Ultraviolet Products	95-0271-01	其他可选来源：Spectronics Corporation (www.spectroline.net)
与手持式紫外灯配合使用的观察柜	Ultraviolet Products	Chromato-Vue C-10E	若可将板置于其中，更易于圈出紫外活性条带。  其他可选来源：Spectronics Corporation。
配备顶部紫外灯和可见光灯的图像记录系统	Kodak	Gel Logic 200	其他可选来源：Ultraviolet Products (www.uvp.com)。  参见自制替代方案的实验步骤。
厌氧培养箱，A 型，乙烯基材质	Coy	7150000	该培养箱适用于如Clostridium sticklandii等厌氧菌的培养，如文中所述。  然而，培养条件需根据实验所用生物体进行调整。  若使用病原体，应采取生物安全柜及其他防护措施。其他可选来源：Anaerobe Systems、BioRad、Plas Labs 等
四氮唑红	Sigma-Aldrich	T8877	其他可选来源：MP Biomedicals、Santa Cruz Biotechnology、Alfa Aesar
HAB 培养基成分
吡哆胺 · 2HCl	Sigma-Aldrich	P9380	本表中所有试剂，包括此项，其他供应商产品均等效。
核黄素	Sigma-Aldrich	R4500
盐酸硫胺素	Sigma-Aldrich	T3902
烟酰胺	Sigma-Aldrich	N3376
右旋泛酸钙	Sigma-Aldrich	C8731
硫辛酸	Sigma-Aldrich	T5625
对氨基苯甲酸	Sigma-Aldrich	A9878
叶酸	Sigma-Aldrich	F8798
生物素	Sigma-Aldrich	B4639
钴胺素	Sigma-Aldrich	C3607
盐酸吡哆醛	Sigma-Aldrich	P9130
吡哆醇	Sigma-Aldrich	P5669
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
硫酸亚铁 · 7H2O	Sigma-Aldrich	F8263
硫酸锌 · 7H2O	Sigma-Aldrich	Z0251
氯化锰 · 4H2O	Sigma-Aldrich	M8054
硼酸	Sigma-Aldrich	B6768
氯化钴 · 6H2O	Sigma-Aldrich	C8661
氯化铜 · 2H2O	Sigma-Aldrich	459097
氯化镍 · 6H2O	Sigma-Aldrich	203866
钼酸钠 · 2H2O	Sigma-Aldrich	331058
胰蛋白胨（酪蛋白的胰酶消化物）	Thermo Fisher	B11921
无水磷酸二氢钾	Thermo Fisher	P284
碳酸钠 · H2O	Thermo Fisher	S636
琼脂	Thermo Fisher	50841063
硫酸镁 · 6H2O	Thermo Fisher	7791-18-6
氯化钙 · 2H2O	Thermo Fisher	BP510
盐酸半胱氨酸	Thermo Fisher	19464780
无水磷酸氢二钾	Thermo Fisher	P290
氯化钠	Thermo Fisher	BP358