定量蛋白质组学使用还原二甲基化的稳定同位素标记

Summary

肽的还原性二甲基化（REDI标签）稳定同位素标记是一种快速，廉价的战略精确质谱为基础的定量蛋白质组学。这里我们展示了一个可靠的方法用于制备使用可以应用于几乎任何类型的样品中的Redi途径的蛋白质混合物的分析。

Abstract

肽通过还原二甲基化（REDI标签）的稳定同位素标记的方法来准确地量化用质谱样品之间蛋白表达的差异。无论是使用常规（光）或氘（重）形式的甲醛和氰基硼氢化钠加两个甲基对每个游离胺进行REDI标签。在这里，我们展示了一个强大的协议REDI标签和复杂的蛋白质混合物的定量比较。蛋白样品用于比较被消化成肽，标记为运载轻或重的甲基标签，混合，并通过LC-MS/MS共同分析。相对的蛋白丰度，通过比较构成的肽从全MS谱中提取的重链和轻标记版本的离子色谱图的峰面积进行定量。此处描述的方法包括用反相固相萃取的样品制备，肽柱上的Redi贴标，通过碱性pH转肽分馏ersed相（BPRP）层析，并StageTip肽纯化。我们讨论REDI标签的优点和局限性相对于其它方法稳定同位素掺入。我们使用REDI标签作为一种快速，廉价，准确的方法，在几乎任何类型的样品的比较蛋白质丰度突出创新应用。

Introduction

测量复杂样品间的许多蛋白质​​的浓度差异是在蛋白质组学面临的核心挑战。越来越多地，这是由标记蛋白在每个样品中不同的同位素标记，结合样品，并用质谱定量浓度差异进行。蛋白质和多肽的稳定同位素标记的方法有几种^{。15 N}标记¹和² SILAC 在体内引入同位素标记的代谢，而ICAT ³的iTRAQ ^4，和二甲基化减少⁵蛋白的提取和消化后添加稳定同位素标记。在这些方法中，还原的二甲基化（雷迪标签）正逐渐成为一种廉价的，可再现的方法来量化在几乎任何类型的样品的蛋白质浓度差异。

雷迪标记包括使肽与甲醛以形成席夫碱，然后将其减压通过氰基。这种反应dimethylates上的N-末端和赖氨酸侧链和monomethylates N-末端脯氨酸游离氨基。这里所描述的协议甲基化的肽中的样品1使用的试剂与氢原子在其天然同位素分布和样品2使用氘化的甲醛和氰基硼氢化（ 图1）一个"重"标签的"光"的标签。关于在6.0377沓轻质和重质的形式，它是采用利用质谱仪的两种形式之间进行区分之间的质量差异的肽的结果各二甲基化的氨基。具体而言，相对于肽的丰度定量为MS1的提取离子色谱图区域的光的比率（MS1峰面积之比）和重版本的每个肽的离子对。一个蛋白的相对丰度的计算方法中的所有蛋白肽中的中位数MS1峰面积之比。在这份报告中，我们描述了....

Protocol

注:此方法之前描述^12。

1，蛋白质分离

制备1毫克细胞蛋白通过裂解细胞，优选通过物理方法如法国压机，珠击，或超声处理。避免溶菌酶介导的细胞溶解，因为这种酶会混淆质谱测量。

2，三氯乙酸沉淀蛋白

加入1倍体积的三氯乙酸（TCA），以4倍体积的冰蛋白和冷却10分钟以沉淀蛋白质。 12,000×g离心5分钟，在4℃下，去除上清。在4℃下重悬沉淀中加入1ml冰冷的丙酮和12,000×g离心5分钟去除上清，颠倒离心管在板凳上，以干燥沉淀15分钟。店铺蛋白小球于-80℃。

3，使蛋白质变性和还原二硫键

回复暂停蛋白质〜2 mg / ml的500微升变性和还原缓冲液（或者4M尿素或3％SDS的50mM HEPES pH值为8.5，5mM DTT的）。任选地，包括在缓冲液中的蛋白酶抑制剂。孵育蛋白30分钟，在56℃，然后在室温下10分钟。

4。Aklylate游离巯基，以不可逆扰乱二硫键形成

水准备新鲜0.3M的碘乙酰胺。注意！碘乙酰胺是剧毒。加入25微升0.3M的碘乙酰胺（15mM的终浓度），以5....

Results

我们使用酿酒酵母评估的准确度，精密度和雷迪标记的再现性和梭菌C.phytofermentans中全细胞裂解液。我们首先量化C的组合的REDI标记效率C.phytofermentans中的蛋白裂解物纤维素（重标记，H）和葡萄糖（光标签，L）的培养。当过滤，以1％的肽假发现率，该样品含有具有98％的Redi标记效率11194独特的肽序列。未分离S。酵母蛋白溶胞产物同样标记用H或L试剂，混合各种比例，并进行分析。蛋白质表达的差异（对数_2（中位MS1峰面积）），可重复地反映在其中H和L的样品在大范围的混合比例（ 图3）的混合比率。具体而言，99％的蛋白质的倍数变化被测量为小于1.6倍的较小为1:1的混合样品。在1:10至10:1的样品，99％的蛋白质均在3.8倍的预期的比例，表示在从1:1混合物更大的距离的增加而标准偏差。当雷迪标签施加到梭菌C.phytofermentans中蛋白质组，我们量化超过2000的蛋白质与内2倍水平的复制培养于葡萄糖（ 图4A）

Discussion

几点让使用还原二甲基化（REDI标签）一个有吸引力的方法，定量蛋白质组学肽的稳定同位素标记:物美价廉标记试剂（试剂成本低于1美元的样品），反应速度快（〜10分钟），无副产物，高再现性（ 图3,4），稳定的反应产物，能够使用任何蛋白酶，和标记的肽的高电离效率。由雷迪化学标记也是有利的相对于代谢标记，因为它不需要株或细胞系具有特定氨基酸营养缺陷型或生长在合成培养基中。因此，雷迪可应用于几乎任何类型的蛋白质样品，包括新颖的微生物¹²的量很少的突变菌株可¹³和人类干细胞^14，其中包括^15。

REDI标签的限制是相对复样本，​​以一个加时赛能力较低她的方法，例如等压标记（ 例如 ，的iTRAQ或TMT），为此，目前多达8个样本可以同时量化^16。我们在这里描述的方法可以让两个不同标记样本的定量比较。甲醛和氰基硼氢化额外同位素的组合可用于产生最多3个标签，该相差至少4沓¹⁷和雷迪标签最近被扩展到5复用样品

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
三氯乙酸	Sigma-Aldrich	T9159	蛋白沉淀
丙酮	Sigma-Aldrich	650501	蛋白沉淀
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	71736	变性，还原蛋白质
氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045	变性，还原蛋白质
DL-二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43816	变性、还原、烷基化蛋白
抑制剂 完整迷你鸡尾酒	罗氏	4693124001	变性、还原蛋白
乙酰胺	Sigma-Aldrich	I6125	烷基化蛋白
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	重悬、提取、标记蛋白
钙	Sigma-Aldrich	C5670	重悬蛋白
赖氨酰内切蛋白酶	Wako Chemicals	129-02541	蛋白质消化
测序级胰蛋白酶	Promega	V5111	蛋白质消化
乙酸	Sigma-Aldrich	320099	蛋白质消化
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	299537	反相肽提取
tC18 Sep-Pak C18 小柱	Waters	WAT054960	反相肽萃取
取歧管	Waters	WAT200609	反相肽萃取
乙腈	Sigma-Aldrich	14261	各种
甲醛	Sigma-Aldrich	252549	"光"肽标记
氰基硼氢化物	Sigma-Aldrich	71435	"光"肽标记
氘代甲醛	Sigma-Aldrich	492620	"沉重的"肽标记
氰基硼氘化钠	CDN 同位素	D-1797	"沉重的"肽标记
MES	Sigma-Aldrich	M3671	肽标记
C18-HPLC 色谱柱（4.6 x 250 mm，5 µm 粒径）	Agilent	770450-902	碱性 pH 反相色谱
甲酸	Sigma-Aldrich	399388	各种
C18 Empore 盘	3M	14-386-3	STAGE 提示
甲醇	Sigma-Aldrich	494437	STAGE 吸头