使用还原性二甲基化进行稳定同位素标记的定量蛋白质组学

摘要

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种快速、经济的基于质谱的定量蛋白质组学准确分析策略。本文展示了一种利用 ReDi 方法制备和分析蛋白质混合物的可靠方案，该方法可适用于几乎任何类型的样品。

摘要

通过还原性二甲基化对肽段进行稳定同位素标记（ReDi 标记）是一种利用质谱技术精确量化样本间蛋白质表达差异的方法。ReDi 标记使用普通（轻）或氘代（重）的甲醛和氰基硼氢化钠，将两个甲基基团添加至每个游离胺基上。本文展示了一种可靠的 ReDi 标记实验流程，用于复杂蛋白质混合物的定量比较。待比较的蛋白质样品经酶解生成肽段后，分别标记轻或重甲基标签，混合后共同进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。通过比较来自全扫描质谱数据中各肽段的重标与轻标形式的离子色谱峰面积，实现对相对蛋白质丰度的定量。本文所述方法包括采用反相固相萃取进行样品制备、柱上肽段 ReDi 标记、基于碱性 pH 反相（BPRP）色谱的肽段分级以及 StageTip 肽段纯化。我们讨论了 ReDi 标记与其他稳定同位素掺入方法相比的优势与局限性，并强调了 ReDi 标记作为一种快速、经济且准确的方法，在几乎任何类型样品中比较蛋白质丰度的新型应用。

引言

在蛋白质组学中，测量复杂样品间多种蛋白质的浓度差异是一个核心挑战。目前，这一目标正越来越多地通过使用不同的同位素标签对各样品中的蛋白质进行标记，然后将样品混合，并利用质谱技术来定量分析浓度差异。目前已有多种用于蛋白质和肽段稳定同位素标记的方法。¹⁵N标记¹和SILAC²是在活体（in vivo）条件下通过代谢方式引入同位素标签，而iCAT³、iTRAQ⁴和还原性二甲基化标记⁵则是在蛋白质提取和消化后添加稳定同位素标签。在这些方法中，还原性二甲基化（ReDi标记）因其成本低廉、可重复性好，正逐渐成为在几乎所有类型样品中定量蛋白质浓度差异的常用方法。

ReDi 标记技术涉及将肽与甲醛反应生成席夫碱，随后由氰基硼氢化物还原。该反应可使肽的N端和赖氨酸侧链上的游离氨基发生二甲基化，并使N端为脯氨酸的肽发生单甲基化。本文所述方案使用天然同位素分布的氢原子试剂对样本1进行“轻”标记，使用氘代甲醛和氘代氰基硼氢化物对样本2进行“重”标记（图 1）。肽上每一个二甲基化的氨基在轻标与重标形式之间产生6.0377 Da的质量差异，利用质谱仪可区分这两种形式。具体而言，每对肽离子的相对丰度通过其MS1提取离子色谱峰面积之比（MS1峰面积比）来定量。蛋白质的相对丰度则通过该蛋白质所有肽段的MS1峰面积比的中位....

方案

注意：此方法先前已有描述¹²。

1. 蛋白质分离

通过裂解细胞制备1 mg的细胞蛋白，优先采用物理方法，如法式压榨、珠磨或超声处理。避免使用溶菌酶介导的细胞裂解，因为该酶会干扰质谱测量。

2. 蛋白质的三氯乙酸沉淀

向4体积的蛋白质样品中加入1体积三氯乙酸（TCA），冰上孵育10分钟 以沉淀蛋白质。在4 °C下以12,000 × g离心5分钟，弃去上清液。用1 ml预冷的丙酮重悬沉淀物，在4 °C下以12,000 × g再次离心5分钟。弃去上清液，将离心管倒置在实验台上干燥沉淀物15分钟。将蛋白质沉淀物于-80 °C保存。

3. 变性蛋白质并还原二硫键

用 500 μl 变性与还原缓冲液（含 4 M 尿素或含 3% SDS 的 50 mM HEPES pH 8.5 缓冲液）将蛋白质重悬至浓度约为 2 mg/ml。可选择在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。56 °C 孵育 30 分钟，随后在室温孵育 10 分钟。

4. 烷基化游离巯基以不可逆地破坏二硫键形成

配制新鲜的0.3 M碘乙酰....

结果

我们使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和植物发酵梭菌（Clostridium phytofermentans）的全细胞裂解液评估了ReDi标记的准确性、精确性和可重复性。我们首先量化了来自纤维素（重标记，H）和葡萄糖（轻标记，L）培养物的C. phytofermentans蛋白裂解液混合物的ReDi标记效率。在肽段假发现率过滤至1%时，该样品包含11,194条独特肽段序列，ReDi标记效率达98%。同样地，将酿酒酵母（S. cerevisiae）未分级蛋白裂解液用H或L试剂标记后，以不同比例混合并进行分析。蛋白质表达差异（log₂ （MS1中位峰面积））在广泛的混合比例范围内可重复地反映了H与L样品的混合比例（图3）。具体而言，在1:1混合样品中，99%蛋白质的倍数变化被测定为小于1.6倍。在1:10和10:1的样品中，99%的蛋白质测量值在预期比例的3.8倍范围内，表明随着与1:1混合比例的差距增大，标准偏差有所增加。当ReDi标记应用于植物发酵梭菌（Clostridiu.......

讨论

多个因素使得利用还原性二甲基化（ReDi标记）对肽段进行稳定同位素标记成为定量蛋白质组学中一种极具吸引力的方法：标记试剂价格低廉（每样本试剂成本低于1美元）、反应速度快（约10分钟）、无副产物生成、重现性高（图示 3, 4），稳定的反应产物，可使用任意蛋白酶，以及标记肽段的高离子化效率。与代谢标记相比，ReDi的化学标记具有优势，因其无需具有特定氨基酸营养缺陷型的菌株或细胞系，也无需在合成培养基中培养。因此，ReDi可应用于几乎所有类型的蛋白质样品，包括新型微生物¹² 可用于研究的突变菌株较少¹³ 和人类干细胞¹⁴以及其他¹⁵.

ReDi标记的一个局限性是其多重样本检测能力相较于同重标记等其他方法较低例如，iTRAQ 或 TMT），目前可同时对最多 8 个样品进行定量¹⁶该方法可实现对两种不同标记样品的定量比较。通过使用其他同位素组合的甲醛和氰基硼氢化钠，可生成最多3种标记物，其质量差异至少为4 Da。^.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三氯乙酸	Sigma-Aldrich	T9159	蛋白质沉淀
丙酮	Sigma-Aldrich	650501	蛋白质沉淀
十二烷基硫酸钠	Sigma-Aldrich	71736	变性、还原蛋白质
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	S8045	变性、还原蛋白质
DL-二硫苏糖醇	Sigma-Aldrich	43816	变性、还原、烷基化蛋白质
蛋白酶抑制剂完全迷你混合液	Roche	4693124001	变性、还原蛋白质
碘乙酰胺	Sigma-Aldrich	I6125	烷基化蛋白质
HEPES	Sigma-Aldrich	H7523	重悬、提取、标记蛋白质
氯化钙	Sigma-Aldrich	C5670	重悬蛋白质
赖氨酰内肽酶	Wako Chemicals	129-02541	蛋白质消化
测序级胰蛋白酶	Promega	V5111	蛋白质消化
乙酸	Sigma-Aldrich	320099	蛋白质消化
三氟乙酸	Sigma-Aldrich	299537	反相肽提取
tC18 Sep-Pak C18 小柱	Waters	WAT054960	反相肽提取
提取装置	Waters	WAT200609	反相肽提取
乙腈	Sigma-Aldrich	14261	多种用途
甲醛	Sigma-Aldrich	252549	“轻标”肽标记
氰基硼氢化钠	Sigma-Aldrich	71435	“轻标”肽标记
氘代甲醛	Sigma-Aldrich	492620	“重标”肽标记
氰基硼氘化钠	CDN isotopes	D-1797	“重标”肽标记
MES	Sigma-Aldrich	M3671	肽标记
C18-HPLC 色谱柱（4.6 × 250 mm，5 µm 粒径）	Agilent	770450-902	碱性 pH 反相色谱
甲酸	Sigma-Aldrich	399388	多种用途
C18 Empore 圆盘	3M	14-386-3	STAGE 小尖
甲醇	Sigma-Aldrich	494437	STAGE 小尖