一种改良的小鼠异位心脏移植方法

摘要

本文演示了一种小鼠心脏异位移植的显微外科技术，包括简化的供体心脏获取和受体血管吻合方法。

摘要

小鼠常被用作移植免疫学研究中的心脏移植供体和受体，原因是可获得多种转基因小鼠品系及相关试剂。然而，由于动物体型较小，心脏移植所需的显微外科手术在技术上具有相当大的挑战性。特别是移植术后早期可能出现较高的技术失败率，原因包括受体死亡以及术后并发症，如后肢瘫痪或心脏无搏动等。本文展示了异位小鼠心脏移植的完整技术操作，包括供体心脏的获取及其在受体小鼠体内的后续移植。供体心脏在供体动物处死后的立即进行获取 原位 用冷肝素化生理盐水灌注，并横断升主动脉和肺动脉。受体手术包括准备腹主动脉和下腔静脉（IVC），随后使用单根连续缝合的10-0微血管缝线将供体主动脉与受体主动脉行端侧吻合，并以类似方式将供体肺动脉与受体下腔静脉行吻合。术后，动物皮下注射0.6 ml生理盐水，并置于37 °C加热垫上恢复。227例小鼠心脏移植结果总结显示，术后48小时手术成功率为86.8%。在48小时内失败的13.2%病例中，5例（2.2%）出现后肢瘫痪，10例（4.4%）因移植物缺血性损伤和/或血栓形成导致心脏无搏动，15例（6.6%）在48小时内死亡。

引言

器官移植的动物模型可为改善临床移植患者的治疗提供重要信息。由于存在大量基因改造小鼠品系以及针对小鼠的特异性试剂，而这些资源在其他动物模型中尚不可用，因此小鼠模型在研究器官移植排斥或接受的免疫机制方面尤为有用^1-3。移植小鼠模型面临的一个挑战是供体与受体体积较小，需要相当高的技术水平才能获得理想的结果。

一种大鼠异位心脏移植技术首次被描述⁴ 随后由Corry将其改进用于小鼠心脏移植 等⁵该技术涉及在供体手术前对受体进行预处理，且供体心脏不进行灌注，这两种操作均可能影响移植心脏或受体的存活。该方法自最初描述以来已被广泛用于研究移植排斥反应与免疫耐受的机制。^6-8其他人已将 Ono 和 Lindsey 建立的大鼠心脏移植手术改良，用于小鼠的心脏移植^9,10最近，一种克服了Corry方法相关部分问题的小鼠心脏移植技术被发表 等¹¹. 本方案基于Mottram的方法，并结合了我们的改进 等¹²，包括： 原位 开胸后立即用冷肝素化生理盐水灌注，并在受体手术之前完成供体手术操作，以最大限度缩短受体手术时间。此外，我们采用小型无创血管钳代替6-0丝线结扎。尽管血管钳占用空间较大，但其操作控制更为简便，而丝线结扎过紧或过松均会影响效果，且拆除时不如血管钳方便。本方法采用单根连续缝合进行血管吻合；但在初期学习阶段，可选择在近端和远端角部使用固定缝线，以确保缝合均匀，从而保障吻合口通畅。

方案

在开始实验之前，须获得相关机构动物护理伦理委员会对计划实验的批准。应按照所在机构的要求饲养小鼠。以下方案已获得悉尼大学和皇家阿尔弗雷德亲王医院委员会的批准。

在开始手术前，所有器械应彻底清洁，并通过浸泡于80%乙醇中进行消毒。某些机构规定需使用高压灭菌，但这长期来看可能会损坏精密的显微外科器械。 在条件允许的情况下，应使用无菌的一次性器械。

1. 麻醉

1. 将小鼠置于密闭容器中用异氟烷麻醉，然后将其仰卧固定于手术板上，并迅速连接麻醉鼻罩。通过夹捏后肢足部测试麻醉深度，确保无痛觉反射。
2. 使用手术刀片剃除手术区域毛发，并用80%乙醇消毒。此外，也可使用含2%氯己定的70%异丙醇进行皮肤消毒。 诱导麻醉时异氟烷浓度为3%，维持麻醉时应降低至1–1.5%。根据动物呼吸频率和心率对浓度进行微调，以维持稳定的生理状态。使用加热垫维持动物体温。

2. 供体手术

1. 通过在肋笼两侧从肋缘向上至腋窝处切开胸腔，形成胸壁瓣，进行开胸手术以暴露心脏和血管，随后在剑突水平做一横向切口。将此胸壁瓣抬起并翻转至头部一侧，用针固定于手术板上。撕除心包膜以暴露心脏和血管。
2. 用一把镊子夹住下腔静脉（IVC），另一只手将1 ml冷肝素化生理盐水经下腔静脉靠近心脏近端处注入，然后在下腔静脉上放置一个小动脉夹，防止灌注液从针孔倒流。
3. 使用纱布和棉签将心脏向下牵拉，暴露升主动脉和肺动脉。将显微剪刀的一叶插入主动脉与肺动脉束后方的通道（横窦）内，尽可能向远端同时剪断主动脉和肺动脉，以确保吻合时有足够的长度。
4. 使用6-0丝线结扎并切断下腔静脉、右上腔静脉（SVC）、左上腔静脉（SVC）及肺静脉。分别结扎下腔静脉和右上腔静脉，然后在心脏后方放置一根单独的缝线，环绕左上腔静脉与肺静脉并结扎。在结扎线远端切断血管，从供体部位获取心脏，随后将其保存于4 °C的冷无菌生理盐水中，直至移植。此操作将导致供体因失血过多而死亡。

3. 受体操作

1. 按上述方法麻醉受体动物（第1节）。小心剃除腹部毛发以避免刺激， 然后从耻骨至剑突沿正中线做腹正中切口，使用弯折的回形针作为拉钩进行牵拉。将肠管用温热的无菌生理盐水浸湿的纱布包裹，并移至腹部右上方。
2. 为暴露肾下腹主动脉和下腔静脉（IVC），使用电凝设备将从左肾动脉和静脉至髂总动脉分叉处之间的腹主动脉与下腔静脉束段与腰动脉分离。注意电凝设备应调节至适当温度，并持续足够时间以切断并封闭血管断端。
3. 在远端和近端分别对腹主动脉和下腔静脉段施加小型无创血管夹。在腹主动脉前壁做切口时，先用30 G 针头穿刺一个小孔，再用显微剪沿垂直方向剪开，使其切口大小与供体主动脉相匹配。用肝素化生理盐水冲洗主动脉管腔，以清除任何血栓。
4. 将供体心脏用冷生理盐水浸湿的纱布覆盖后转移至受体手术区域，并置于腹部右侧。确保供体主动脉紧邻受体主动脉的切口位置，供体肺动脉紧邻受体下腔静脉。
5. 使用连续缝合的10-0尼龙线将供体主动脉端侧吻合至受体主动脉，缝合从近端角开始，先沿左侧壁缝合直至远端角，此时将动物旋转180°。轻柔地将供体心脏移至腹部左侧，以暴露主动脉右侧壁，继续从远端向近端完成右侧壁的缝合。在关闭主动脉吻合口前，用肝素化生理盐水轻柔冲洗管腔，以清除任何血栓和空气。
6. 将供体肺动脉（PA）端侧吻合至受体下腔静脉（IVC）。在下腔静脉前壁垂直剪开一个切口，位置应与动脉吻合部位相对应。使用连续缝合的10-0尼龙线，从下腔静脉管腔内左壁远端开始，将供体PA与受体IVC吻合。到达近端后，继续沿前右侧壁缝合至远端，完成吻合。在关闭吻合口前，轻柔冲洗管腔以清除血栓和空气。
7. 在松开血管夹之前，在吻合口周围放置Gelfoam止血海绵，并用棉签轻轻加压，直至实现止血。在再灌注时，先松开远端血管夹，随后松开近端血管夹。
8. 再灌注后，将37 °C的温生理盐水外敷于移植心脏表面，以促进其功能恢复。移植心脏通常立即出现纤维性颤动，并在数分钟内自发恢复为窦性心律。皮下注射0.6 ml温生理盐水以维持受体动物的体液平衡。在手术结束前，皮下注射布托啡诺以提供镇痛。
9. 使用一根5-0可吸收缝线连续缝合两层组织关闭腹壁切口。 先完成内层缝合，再继续缝合皮肤层。

4. 恢复与移植监测

1. 注射氨苄青霉素以预防感染，并将受体动物置于37 °C加热垫上以促进恢复。大多数动物恢复迅速，通常在3小时内即可饮水，且常开始进食。若小鼠出现痛苦迹象，应密切检查以确定原因。若无明显病因，给予丁丙诺啡治疗并密切监测。如果症状严重或持续超过8小时，应咨询兽医，并考虑实施安乐死。如有必要，每12 小时持续注射一次丁丙诺啡，直至症状消失。 若小鼠在8小时后仍出现痛苦迹象，应继续每12小时注射一次丁丙诺啡，直至症状缓解。若症状持续超过48小时，应咨询兽医，并在必要时实施安乐死。
2. 通过直接腹部触诊监测移植物心脏搏动，并记录搏动强度：++++表示移植物健康，+表示因严重排斥导致搏动微弱，–表示因移植物完全排斥而无搏动。实验最初10天内每日监测小鼠，之后每周监测3次，直至实验结束。

结果

在经过初始训练阶段后，我们团队分析了227例小鼠异位心脏移植病例。术后24小时内的成功率为90.3%，48小时内的成功率为86.8%。在48小时内发生的30例（13.2%）失败病例中，5例（2.2%）出现后肢瘫痪而需实施安乐死，10例（4.4%）因移植物缺血损伤和/或血栓形成导致心脏无搏动，另有15例（6.6%）在48小时内死亡。部分实验性移植物存活情况见表1，其中包含多种品系组合。相同供体与受体品系间的心脏移植可获得长期存活，而不同品系间的心脏移植则会发生排斥反应。

移植心脏的外观如图所示 图1心脏移植失败的原因通常根据移植后心脏停止跳动的时间以及心脏的外观来确定。如有必要，应通过心脏组织学分析来确认停搏原因。例如，在一只C57BL/6品系受体接受DBA/2供体心脏移植的案例中，心脏于术后第2天停止跳动，这种情况极为罕见，因为在未致敏的受体中，排斥反应通常至少需要一周时间才会发生。 图1A 显示该受体心脏存在血栓形成及心肌组织梗死的证据。在C57BL/6供体至C57BL/6受体的...

讨论

小鼠心脏移植是一种具有挑战性的显微外科技术，需要相当的手术技巧才能掌握。最具挑战性的方面在于血管直径较小。此外，还需尽量缩短受体手术时间并控制出血。小鼠心脏移植技术最早由 Corry et al. 于1973年描述，随后由 Mottram et al¹² 进行改进。我们的改良主要包括以下几点：首先，在开胸后立即用冷肝素化生理盐水灌注供体心脏，并在灌注后迅速切断主动脉和肺动脉束 ，可防止获取过程中发生热缺血。其次，在供体心脏获取完成后立即开始受体准备工作，而不是在供体操作前准备受体，可减少受体腹部暴露时间，从而提高存活率。最后，使用小型无创血管夹阻断血流，而非结扎受体主动脉/下腔静脉束，通常可减少血管损伤，并降低后肢瘫痪的发生率。

此外，以下几点对于实验成功至关重要。供体和受体动物的最佳体重为 23 至 26 克，最佳年龄为 10 至 12 周。年龄较大的动物血管并不更粗，且其脂肪含量增加会使腹主动脉和下腔静脉的暴露更加困难。手术过程中必须避免受体动物脱水和低体温。受体的肠道应使用温热的生理盐水浸湿的纱布妥善保护，并...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术显微镜	Leica, Heerbrugg, Switzerland	M651	10-25倍放大
麻醉机	Vet Quip Pty Ltd, Sydney, Australia	Vett3	可输送异氟烷与氧气的混合气体
手术板	五金店或办公用品供应商		致密软木或可插针的合成材料
肝素化生理盐水（5 U/ml，4 °C）	Pfizer, USA	FW25	置于冰上，1 ml 注射器配 23 G 针头
生理盐水（37 °C）	AstraZeneca Pty Ltd, Australia	4538	置于加热垫上，1 ml 注射器配 23 G 针头
缝线 10- 尼龙线，5-0 Vicryl	Ethicon, Inc. NJ, USA	2870G/J421H
布托啡诺（0.05 mg/kg，溶于 0.1 ml 生理盐水）	Reckitt Benckiser, Sydney, Australia		置于冰上，1 ml 注射器配 23 G 针头
氨苄西林（5 mg/kg，溶于 0.1 ml 生理盐水）	Aspen, Sydney, Australia		置于冰上，1 ml 注射器配 23 G 针头
明胶海绵（Gel Foam）	Pharmacia & Upjohn Co. USA	801289304	切成小块
高温电凝设备	Medtronic, USA	8444000
加热垫/Right Temp	Kent Scientific Corporation, Turrington, CT 06790
显微外科器械：	上海医疗器械有限公司
显微持针器	上海, 中国	WT2020
显微剪刀	"          "	WT1020
显微镊（直头）	"          "	WA3010
显微镊（弯头）	"          "	WA3020
微型蚊式钳（1 对）	"          "	W40350
微血管无创钳（1 对）	"          "	W40130/W40150