高危型人乳头瘤病毒（HPV）存在于头颈部肿瘤组织中与较好的预后相关。近年来新开发的 RNA 原位 一种名为RNAscope的杂交技术可实现对福尔马林固定石蜡包埋组织切片中HPV E6/E7 mRNA的直接可视化。
本文内容
摘要
摘要
检测致癌性人乳头瘤病毒（HPV）的“金标准”是在肿瘤组织中检测出转录活跃的高危型HPV。然而，通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测E6/E7 mRNA需要提取RNA，这一过程会破坏肿瘤组织的结构背景，而该背景对于形态学相关性分析至关重要，因此该方法难以在常规临床实践中推广应用。我们近期开发的RNA 原位 杂交技术，RNAscope，可实现对福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织中RNA的直接可视化，具有单分子敏感性和单细胞分辨率，从而实现高灵敏度和高特异性 原位 在常规临床样本中对任何RNA生物标志物进行分析。RNAscope HPV检测采用基因型特异性探针混合物，用于检测七种高危型HPV基因型（HPV16、18、31、33、35、52和58）的E6/E7 mRNA。该方法在检测E6/E7 mRNA方面，相较于目前的“金标准”定量逆转录PCR（qRT-PCR）方法，表现出优异的灵敏度和特异性。通过RNAscope检测确定的HPV状态对口咽癌患者的临床预后具有显著的预测价值。
引言
高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）感染约占全球所有癌症病例的5%1。在过去几十年中，与HPV相关的口咽癌发病率持续上升，尤其在男性中更为显著。预计在未来20年内，美国大多数头颈部癌症将由HPV阳性的口咽鳞状细胞癌（OPSCC）构成2。由HPV引起的口咽鳞状细胞癌与较好的生存预后相关，肿瘤的HPV状态是生存率的一个强有力且独立的预后因素3。
转录激活病毒癌基因 E6 和 E7 的证据被视为临床上相关人乳头瘤病毒（HPV）存在的金标准4然而，通过RT-PCR技术检测新鲜肿瘤组织中的E6/E7 mRNA在常规临床实践中并不实用，目前仅限于研究实验室使用。近期，我们开发了一种名为RNAscope的新型RNA原位杂交（RNA ISH）技术，可在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织标本中实现单个RNA分子灵敏度的多重检测，并定位到单个细胞水平。5-10我们提供了三条证据支持单分子检测5首先，RNAscope探针设计及信号扩增系统能够检测HeLa和SK-BR-3细胞系中单拷贝的HER2基因组DNA靶标。其次，与HER2基因组DNA信号相比，HeLa细胞中HER2 mRNA信号点的荧光强度分布符合每个信号点对应一个分子的特征。第三，每个细胞中HER2 mRNA信号点的数量与基于溶液的定量检测方法所估算的HER2 mRNA拷贝数高度一致，进一步支持了单分子检测的准确性。此外，在荧光显微镜下使用DAPI或在明场显微镜下使用苏木精对细胞核进行复染，可清晰显示单个细胞核，从而实现对单个细胞水平上RNA靶标的检测与定量。10分析基因表达的能力 原位 在常规临床样本中，RNAscope 成为诊断病理学中一个颇具前景的平台，尤其适用于基于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片的检测10,11我们开发了一种基于RNAscope的HPV检测方法，利用型别特异性探针混合物检测七种高危型HPV基因型（HPV16、18、31、33、35、52和58）的E6/E7 mRNA。我们近期在口咽鳞状细胞癌（OPSCC）中的研究表明，RNAscope HPV检测法在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中判定HPV状态具有高度敏感性和特异性12-17，并且还对口咽鳞状细胞癌（OPSCC）的预后具有提示作用12,16.
RNAscope 技术的原理此前已有描述5。本文中，我们介绍完整的 RNAscope 检测实验方案，并展示其在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织切片中检测高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）的应用。
方案
1. 样品、仪器和试剂准备
- 将组织样本切成3-4 mm厚的组织块，用新鲜的10%中性缓冲福尔马林在室温（25 °C）下固定16-32小时，然后包埋于石蜡中。从FFPE组织块上切下5±1 µm厚的切片，将切片贴附于载玻片上 并自然晾干。注意：载玻片可在干燥条件下于室温保存最多3个月。在进行RNAscope检测前，应将贴附组织的载玻片置于60 °C干烤箱中烘烤1小时。
- 将杂交炉预热至40 °C。在湿度控制盘中放入一张加湿纸，并加入50 ml去离子水（dH2O）使其完全润湿。将盖好的湿度控制盘放入杂交炉中，至少预热30分钟后再使用。
- 用去离子水（dH2O）稀释10x预处理液，配制700 ml的1x Pretreat 2溶液（10 nl，pH 6柠檬酸盐缓冲液）。将1x Pretreat 2溶液加热至沸腾，并维持温度在100-104 °C之间，同时防止过度沸腾。
- 用去离子水（dH2O）稀释预热的50x洗涤缓冲液，配制3 L的1x洗涤缓冲液（0.1x SSC）。
- 在通风橱内准备2 × 200 ml二甲苯和2 × 200 ml 100%乙醇，用于脱蜡。
- 在通风橱内准备50%苏木精染色液和蓝化试剂（0.01%氨水），用于染色后处理。
- 在通风橱内准备200 ml二甲苯、200 ml 70%乙醇以及2 × 200 ml 100%乙醇，用于脱水。
- 将靶标探针在40 °C预热10分钟，并将即用型（RTU）检测试剂盒中的试剂恢复至室温，包括RTU Amp1、Amp2、Amp3、Amp4、Amp5-Brown和Amp6-Brown，但DAB显色剂Brown-A和Brown-B除外。
2. RNAscope 检测
脱蜡与脱水
烘烤后，将组织切片在二甲苯中脱蜡，每次5分钟，共两次，期间频繁振荡；然后在100%乙醇中脱水，每次3分钟，共两次，期间频繁振荡。室温下晾干5分钟，并使用疏水屏障笔在组织切片周围画出疏水屏障。
预处理
- 将组织切片与 Pretreat 1 在室温下孵育 10 分钟，以淬灭内源性过氧化物酶活性，随后用 dH2O 冲洗。
- 将组织切片与 Pretreat 2 在沸水浴中孵育 15 分钟，以进行 RNA 回收，随后用 dH2O 冲洗两次。
- 将组织切片与 Pretreat 3 在 HybEZ 烤箱中于 40°C 孵育 30 分钟，以进行蛋白质消化，随后用 dH2O 冲洗两次。
靶标探针杂交
靶标探针HPV-HR 7重混合物包括：HPV16、18、31、33、35、52和58。将HPV探针、泛素C（UBC）探针以及细菌基因dapB探针分别添加至三个相邻的组织切片上。在40 °C烘箱中杂交2小时，然后在1x洗涤缓冲液中室温漂洗，每次2分钟，共漂洗两次。
信号放大
- 孵育组织切片 Amp1 （预扩增仪）在 40 °C 下孵育 30 分钟， Amp2 （背景减少剂）在 40 °C 下孵育 15 分钟， Amp3 （扩增仪）在 40 °C 下反应 30 分钟， Amp4 在 HybEZ 烤箱中于 40 °C 条件下孵育（标记探针）15 分钟。每次杂交步骤后，在室温下用 1x 洗涤缓冲液漂洗 2 次，每次 2 分钟。
- 孵育组织切片 Amp5 30 分钟 Amp6 室温下孵育15分钟。每次孵育步骤后，在1×洗涤缓冲液中室温漂洗2次，每次2分钟。
信号检测
将组织切片与1:1 DAB显色液（等体积混合Brown-A和Brown-B）在室温下孵育10分钟，然后用dH2O冲洗两次。
复染
在室温下用50%苏木精溶液染色组织切片2分钟，用dH2O冲洗至载玻片透明而组织仍呈紫色。将载玻片浸入含0.01%氨水的dH2O中5次，随后再在dH2O中浸洗5次。
载玻片封片
将组织切片依次在70%、100%和100%乙醇中各脱水2分钟，二甲苯中处理5分钟，然后使用含二甲苯的封片介质封片。
结果
RNAscope HPV 检测工作流程
RNAscope 检测具有高度简化的实验流程，类似于免疫组化（IHC）（图1）。该流程包括四个主要步骤：预处理、杂交、信号扩增和检测。该方法采用独特的探针设计策略，可确保高保真的信号扩增5。在 RNAscope HPV 检测中，七种高危型 HPV 探针组被混合使用，均由同一套连接辣根过氧化物酶（HRP）的信号扩增系统识别。特异性杂交信号通过 HRP 催化的显色反应生成棕色沉淀物，以 DAB 作为底物，可在标准明场显微镜下清晰观察到。
HPV 检测的代表性染色
图2展示了头颈部鳞状细胞癌FFPE切片染色后的示例图像。在HPV阳性病例中（图2A），高危型HPV（HR-HPV）探针在肿瘤细胞中检测到强烈的点状信号。UBC探针在肿瘤细胞和间质细胞中均检测到大量点状胞质信号（图2B）。细菌基因dapB探针显示出清晰的背景（图2C）。在HPV阴性病例中，HR-HPV探针和dapB探针均未检测到信号（图2D和2F），而UBC探针则检测到强信号（图2E）。本检测中，UBC作为阳性对照用于评估组织RNA质量，dapB作为阴性对照用于评估背景信号。HPV状态的判读需对每个病例的三张切片进行观察。以阴性对照切片（dapB）的染色水平作为阈值：当出现高于dapB切片信号的点状胞质和/或核染色时，定义为HPV阳性。
图 1. RNAscope 检测流程图。 RNAscope 检测工作流程示意图。RNAscope 检测包含四个主要步骤：预处理、靶标探针杂交、信号放大和信号检测。整个检测过程可在 8 小时内完成。点击此处查看大图。
图 2. RNAscope 染色切片的示例图像。 来自两例头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）病例的石蜡包埋组织切片，使用高危型 HPV（HR-HPV）、UBC（阳性对照）和 dapB（阴性对照）探针进行染色。A-C。HPV 阳性病例。A，肿瘤细胞中 HR-HPV E6/E7 mRNA 的表达。插图：40× 放大倍数，显示点状信号。B 和 C）相邻组织切片分别显示 UBC 阳性染色（B）和 dapB 阴性染色（C）。D-F）HPV 阴性病例。D）HPV E6/E7 mRNA 无染色，与 dapB 阴性对照（F）相似。E）UBC 阳性染色。点击此处查看高清图像。
讨论
RNAscope HPV 检测可实现 E6/E7 mRNA 的直接可视化 原位 在HPV相关性头颈部鳞状细胞癌中。RNAscope检测可完全兼容常规固定的肿瘤组织，并能保持组织形态，便于进行组织病理学相关分析。图2）。RNAscope 检测相较于传统 CISH 方法的一个关键优势在于，它能够特异性地扩增杂交信号（图2B 和 2E）而不会放大背景噪声（图2C 和 2F).
在实际操作中，RNAscope HPV 检测可在8小时内完成，也可方便地分两天进行。RNAscope HPV 检测已被用于确定头颈部鳞状细胞癌中的 HPV 状态12-16，以qRT-PCR作为参考方法时，其敏感性为97%，特异性为93%16。传统的染色原位杂交（ISH）检测高危型HPV DNA具有高度特异性，但敏感性约为80%12。针对细胞替代标志物p16的免疫组织化学（IHC）染色具有良好的敏感性，但可能出现假阳性结果15,18，尤其是在非口咽部头颈部肿瘤中15。目前用于检测HPV E6/E7 mRNA的“金标准”方法qRT-PCR需要新鲜冷冻组织才能获得最佳结果，且技术操作复杂，因此仅限于研究实验室使用。此外，该方法需要进行RNA提取，因而无法将高危型HPV E6/E7 mRNA的表达与组织病理学特征进行关联分析。
RNAscope 检测成功的关键因素有多个。首先，为获得最佳结果，应根据 ASCO/CAP 指南19，将组织在室温下用新鲜的 10% 中性缓冲福尔马林固定 16–32 小时。其次，强烈推荐使用 HybEZ 烤箱，因为它能够对探针杂交和信号扩增步骤的温度和湿度实现最佳控制。第三，在每一步操作前必须彻底去除残留缓冲液，但同时需确保组织切片在任何步骤中均不干燥。
本文所述的手动RNAscope实验流程已完全在商用切片自动染色系统上实现自动化10。这将极大促进临床病理实验室中检测条件的标准化，并节省宝贵的人工操作时间。此外，已有专门的图像分析软件被开发出来10，可自动识别数字化切片上的细胞及染色信号，有助于消除主观判断，提高评分的可重复性。
总之，RNAscope HPV 检测可识别高危型 HPV E6/E7 mRNA 转录本的存在 原位 在FFPE组织中，该技术具有临床病理实验室所熟悉的流程，可直接在组织切片中可视化这些目标物。它为检测（FFPE）组织样本提供了理想的平台，并可被诊断病理实验室轻松采用。
披露
所有作者均受雇于并持有Advanced Cell Diagnostics, Inc.的股票。
致谢
部分由美国国立卫生研究院资助（R43/44CA122444）和美国国防部乳腺癌研究计划资助（W81XWH-06-1-0682）支持，资助对象为YL。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SuperFrost Plus 载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ 烤箱、托盘和支架 | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE 试剂盒 - 棕色 | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 探针（针对 HPV 16、18、31、33、35、52 和 58 型 E6/E7 mRNA） | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge 疏水屏障笔 | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% 乙醇 | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| 二甲苯 | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| 吉氏苏木精 I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| 氢氧化铵 | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| 盖玻片 24 mm × 50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| 加热板 | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| 干燥烤箱 | 能够维持温度在 60±1 °C | ||
| 水浴锅 | 能够维持温度在 40±1 °C |
参考文献
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