靶向脑内常驻细胞进行直接谱系重编程为脑修复提供了新的前景。本文介绍了一种从成人人类大脑皮层制备富含脑内常驻周细胞的培养物，并通过逆转录病毒介导的转录因子 Sox2 和 Ascl1 表达将这些细胞转化为诱导性神经元的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
直接将非神经元细胞转分化为诱导性神经元（iNs）可能为揭示神经发生的分子机制提供线索，并为 体外 对病变大脑进行建模或修复。鉴定出可直接转化为诱导性神经元（iNs）的大脑常驻非神经元细胞类型，可能有助于推动此类方法的实施 原位, 即 在受损脑组织内。本文描述了一种旨在鉴定来源于成人人脑并满足此前提的细胞的实验方案。该方案包括：（1）培养从成人人脑活检获得的脑皮层组织中分离的人源细胞；（2） 体外 扩增（约需2-4周）并通过免疫细胞化学和流式细胞术对培养物进行表征；（3）利用抗PDGF受体-β和抗CD146抗体通过荧光激活细胞分选（FACS）进行富集；（4）通过逆转录病毒介导转导神经发生相关的转录因子sox2和ascl1；（5）最后，在逆转录病毒转导后14天至8周内，通过免疫细胞化学对获得的周细胞来源诱导神经元（PdiNs）进行表征。在此阶段，可采用膜片钳记录技术检测iNs的电生理特性。该方案提供了一种高度可重复的操作流程，用于 体外 脑内周细胞直接转化为功能性人源神经元
引言
与将体细胞重编程为诱导性多能干细胞（iPSCs）——后者具有多种分化潜能——不同，直接重编程旨在实现一种特定细胞类型向另一种细胞类型的直接转化。在疾病建模及潜在的细胞治疗应用背景下，这两种重编程策略各有优劣。iPSC重编程（i）可提供近乎无限的细胞来源；（ii）允许进行基因工程操作；（iii）具备几乎无限的分化潜能。然而，iPSC的主要缺点包括未分化细胞的致瘤风险（畸胎瘤形成） 体内）以及对 离体 培养及后续移植，如果这些细胞将用于细胞治疗。相反，直接谱系重编程受限于目标细胞产量较低，这与起始细胞群体中靶向细胞的数量直接相关，但其优势在于谱系重编程细胞在移植后似乎不具有致瘤风险1,2此外，直接重编程甚至可以实现 原位, 即 在需要这些细胞的器官内部，从而避免了移植的需要。
鉴于此，本实验室致力于探索将脑内常驻细胞直接谱系重编程为诱导性神经元（iNs）的可能性，作为一种针对神经退行性疾病的新型细胞治疗策略。可作为谱系重编程潜在细胞靶点的脑内常驻细胞包括多种类型的巨胶质细胞（星形胶质细胞、NG2细胞和少突胶质细胞）、小胶质细胞以及微血管相关细胞（内皮细胞和周细胞）。我们已对这些 体外 新生小鼠大脑皮层星形胶质细胞的重编程潜能3-5在寻找适用于成年人大脑直接谱系重编程的类似理想细胞来源时，我们发现了一类可成功重编程为诱导性神经元（iNs）且具有周细胞特征的细胞群体。本文描述了如何从成年人大脑活检组织中分离、扩增和富集这类细胞的实验方案 体外，最终成功重编程了其中相当大比例的细胞 体外 将扩增的细胞（扩增率在25-30%范围内）转化为诱导性神经元（iNs）。通过逆转录病毒介导的同时共表达两种转录因子sox2和ascl1，可实现重编程。这些诱导性神经元（PdiNs）表现出重复性动作电位放电的能力，并可作为其他神经元的突触靶标，表明其具备整合入神经网络的功能。本方案提供了一种简便的流程，用于分离成人人类脑部周细胞并将其转分化为诱导性神经元（iNs）。
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方案
1. 成人人类脑细胞的分离与培养
涉及人体组织的实验应遵循所有关于将人体材料用于科研目的的相关政府和机构法规。本方案的制定已获得慕尼黑大学医学院伦理委员会的批准，并取得了所有患者的书面知情同意。
本方案采用患有颞叶癫痫或其他深部非创伤性、非恶性病变的男女患者的标本，建立了人成年大脑皮层的培养方法。手术室获取的组织仅包含通向脑部病变区域的路径部分，因此被视为健康组织。患者的年龄范围为19至70岁。
- 通过向含 GlutaMAX 的高糖 DMEM 培养基中加入热灭活的胎牛血清（FCS），配制终浓度为 20% FCS 的生长培养基。在总共 500 ml 的生长培养基中加入 5 ml 青霉素/链霉素。所有需要无菌培养条件的操作步骤均须在适当的层流罩内进行。
- 将手术室获取的成人人类脑活检组织置于含 CaCl2 和 MgCl2 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中，并添加 HEPES（终浓度 10 mM），冰上保存直至处理。应尽快开始处理。
- 为开始组织解离成单细胞，将组织转移至 65 mm 培养皿中，使用两把无菌的一次性解剖刀将其切碎成小块。用于酶解消化时，在 15 ml 锥形管中加入 3–6 ml TrypLE，于 37 °C 水浴中孵育 15–30 分钟。
- 加入 1 体积预热的生长培养基以促进解离，先用 5 ml 一次性移液管，再用玻璃巴斯德移液管，轻柔地将含有组织碎片的溶液上下吹打，直至细胞悬液均匀。通常仍会残留少量组织碎片，主要为白质成分。
- 以 157 × g 离心 5 分钟，将沉淀重悬于适量生长培养基中（每未包被的 T75 培养瓶加 10 ml）。每 5–10 mm 直径大小的活检组织使用一个 T75 培养瓶，更大样本可依此比例推算。
- 将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 和 5% O2 的培养箱中培养。
- 每 3–4 天更换一半培养基，直至细胞达到汇合状态。此过程通常需要最多两周时间（称为第 0 代 [P0]）。
2. 体外 成人人类脑细胞的扩增与表征
- 体外扩增：
- 吸除培养基，并用室温保存的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后加入 3 ml TrypLE。
- 在 37 °C 下孵育 5–10 分钟，直至大多数细胞脱落；轻轻敲击培养瓶以促进细胞脱落；加入 3 倍体积的生长培养基后，将细胞转移至 15 ml 锥形管中，在 157 × g 条件下离心 5 分钟，随后将细胞重悬于适量的生长培养基中。
- 以 1:3 的传代比例将细胞接种至新的 T75 细胞培养瓶中，以获得最佳产量。
注意：这些细胞已传代至 P5 代，未见重编程效率下降的迹象。在 P0 代时，培养物中含有相当比例的内皮细胞（通过 CD34 表达评估），但在后续传代中其数量变得可忽略不计。
- 成人人类脑细胞培养物的表征：
- 免疫细胞化学：
- 为进行细胞表征，将约 60,000 个细胞接种于 24 孔组织培养板中经多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，每孔加入 500 μl 新鲜生长培养基，在 37 °C、5% CO2 和 5% O2 条件下孵育。
- 对培养的人类脑细胞进行免疫细胞化学分析时，移除培养基，并用 1 ml PBS 洗涤 3 次 。
- 加入 500 μl 含 4% 多聚甲醛的 PBS，在室温下固定 15 分钟。
- 将玻璃盖玻片转移至适当的湿化染色盒中，用含 3% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.5% Triton X-100 的 80 μl PBS 在室温下封闭 1 小时。
- 将一抗用相同溶液稀释（稀释比例见特定试剂与设备表），在 4 °C 过夜孵育或室温孵育 1 小时。
注意：在此培养阶段，有相当比例但数量可变的细胞对血小板源性生长因子受体 β（PDGFRβ）、分化簇 146（CD146）、NG2 硫酸软骨素蛋白聚糖以及平滑肌肌动蛋白（SMA）呈免疫阳性，即微血管相关周细胞的特征性标志物。仅有少数细胞（<1%）表达星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和 S100β。此外，在此阶段的培养物中应不存在表达神经元标志物 βIII-微管蛋白的细胞。使用多种一抗组合进行不同标志物的共标记。通过逆转录及定量实时聚合酶链反应可进一步验证胶质细胞、神经元、内皮细胞和周细胞标志物的表达（本方案未描述该步骤）。 - 一抗孵育后，用 1 ml PBS 洗涤三次，向染色液中加入相应二抗（适当稀释），室温避光孵育 1 小时。用 PBS 洗涤细胞 3 次 。如需，在封片前加入 DAPI 染色 5 分钟（室温）。
- 使用抗荧光淬灭封片剂，通过落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察盖玻片。
- 流式细胞术：
- 为使用流式细胞术分析表面标志物表达，将细胞在未包被的 T25 或 T75 细胞培养瓶中培养至完全汇合。
- 使用前述方法用 TrypLE 消化细胞，并重悬于含 PBS + 0.5% BSA 的染色液中。每项染色反应将 100,000–200,000 个细胞重悬于 100 μl 染色液中。为每种抗体（CD146-FITC、CD140b-PE、CD34-APC、CD13-FITC 及相应的同型对照抗体）分别设置单染反应。
- 将荧光素偶联抗体直接加入细胞悬液的染色液中（稀释比例见特定试剂与设备表），在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
- 用 500 μl PBS 洗涤细胞三次，每次洗涤后在 157 × g 条件下离心 5 分钟。
- 将细胞沉淀重悬于 0.5–1 ml 染色液中，经 70 μm 细胞滤网过滤后转移至 FACS 管中。样品需避光保存。
- 上机前将样品涡旋混匀。
- 为分析活细胞并排除碎片和细胞聚集体，根据 FSC-A 和 SSC-A 设门。通过 FSC-A 和 FSC-W 排除细胞双联体。为确定细胞表面标志物的正确设门条件，使用与相应荧光素偶联的同型对照抗体设定门控，然后确定抗体结合细胞的比例。
- 免疫细胞化学：
3. 通过荧光激活细胞分选富集周细胞来源的细胞
- 在转导前，通过使用70 μm喷嘴的FACS分选对悬浮于生长培养基中的周细胞群体进行纯化。使用CD34-APC联合CD140b-PE和CD146-FITC标记物筛选周细胞。分选CD34阴性、CD140b阳性和CD146阳性细胞。
- 将分选后的细胞收集至生长培养基中，接种于24孔组织培养板内经多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，于37 °C、5% CO2和5% O2条件下培养。
- 分选后48小时，更换为新鲜生长培养基，并按照 方案 4所述进行转导。
4. 逆转录病毒转导周细胞来源细胞并重编程为诱导神经元
注意：处理逆转录病毒颗粒时，请参考当地的生物安全指南。在德国，使用此处所采用的逆转录病毒需要达到生物安全二级水平。有关逆转录病毒颗粒的制备，请参见方案6。用于重编程的逆转录病毒载体构建信息请参见 Karow 等（2012）。逆转录病毒使用 VSV-G（水疱性口炎病毒糖蛋白）进行假型化5。具体制备方法请参见 Gavrilescu 等6。
- 逆转录病毒转导前 24 小时，将约 60,000 个细胞接种至 24 孔组织培养板中经多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，每孔加入 500 μl 新鲜培养基，在 37 °C、5% CO2 和 5% O2 条件下培养。
- 次日，弃去原培养基，更换为 500 μl 新鲜预温的培养基，并加入 1 μl 含相应浓缩病毒颗粒的上清液（对照组使用 pCAG-IRES-dsred，尤其在实验室建立该方案时），实验组使用 pCAG-ascl1-IRES-dsred 或 pCAG-sox2-IRES-gfp。
- 再过一天后，移除含病毒颗粒的培养基，加入 1 ml 新鲜预温的 B27 分化培养基（由 49 ml 高糖 DMEM（含 GlutaMAX）和 1 ml B27 无血清添加剂组成）。将细胞继续在 37 °C、5% CO2 和 5% O2 条件下培养 4–8 周，期间不更换培养基，因为重复换液会对逐渐成熟的诱导神经元（iNs）造成损伤。
5. 通过免疫细胞化学法鉴定诱导神经元
- 为确定转导细胞的细胞身份，特别是验证其获得神经元表型，应对神经元抗原（如 bIII-tubulin、MAP2 和 NeuN）进行免疫细胞化学染色（抗体及其相应稀释比例见特定试剂与设备表；操作步骤参照 2.2.1 所述方法）。
- 为促进PdiNs的成熟，可将这些细胞与来自E14小鼠大脑皮层的神经元进行共培养。具体操作为：分离大脑皮层组织，并使用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管通过机械法解离组织。在用编码sox2和ascl1的逆转录病毒转导后的2-3周，将10,000-50,000个小鼠神经元加入至周细胞来源细胞的培养物中，并继续培养。转导的细胞可通过报告基因（GFP和dsRed）的表达与小鼠神经元区分，可采用活细胞落射荧光观察，或通过GFP与dsRed的免疫细胞化学染色进行鉴定。
- 为评估小鼠神经元向PdiNs形成突触的情况，对囊泡神经递质受体（如囊泡谷氨酸转运蛋白1（vGluT1））进行免疫细胞化学染色。
- 检测转导细胞的电学特性（即 产生动作电位的能力）以及通过膜片钳电生理技术验证功能性突触的形成。有关实验步骤的详细信息，请参见 Heinrich 等 (2011).
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结果
该方案成功建立人成年大脑皮层组织培养后的首个结果，是鉴定培养物的细胞组成。通过细胞类型特异性蛋白的免疫细胞化学染色，可揭示来自不同患者组织样本的培养物之间存在显著的异质性（图1A）。通过流式细胞术定量，始终存在相当比例的细胞表达 PDGFRβ（平均约 75%，范围从 30% 至高达 99%）；周细胞的其他标志物如 CD146、NG2 和 CD13 通常表达水平较低（图1B）。同样，通过免疫细胞化学检测发现，培养的细胞中有一小部分亚群表达SMA。图1A). 在第0代（P0）时，通常有 7总之，培养物中最大比例的细胞表达典型的周细胞蛋白和mRNA。在此阶段，可通过流式细胞荧光分选（FACS）进一步富集周细胞来源的细胞。当培养物纯度处于较低水平（由PDGFRβ...
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讨论
本实验方案描述了 体外 从成人人大脑皮层中分离出周细胞来源的细胞后，对其进行扩增和富集，并通过逆转录病毒介导表达神经发生相关转录因子 Sox2 和 Ascl1，将其转化为诱导性神经元。该方案提供了一种实验方法 体外 研究脑内常驻细胞直接转化为神经元，以及可能转化为胶质细胞的谱系转分化系统，旨在最终将这种直接转化策略应用于临床 体内 成年大脑的环境
技术注意事项
在本研究中，我们使用了来自19至70岁、两性患者的脑组织。我们未观察到重编程效率在性别或年龄之间存在明显差异7。然而，仍建议记录这些信息，因为可能存在一些较为细微的差异，但未被我们注意到。
建议在组织样本转移至实验室后尽快开始处理。由于组织在转移给实验人员之前在手术室中停留的时间存在一些未知因素，因此难以完全控制。我们估计，在本研究7中，组织从患者脑部切除至开始培养程序的时间间隔为2至6小时，且样本在此期间始终保存在冰上。在...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 Magdalena Götz 博士在本实验方案开发过程中提供的建议。感谢 Marius Wernig 博士（斯坦福大学）慷慨提供 sox2 编码序列。我们还非常感谢 Alexandra Lepier 博士在病毒制备方面的帮助。本研究得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目号：BE 4182/2-2）和德国联邦教育与研究部（BMBF，项目号：01GN1009A）对 B.B. 的资助，以及巴伐利亚州科学、研究与艺术部对 M.K. 和 B.B. 的资助。C.S. 获得了德-斯洛文尼亚双边 SYSTHER-INREMOS 虚拟研究所（德国和斯洛文尼亚联邦教育与研究部）以及德国研究基金会（DFG，SFB 824）的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗 CD140b-PE | BD Biosciences | 558821 | 使用比例 1:100 |
| 抗 CD146-FITC | AbD Serotec | MCA2141FT | 使用比例 1:100 |
| 抗 CD13-FITC | AbD Serotec | MVA1270A488T | 使用比例 1:100 |
| 抗 CD34-APC | BD Biosciences | 560940 | 使用比例 1:100 |
| 抗 PDGFRβ | Cell Signaling | 3169S | 使用比例 1:200 |
| 抗 CD146 | Abcam | Ab75769 | 使用比例 1:400 |
| 抗 NG2 | Millipore | AB5320 | 使用比例 1:400 |
| 抗 SMA | Sigma-Aldrich | A2547 | 使用比例 1:400 |
| 抗 βIII-微管蛋白 | Sigma-Aldrich | T8660 | 使用比例 1:400 |
| 抗 MAP2 | Sigma-Aldrich | M4403 | 使用比例 1:200 |
| 抗 GFAP | Sigma-Aldrich | G3893 | 使用比例 1:600 |
| 抗 GFP | Aves Labs | GFP 10-20 | 使用比例 1:1,000 |
| 抗 RFP | Chromotek | 5F8 | 使用比例 1:500 |
| 抗 S100β | Sigma-Aldrich | S2532 | 使用比例 1:300 |
| 抗 NeuN | Millipore | MAB377 | 使用比例 1:200 |
| 抗 GABA | Sigma-Aldrich | A2052 | 使用比例 1:500 |
| 抗 钙视网膜蛋白 | Millipore | AB5054 | 使用比例 1:500 |
| 抗 vGluT1 | SYnaptic SYstems | 135511 | 使用比例 1:1,000 |
| 大鼠 IgG1 同型对照 FITC | AbD Serotec | 11-4301-81 | 使用比例 1:100 |
| 大鼠 IgG1 同型对照 PE | AbD Serotec | 12-4301-81 | 使用比例 1:100 |
| 大鼠 IgG1 同型对照 APC | AbD Serotec | 17-4301-81 | 使用比例 1:100 |
| TrypLE | Invitrogen | 12605-010 | |
| DMEM，高糖，含 GlutaMAX | Invitrogen | 61965 | |
| B27 无血清添加剂 | Invitrogen | 17504044 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10106-169 | 56 °C 水浴 30 分钟进行热灭活 |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140122 | |
| HBSS（Hanks 平衡盐溶液） | Invitrogen | 24020-091 | |
| 不含 CaCl2 和 MgCl2 的杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS，1×） | Invitrogen | 14190 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（PDL） | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| 多聚甲醛（PFA） | Sigma-Aldrich | P1648 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）双乳酸盐 | Sigma-Aldrich | 042M4005 | |
| Aqua-Poly/Mount 封片剂 | Polysciences | 18606-20 | |
| 聚丙烯圆底离心管 | BD Biosciences | 352063 | |
| 带细胞筛盖的聚苯乙烯圆底离心管 | BD Biosciences | 352235 | |
| 24 孔板 | Orange Scientific | 5530305 | |
| 75 cm2 培养瓶 | Greiner Bio-One | 658175 | |
| 25 cm2 培养瓶 | Greiner Bio-One | 690175 | |
| 10 ml 一次性移液管 | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| 玻璃巴斯德移液管（150 mm） | Fisherbrand | FB50251 | |
| 直径 12 mm 玻璃盖玻片 | Menzel | CB00120RA1 | |
| 一次性手术刀片 | B. Braun | 5518083 | |
| 组织培养皿 | Greiner Bio-One | 633180 | |
| 15 ml 锥形离心管 | BD Biosciences | 352095 | |
| 层流罩 | |||
| 离心机及配带 15 ml 和 50 ml 离心管适配器的摆动转子 | Hettich Lab Technology | 1406 | |
| 流式细胞分选仪：FACSAria l 配套 FACSDiva 软件 | BD Biosciences | ||
| 恒温恒湿细胞培养箱 | Eppendorf Galaxy 170R | ||
| 37 °C 水浴锅 | |||
| FACSFlow 鞘液 | BD Biosciences | 342003 | |
| 落射荧光显微镜 BX61 | Olympus | ||
| 共聚焦显微镜 LSM710 | Zeiss |
参考文献
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