一种利用荧光法快速简便测定藻类细胞中中性脂质的方案

摘要

本文描述了一种利用尼罗红染色法测定藻类细胞中性脂质含量的简单方案。该技术省时高效，可作为传统基于重量法的脂质定量方法的替代方案，并专为生物工艺性能监测这一特定应用而设计。

摘要

由于具有天然的脂质储存能力，藻类被认为是可再生燃料来源的理想候选者。对藻类发酵过程进行有效监控以及筛选新的富油藻株，需要一种快速且可靠的细胞内脂质含量测定方案。目前的方法主要依赖于几十年前开发的重量法技术来测定含油量，这些方法耗时较长且需要较大的样品量。本文将尼罗红（Nile Red）——一种已被广泛用于多种生物中脂滴检测的荧光染料——整合到一个简单、快速且可靠的检测流程中，用于测定绿藻 Auxenochlorella protothecoides 的中性脂质含量。该方法使用乙醇这一相对温和的溶剂在染色前对细胞膜进行通透处理，并采用96孔微孔板以提高荧光强度测定时的样品通量。本方法专为生物过程性能监测而设计，可用于检测先前干燥的样品或正在培养中的活体样品。

引言

由于藻类在特定胁迫条件下能够储存脂质体，近年来作为潜在的可再生燃料来源受到了广泛关注^1,2。在适宜的生长条件下，中性脂质可占细胞干重的60%以上³。然而，目前工业界尚缺乏一种简单、洁净、快速且可靠的标准化方法来定量藻类细胞中的脂质含量，从而难以有效监测生物过程性能、分析培养物以及筛选新藻株。

大约50年前开发的Bligh-Dyer重量法至今仍是常用的技术之一^4,5。尽管该方法操作简单、可靠且易于实施，但耗时较长，需要较大的样品量，并使用有毒溶剂。因此，该方法不适用于分析一次发酵过程中产生的大量样品，或用于筛选新的高油脂含量菌株。虽然已开发出其他一些方法，但通常需要先进的设备，且尚未实现标准化⁶。

另一种备受关注的方法是尼罗红染色。尼罗红是一种在非极性环境中优先产生荧光的染料，已被用于鉴定或定量多种生物体内的脂质体，包括线虫⁷、酵母⁸、细菌⁹和藻类^10-19。早期涉及尼罗红的技术大多为定性或半定量方法，将染料与单光程比色皿分光光度法或流式细胞术结合使用。此外，某些藻类（如绿藻）具有较厚的细胞壁，对染料基本不透，这限制了该技术的应用范围¹⁰。

已有研究报道了对尼罗红染色方法的....

方案

1. 分离干燥的藻类生物量作为荧光读数的标准品

1. 从生长中的藻类培养物中取出一定体积的样品，确保至少提供 200 mg 干生物质，最好为 400–600 mg。
2. 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，并用与培养基 pH 相同的磷酸盐缓冲液等体积洗涤沉淀。
3. 重复步骤 1.2，共进行 3 次洗涤。
4. 将沉淀重悬于去离子水中，转移至已称重的称量皿中，在 50 °C 下干燥 48 小时。注意：真空条件下干燥可缩短干燥时间，而在高于 50 °C 的温度下干燥可能导致重悬困难。
5. 将干燥的藻类培养物于室温保存，以备后续使用。

2. 通过己烷提取法进行中性脂质的重量法定量（改编自 Bligh 和 Dyer⁴）

1. 在称量皿中称取约50 mg的干燥藻类生物量。注：使用40–80 mg范围内的质量不会影响实验的可重复性。
2. 将生物质转移至已用正己烷预洗过的研钵中。如有必要，使用巴斯德吸管取少量（1 ml）正己烷冲洗称量皿，以确保生物质完全转移至研钵中。注意：正己烷为高挥发性且有毒物质，必须在通风橱中操作，并穿戴适当的防护服。
3. 使用研杵研磨藻类生物量5分钟。开始时轻轻研磨，然后逐渐增加力度，在5分钟内将生物量研磨成细腻均匀的糊状物。若在将生物量转移至研钵时使用了过量己烷，建....

结果

使用尼罗红染色的代表性藻类细胞如图1所示。图1的A和B部分展示了在氮过量条件下培养的A. protothecoides图像，此时细胞内脂质积累极少。C和D部分则显示了在氮限制条件下培养的A. protothecoides样品。在透射照明下，通过仔细观察图1C可看到细胞内的脂质体，其呈现为闪亮的圆形结构，并占据细胞体积的大部分。如图1A所示，在氮过量条件下培养的细胞，其干重含油量仅为5%，且不含显著水平的脂质体。

在适当的光照条件下观察时，这些样本之间的差异会被放大。含油量低的细胞呈现为具有暗色细胞体的荧光环（图 1B），而含油量高的细胞则在其脂质体积累的区域显示出明亮的橙红色荧光（图 1D）。在 .......

讨论

标准曲线中所用的藻类必须与待测样品在相同实验条件下培养的同一种类。培养基成分、培养技术以及染色方案的显著变化均可能影响荧光读数的强度。本研究采用正己烷提取法（见第1和第2部分）测定标准曲线所用样品的中性脂质含量。为获得准确的荧光强度测量结果，所有样品必须在相同的生物量浓度下进行分析（本研究中使用5 g/L）。随后可通过与标准曲线比较，简便地确定含油量。在本实验方案中，藻类在摇瓶中以异养条件培养（28 °C，100 rpm），葡萄糖作为碳源（30 g/L），甘氨酸作为氮源（0.2–2.0 g/L）。详细的培养基配方见表1。

在进行本实验方案时，一个重要的考虑因素是制备标准曲线过程中湿藻类生物量的干燥条件。建议使用45 °C的真空烘箱。若使用45–50 °C的普通烘箱，只要延长干燥时间（24–48小时）以确保样品完全干燥，也可达到同样效果。温度超过50 °C可能导致生物量融合在一起，或形成难以在磷酸盐缓冲液中重新悬浮的致密结壳。可借助匀浆器促进重新悬浮。应避免使用表面活性剂或强碱等化学添加剂，因为这些物质通常会影响荧光读数。干燥后的藻类培养物可在密封容.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
干重
25 ml 一次性移液管	Fisher	13-676-10K
移液球	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene 聚四氟乙烯（Teflon）离心管	Fisher	05-562-16A	正己烷实验需使用聚四氟乙烯材质
称量皿（聚丙烯）	Fisher	2-202B
1.5 ml 微量离心管	Fisher	05-408-129
离心机	Sorvall	RC6plus
干燥烘箱（Fisher 625D）	Fisher	13-254-2
储存小瓶	Fisher	0337-4
台式微量离心机（Eppendorf 5415D）	Fisher	05-40-100
重量法定量分析
瓷研钵（Coorstek）	Fisher	12-961A
瓷研杵（Coorstek）	Fisher	12-961-5A
40 ml 离心管（FEP）	Fisher	05-562-16A	也可使用玻璃管
巴斯德玻璃移液管	Fisher	13-678-20C
铝制称量皿	Fisher	08-732-101
正己烷	Fisher	H292-4
荧光法定量测定油脂含量
荧光多孔板读板仪	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
荧光读板仪软件	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 圆底 96 孔板	Fisher	06-443-2
尼罗红	Sigma	N3013-100MG
乙醇（分析纯）	Fisher	AC65109-0020
荧光细胞成像
Leica DMRXA2（或同等型号）显微镜	Leica	DMRXA2
显微镜载玻片	Fisher	12-550-15
显微镜盖玻片	Fisher	12-541B
相机	Qimaging	Retiga Ex
成像软件	Qimaging	QCapture v.1.1.8