本文描述了一种利用尼罗红染色法测定藻类细胞中性脂质含量的简单方案。该技术省时高效，可作为传统基于重量法的脂质定量方法的替代方案，并专为生物工艺性能监测这一特定应用而设计。
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摘要
摘要
由于具有天然的脂质储存能力，藻类被认为是可再生燃料来源的理想候选者。对藻类发酵过程进行有效监控以及筛选新的富油藻株，需要一种快速且可靠的细胞内脂质含量测定方案。目前的方法主要依赖于几十年前开发的重量法技术来测定含油量，这些方法耗时较长且需要较大的样品量。本文将尼罗红（Nile Red）——一种已被广泛用于多种生物中脂滴检测的荧光染料——整合到一个简单、快速且可靠的检测流程中，用于测定绿藻 Auxenochlorella protothecoides 的中性脂质含量。该方法使用乙醇这一相对温和的溶剂在染色前对细胞膜进行通透处理，并采用96孔微孔板以提高荧光强度测定时的样品通量。本方法专为生物过程性能监测而设计，可用于检测先前干燥的样品或正在培养中的活体样品。
引言
由于藻类在特定胁迫条件下能够储存脂质体，近年来作为潜在的可再生燃料来源受到了广泛关注1,2。在适宜的生长条件下，中性脂质可占细胞干重的60%以上3。然而，目前工业界尚缺乏一种简单、洁净、快速且可靠的标准化方法来定量藻类细胞中的脂质含量，从而难以有效监测生物过程性能、分析培养物以及筛选新藻株。
大约50年前开发的Bligh-Dyer重量法至今仍是常用的技术之一4,5。尽管该方法操作简单、可靠且易于实施，但耗时较长，需要较大的样品量，并使用有毒溶剂。因此，该方法不适用于分析一次发酵过程中产生的大量样品，或用于筛选新的高油脂含量菌株。虽然已开发出其他一些方法，但通常需要先进的设备，且尚未实现标准化6。
另一种备受关注的方法是尼罗红染色。尼罗红是一种在非极性环境中优先产生荧光的染料，已被用于鉴定或定量多种生物体内的脂质体，包括线虫7、酵母8、细菌9和藻类10-19。早期涉及尼罗红的技术大多为定性或半定量方法，将染料与单光程比色皿分光光度法或流式细胞术结合使用。此外，某些藻类（如绿藻）具有较厚的细胞壁，对染料基本不透，这限制了该技术的应用范围10。
已有研究报道了对尼罗红染色方法的近期改进，克服了该方案最初的不足之处10,11。在含有载体溶剂（如DMSO10或乙醇10,11）的条件下对细胞进行染色，可使油脂含量与吸光度之间的关系呈线性，从而实现可靠的定量测量。该溶剂有助于通透细胞膜，使尼罗红分子能够穿过细胞膜。此外，结合使用具备微孔板读板功能的分光光度计，可实现适用于定量分析的高通量实验流程。
本文详细介绍了一种通过尼罗红染色结合乙醇（一种温和溶剂）测定微藻细胞含油量的简便方法。为了最准确地校正测量中的背景噪声，采用已知油脂组成的微藻细胞建立荧光强度与油脂含量之间的标准曲线。该方法改编自先前发表的实验方案10,11。利用96孔分光光度计，可在1小时内完成 gravimetric 方法需数天才能检测的相同数量样品的分析。此外，通过使用目标微藻物种的代表性样品进行校准，该方法可获得相对精确且可直接解释的测量结果。目前已有多项实验方案描述了针对不同藻株和应用优化的尼罗红染色法；本文所述方案最初由 de la Hoz Siegler et al.11 针对 Auxenochlorella protothecoides、Chlorella vulgaris、Scenedesmus dimorphus 和 Scenedesmus obliquus 开发，但该方法可能同样适用于更多种类和类群的微藻。本方案专为监测生物过程性能而设计，对先前干燥的样品以及来自生长培养物的湿样品均具有良好的适用性。
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方案
1. 分离干燥的藻类生物量作为荧光读数的标准品
- 从生长中的藻类培养物中取出一定体积的样品，确保至少提供 200 mg 干生物质，最好为 400–600 mg。
- 在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，并用与培养基 pH 相同的磷酸盐缓冲液等体积洗涤沉淀。
- 重复步骤 1.2，共进行 3 次洗涤。
- 将沉淀重悬于去离子水中，转移至已称重的称量皿中，在 50 °C 下干燥 48 小时。注意：真空条件下干燥可缩短干燥时间，而在高于 50 °C 的温度下干燥可能导致重悬困难。
- 将干燥的藻类培养物于室温保存，以备后续使用。
2. 通过己烷提取法进行中性脂质的重量法定量（改编自 Bligh 和 Dyer4）
- 在称量皿中称取约50 mg的干燥藻类生物量。注：使用40–80 mg范围内的质量不会影响实验的可重复性。
- 将生物质转移至已用正己烷预洗过的研钵中。如有必要，使用巴斯德吸管取少量（1 ml）正己烷冲洗称量皿，以确保生物质完全转移至研钵中。注意：正己烷为高挥发性且有毒物质，必须在通风橱中操作，并穿戴适当的防护服。
- 使用研杵研磨藻类生物量5分钟。开始时轻轻研磨，然后逐渐增加力度，在5分钟内将生物量研磨成细腻均匀的糊状物。若在将生物量转移至研钵时使用了过量己烷，建议等待己烷完全挥发后再进行研磨。
- 加入几毫升正己烷至研钵中，用研杵搅拌所得浆液，直至均匀。确保附着在研钵壁上的所有细胞碎片均被刮下并悬浮于液体中。
- 将己烷-细胞混合物转移至离心管中。注：离心管必须为玻璃材质，或与己烷相容的合适聚合物材质（如聚四氟乙烯）。
- 重复步骤 2.4 和 2.5，直至所有生物量均转移至离心管中（3–5 次）。
- 在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 20 分钟。
- 用移液器小心地将上清液转移至已预称重的金属称量皿中。存放于通风橱内。
- 执行 2nd 加入3 ml 己烷至沉淀中，剧烈涡旋震荡1 min，进行己烷萃取。
- 重复步骤 2.7 和 2.8。如有必要，在第二次提取过程中将样品在离心机中运行 30 分钟，以确保所有细胞碎片完全沉淀。待正己烷完全蒸发后，通过重量法测定提取油的质量。
3. 使用尼罗红进行中性脂质的荧光定量分析（由 de la Hoz Siegler 等人报道et al.11）
注意：进行荧光检测仅需 10 µl 浓度为 5 g/L 的藻类悬浮液。通常，从 1.5 ml 培养液中分离得到的干藻类生物量已完全足够。此外，分光光度计中光源的光强可能随时间衰减。建议在每次实验中均加入标准样品，以确保仪器变化不会为测量结果引入不必要的误差。
- 配制尼罗红溶液，浓度为10 µg/ml，溶剂为试剂级乙醇。将该溶液避光保存于4 °C。
- 用去离子水配制30% (v/v) 的乙醇溶液，并于4 °C保存。
- 将所有藻类样品调整至相同的生物量浓度（推荐5 g/L），并以与测量所用标准品相同的方式制备。可通过将预干燥样品悬浮于适量磷酸盐缓冲液（0.6 g/L 磷酸氢二钾，1.4 g/L 磷酸二氢钾）中，或在测定浊度后用磷酸盐缓冲液将生长中的藻类培养物浓度调整至5 g/L来实现。注意：对活体藻类培养物进行测量时，其误差通常较大，具体取决于浊度校准曲线的精确度。重新悬浮干燥样品可能需要使用均质器以充分分散生物量。
- 对于每个样品，在96孔板的单个孔中混合80 µl 30%乙醇溶液、10 µl 尼罗红溶液和10 µl 藻类悬浮液。为准确反映荧光测量的变异性，每个样品需进行5次重复。
- 使用先前制备的标准品运行两点校准曲线，以校正仪器和操作在不同日期间的差异。标准品的制备方法应与样品相同。注意：通常两点足以完成仪器重新校准，也可运行三点以验证线性关系。
- 在多功能酶标仪分光光度计中进行荧光测定。以下条件被证明可获得最一致的结果11：
- 以1,200 rpm转速振荡，轨道直径3 mm，持续30秒。
- 在40 °C孵育10分钟。
- 以1,200 rpm转速振荡，轨道直径3 mm，持续30秒。
- 记录荧光信号，激发波长530 nm，发射波长604 nm。
- 利用内标法结果将荧光测定值转换为油脂含量。
4. 荧光显微镜技术
注意：第3节中描述的染色方案旨在用于定量分析，但也可用于为教育和示意图目的提供基于染色技术的可视化展示。要获得样品荧光的图像，需要配备传统透射光和附加落射荧光照明光源的光学显微镜。尼罗红染色需要激发光和发射光滤光片，其波长范围分别为530 nm（绿色）和604 nm（红色），以及配备相应软件的显微镜相机系统。本研究中展示的图像（图1）是使用配备相机和黑白转RGB转换单元的明场显微镜获取的。使用这些工具生成尼罗红荧光图像的操作步骤如下：
- 根据方案第3节，用尼罗红染色剂制备培养样品。注意：浓度在5 g/L范围内的样品可产生细胞密度适宜且不拥挤的载玻片。
- 完成染色方案第3.6步后，按照标准实验室操作程序制备处理后样品的显微镜载玻片。
- 将制备好的玻片载入显微镜，在透射模式下用所需的放大倍数找到细胞（本文所示图像使用100倍物镜获取）。
- 聚焦后，将显微镜从透射光模式切换至落射荧光照明模式。此时光源应直接来自物镜（可通过目视观察载玻片与物镜之间的空间来确认）。
- 将绿色激发滤光片插入光源，并将红色发射滤光片插入观察光路；此时，染色细胞的荧光应可通过目镜直接观察到。
- 将显微镜的观察模式从目镜切换至连接的相机，使用成像软件捕获荧光细胞的图像。根据相机的灵敏度不同，样品在预览窗口中可能最初不可见即 屏幕将变黑）；为解决此问题，应调整相机的曝光时间和增益，使细胞可见。具体设置参数将因仪器、设备和细胞类型而异。
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结果
使用尼罗红染料染色的代表性藻类细胞如图1所示。图1的A和B部分展示了在氮过量条件下培养的A. protothecoides细胞图像，此条件下细胞内脂质积累极少。C和D部分则显示了在氮限制条件下培养的A. protothecoides样品。在透射照明下，通过仔细观察图1C，可见细胞内的脂质体呈现为闪亮的圆形结构，并占据细胞体积的大部分。如图1A所示，在氮过量条件下培养的细胞，其干重含油量仅为5%，且不含显著水平的脂质体。
在适当的光照条件下观察时，这些样本之间的差异会被放大。含油量低的细胞呈现为具有暗色细胞体的荧光环状结构（图1B），而含油量高的细胞则在其脂质体富集区域显示出明亮的橙红色荧光（图1D）。在
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讨论
标准曲线中所用的藻类必须与待测样品在相同实验条件下培养的同一种类。培养基成分、培养技术以及染色方案的显著变化均可能影响荧光读数的强度。本研究采用正己烷提取法（见第1和第2部分）测定标准曲线所用样品的中性脂质含量。为获得准确的荧光强度测量结果，所有样品必须在相同的生物量浓度下进行分析（本研究中使用5 g/L）。随后可通过与标准曲线比较，简便地确定含油量。在本实验方案中，藻类在摇瓶中以异养条件培养（28 °C，100 rpm），葡萄糖作为碳源（30 g/L），甘氨酸作为氮源（0.2–2.0 g/L）。详细的培养基配方见表1。
在进行本实验方案时，一个重要的考虑因素是制备标准曲线过程中湿藻类生物量的干燥条件。建议使用45 °C的真空烘箱。若使用45–50 °C的普通烘箱，只要延长干燥时间（24–48小时）以确保样品完全干燥，也可达到同样效果。温度超过50 °C可能导致生物量融合在一起，或形成难以在磷酸盐缓冲液中重新悬浮的致密结壳。可借助匀浆器促进重新悬浮。应避免使用表面活性剂或强碱等化学添加剂，因为这些物质通常会影响荧光读数。干燥后的藻类培养物可在密封容...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢加拿大自然科学与工程研究理事会为本项目提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 干重 | |||
| 25 ml 一次性移液管 | Fisher | 13-676-10K | |
| 移液球 | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene 聚四氟乙烯（Teflon）离心管 | Fisher | 05-562-16A | 正己烷实验需使用聚四氟乙烯材质 |
| 称量皿（聚丙烯） | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml 微量离心管 | Fisher | 05-408-129 | |
| 离心机 | Sorvall | RC6plus | |
| 干燥烘箱（Fisher 625D） | Fisher | 13-254-2 | |
| 储存小瓶 | Fisher | 0337-4 | |
| 台式微量离心机（Eppendorf 5415D） | Fisher | 05-40-100 | |
| 重量法定量分析 | |||
| 瓷研钵（Coorstek） | Fisher | 12-961A | |
| 瓷研杵（Coorstek） | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml 离心管（FEP） | Fisher | 05-562-16A | 也可使用玻璃管 |
| 巴斯德玻璃移液管 | Fisher | 13-678-20C | |
| 铝制称量皿 | Fisher | 08-732-101 | |
| 正己烷 | Fisher | H292-4 | |
| 荧光法定量测定油脂含量 | |||
| 荧光多孔板读板仪 | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| 荧光读板仪软件 | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 圆底 96 孔板 | Fisher | 06-443-2 | |
| 尼罗红 | Sigma | N3013-100MG | |
| 乙醇（分析纯） | Fisher | AC65109-0020 | |
| 荧光细胞成像 | |||
| Leica DMRXA2（或同等型号）显微镜 | Leica | DMRXA2 | |
| 显微镜载玻片 | Fisher | 12-550-15 | |
| 显微镜盖玻片 | Fisher | 12-541B | |
| 相机 | Qimaging | Retiga Ex | |
| 成像软件 | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
参考文献
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