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囊性纤维化跨膜电导调节蛋白在Saccharomyces cerevisiae中表达后的纯化

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DOI：

10.3791/51447

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2014年5月10日

 ,  ,  , 
1Faculty of Life Sciences, University of Manchester

本文内容

摘要

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）的异源表达与纯化是囊性纤维化药物研发中的重大挑战和限制因素。本方案描述了两种可用于功能与结构研究的、适用于毫克级产量的CFTR分离方法。 

摘要

囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）蛋白的功能缺陷会导致囊性纤维化（CF），这是一种常染色体隐性遗传病，目前使患者的平均预期寿命低于<40岁。开发新型药物分子以恢复CFTR的活性是治疗囊性纤维化的重要目标，而分离出具有功能活性的CFTR蛋白是实现这一目标的重要步骤。

我们描述了两种从真核异源表达系统酿酒酵母（S. cerevisiae）中纯化CFTR蛋白的方法。与原核表达系统类似，酿酒酵母（S. cerevisiae）可在实验室中快速生长且成本低廉，同时还能对大型膜蛋白进行转运及翻译后修饰。在任何膜蛋白的纯化过程中，选择用于溶解和纯化的去垢剂是关键步骤。在筛选了CFTR在多种去垢剂中的溶解性后，我们选择了两种性质不同的去垢剂用于纯化，从而使最终获得的CFTR样品可根据后续计划进行的实验进行优化调整。

本方法中，我们比较了在十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）和1-十四酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)（LPG-14）中纯化CFTR蛋白的效果。通过本方法在DDM中纯化的蛋白在功能检测中表现出ATP酶活性。而在LPG-14中纯化的蛋白则具有高纯度和高得率，可用于翻译后修饰的研究，并适用于小角X射线散射和电子显微镜等结构生物学方法，但其ATP酶活性显著降低。

引言

囊性纤维化（CF）是欧洲和北美最常见的遗传性疾病，发病率约为每2,500例活产婴儿中有1例。当囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）蛋白发生突变，导致其在上皮细胞质膜上的功能丧失时，便会引发CF1。该缺陷最严重的后果是不可逆的肺损伤，使患者预期寿命缩短至<40岁2,3。

CFTR 是一种 ATP 结合盒（ABC）转运蛋白，但在进化过程中已转变为一种离子通道1,4。尽管其在细胞质膜中的功能已发生显著改变，CFTR 仍与其他 ABC 转运蛋白保持较高的序列同源性。有趣的是，CFTR 的特化区域（即其调控区以及 N-末端和 C-末端）与其他后生动物的 ABC 转运蛋白之间并无明显的序列相似性，因此目前尚无线索可解释这些序列在 CFTR 中的起源。  根据其一级结构，CFTR 被归类为 ABC 转运蛋白家族中的 C 亚家族成员，但目前尚无有力证据表明其与该亚家族之间存在残留的功能关联。已有部分文献报道 CFTR 具有谷胱甘肽转运活性5-7，这与其它 C 亚家族成员的功能相符8,9；然而，也有研究指出还原型谷胱甘肽可能抑制 CFTR 的 ATP 酶活性，而非表现出 ABC 转运蛋白典型的底物诱导激活效应10。离子电导的测量具有足够高的灵敏度，可用于研究单个 CFTR 分子的通道活性1，CFTR 通道的特性已被作为时间、温度、ATP 浓度、膜电位和磷酸化状态的函数进行监测，同时也可在多种小分子抑制剂、增效剂和调节剂存在的情况下进行观察。这些研究极大地增进了我们对 ABC 转运蛋白功能机制的理解。然而，CFTR 的大量表达及其后续纯化一直极具挑战性，目前仅有少数实验室取得成功10-13。

开发更有效药物的需求十分紧迫，但这一过程因缺乏用于小分子筛选的纯化CFTR蛋白而受到阻碍。解决CFTR蛋白的表达与纯化问题，将能够实现高通量药物筛选，以纠正囊性纤维化（CF）中的主要缺陷，同时也将为高分辨率结构研究开辟途径，从而指导合理药物设计。此外，该蛋白一些相对基础的生化特性，例如其功能性寡聚状态、相互作用蛋白以及ATP酶活性，至今仍缺乏充分表征。我们此前已报道过在S. cerevisiae14中大规模表达带有GFP和His标签的小鼠CFTR的实验方案，现进一步描述CFTR的纯化方法。我们已利用这些方法纯化了五种CFTR的直系同源物，并以鸡CFTR的纯化为例展示相关数据。在膜蛋白纯化过程中，选择用于溶解和纯化的去垢剂是关键步骤。在筛选了多种去垢剂中CFTR的溶解性后，我们选定了两种性质不同的去垢剂用于纯化。十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）是一种非离子型去垢剂，已被广泛用于膜蛋白的结构与功能研究15-21。离子型去垢剂1-十四酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)（LPG-14）对CFTR具有高效的溶解除能力，并已在此前用于功能性膜蛋白的纯化10,22,23，包括从S. cerevisiae24中纯化CFTR。

方案

1. 缓冲液的配制

  1. 配制100倍浓度的蛋白酶抑制剂（PI）混合液：将96 mg AEBSF、3.5 mg 胰凝乳蛋白酶抑制剂（chymostatin）、10 mg E64、16.5 mg 亮肽素（leupeptin）、16.5 mg 胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）、348 mg PMSF 和 4 mg 亮氨酰氨肽酶抑制剂（bestatin）溶于20 ml DMSO中。分装为每管1 ml，于-20 °C保存。配制100倍浓度的苯甲脒（benzamidine）储备液：将720 mg溶于20 ml超纯水（ddH₂O）中。2O），分装为1 ml等份，于-20 °C保存。此量足以进行一次纯化。所有缓冲液中，PI和苯甲脒储存液均按1:100稀释使用。
  2. 配制“mPIB”缓冲液（0.3 M Tris pH 8，0.3 M 蔗糖，2 mM DTT）和“CFTR”缓冲液（50 mM Tris pH 8，20% (v/v) 甘油，1 mM DTT），并冷却至 4 °C。使用前，根据用于重悬细胞沉淀的 mPIB 体积，按 1:100 比例加入蛋白酶抑制剂混合物和 1:100 比例的苯甲脒例如，使用3.5 ml PI和3.5 ml 苄胺（benzamidine），总体积为350 ml mPIB。
  3. 配制溶解缓冲液。溶血磷脂酰甘油-14（LPG）溶解缓冲液（50 mM Tris pH 8，10% (v/v) 甘油，50 mM NaCl，1 mM DTT，蛋白酶抑制剂（PIs）和 4% (w/v) LPG）和十二烷基麦芽糖苷（DDM）溶解缓冲液（50 mM Tris pH 8，20% (v/v) 甘油，1 M NaCl，1 mM DTT，蛋白酶抑制剂，4% (w/v) DDM）。可将缓冲液置于超声水浴中（35 W，40 kHz）超声处理以促进去垢剂分散，但避免涡旋混合，以免产生气泡。使用前冷却至 4 °C。
  4. 用于LPG纯化的CFTR纯化缓冲液为50 mM Tris、10% (v/v) 甘油、50 mM NaCl、1 mM DTT、0.1% (w/v) LPG-14以及蛋白酶抑制剂。配制350 ml该缓冲液，另配制150 ml相同缓冲液并添加1 M 咪唑。将两种缓冲液的pH均调至8.0。
  5. 用于DDM中纯化的缓冲液包含50 mM Tris pH 8、20% (v/v) 甘油、1 M NaCl、1 mM DTT、0.1% (w/v) DDM。配制该缓冲液350 ml，另配制含1 M 咪唑的相同缓冲液150 ml。将两种缓冲液的pH均调节至8。
  6. 用于含LPG的凝胶渗透色谱（GPC）缓冲液，配制50 mM Tris pH 8、10% (v/v) 甘油、50 mM NaCl、1 mM DTT、0.05% (w/v) LPG-14。使用DDM进行GPC时，配制缓冲液为50 mM Tris pH 8、20% (v/v) 甘油、1 M NaCl、1 mM DTT、0.1% (w/v) DDM。所有缓冲液和ddH₂O2O用于GPC柱时，应先经滤膜（0.2 μm）过滤并脱气后使用。
  7. SDS-PAGE上样缓冲液（2倍工作浓度）：50 mM Tris-HCl pH 7.6，5%（v/v）甘油，5 mM EDTA，0.02%（w/v）溴酚蓝。分装为700 μl每份，于-20 °C保存。使用前，每700 μl缓冲液中加入200 μl 20%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）和100 μl 新鲜配制的0.5 M DTT。与样品在室温下孵育至少10分钟后再上样。切勿加热；加热会导致GFP变性，并可能引起CFTR聚集。
  8. 为制备用于重组的脂质储备液，溶解按重量比4:1的混合物 E. coli 氯仿和甲醇（2:1 体积比）中的脂质和胆固醇，在玻璃小瓶中用氮气吹干2 在氮气下孵育2小时以形成脂质膜。加入不含NaCl的GPC缓冲液，使脂质浓度达到40 mg/ml，并通过反复涡旋和超声处理（35 W，40 kHz）使溶液澄清。
  9. ATP酶活性检测中，通过将SCH28080溶于DMSO配制成1 mM的溶液，NaSCN溶于ddH₂O配制成1 M的溶液，分别制备100倍浓缩储备液。2O 和寡霉素溶于 100% (v/v) 乙醇至终浓度为 2.5 mM，分装后于 -20 °C 保存。配制 100 ml ATP 酶缓冲液，含 50 mM Tris（pH 7.4）、150 mM NH4Cl，5 mM MgSO₄4 和 0.02% (w/v) NaN3可于室温保存，并用于多项检测。使用前立即配制5 mM ATP储备液，并置于冰上保存。（注意：使用Na2ATP以防止磷酸盐在检测中产生过强的背景信号）。配制SDS终止液（12%（w/v）SDS溶于ddH₂O中）。2O
  10. 使用前立即配制Chifflet检测试剂缓冲液A（3% (w/v) 抗坏血酸，0.5% (w/v) 钼酸铵，0.5 M HCl）和缓冲液B（2% (w/v) 柠檬酸钠，2% (w/v) 亚砷酸钠，2% (v/v) 乙酸）。

2. 酵母微粒体的分离

  1. S. cerevisiae 表达鸡CFTR的细胞按O’Ryan所述方法培养 等 (2012)14将20 L发酵产物分装成两份，于-80 °C保存，可储存长达6个月。
  2. 快速解冻一份细胞，在每克细胞中加入3 ml预冷的mPIB重悬。
  3. 使用直径为425-600 μm的玻璃珠，在珠磨机中破碎细胞。使用五次 细胞破碎过程采用1分钟破碎与1分钟间歇交替进行。（间歇至关重要，可确保破碎过程中细胞不会过热。）
  4. 通过离心1 ml珠磨机裂解液样品来监测细胞破碎情况。在台式离心机中离心（12,000 × g，4 °C，5 min）。将上清液用mPIB在比色皿中稀释至1:50，测定A380. 如果 A380 > 0.1，或尽管已进行多次重复的珠击破碎循环但OD值不再上升，则进入下一步。否则，重复步骤2.3–2.4。
  5. 离心总细胞裂解液（12,000 x g，4 °C，20 分钟）。保留上清液。弃去沉淀（含有未破碎的细胞和线粒体）；但如果对细胞破碎效率存在任何疑问（参见 2.4），则也保留沉淀。
  6. 将上一步的上清液离心（200,000 × g，4 °C，1.5 小时）。弃去上清液，用 CFTR 缓冲液重悬沉淀的微粒体膜。若微粒体用于后续以 DDM 进行纯化，则在 CFTR 缓冲液中添加 1 M NaCl。
  7. 重复对重悬的膜组分进行离心（100,000 × g） g，4 °C，1 小时）并弃去上清液。
  8. 将沉淀的微粒体用最小体积的CFTR缓冲液重新悬浮（终体积5–15 ml，微粒体总蛋白量70–200 mg）。可采用Bradford法测定微粒体蛋白的总浓度。25此外，应测量膜的荧光发射光谱（激发波长 = 485 nm，发射波长 = 500–600 nm），并应显示出明显的GFP荧光峰（最大值位于512 nm）。CFTR可在SDS-PAGE凝胶上通过GFP荧光条件扫描进行特异性检测（图1).
  9. 将重悬的微粒体浸入液氮中速冻，于 -80 °C 保存，或继续进行步骤 3。

3. 微粒体的溶解

  1. 若为冷冻状态，使用前需立即在10 °C水浴中解冻微粒体。
  2. 为溶解膜成分，将微粒体与等体积的相应溶解缓冲液（步骤1.3）混合，使终浓度为2%（w/v）的去垢剂和5 mg/ml的微粒体蛋白浓度。在4 °C条件下振荡孵育（试管旋转仪）1小时。保留200 μl用于分析。
  3. 将混合物离心（100,000 × g）, 4 °C，45 分钟）。移除含有溶解膜蛋白的上清液，经 0.45 μm 注射器滤器过滤后置于冰上保存。测定上清液的荧光值（同步骤 2.8）。
  4. 将不溶性组分重悬于1% (w/v) SDS溶液中，体积与可溶性组分相等。测定该组分的荧光值，并保留50 μl等分试样用于SDS-PAGE分析。

4. CFTR的镍亲和纯化

  1. 将两个 5 ml 镍-Sepharose 柱串联连接。先用 2 个柱体积（CV）的 20%（v/v）乙醇洗涤，随后用 2 CV 的 ddH2O 洗涤，然后用含 1 M 咪唑的溶解缓冲液（步骤 1.4–1.5）洗涤 2 CV。再用不含咪唑的溶解缓冲液重复洗涤 2 CV。
  2. 向溶解后的样品（步骤 2.8）中加入咪唑，使其终浓度为 5 mM，然后手动将样品上样至层析柱，或在使用自动液相色谱仪时注入样品环中。
  3. 以 0.5 ml/min 的流速将溶解后的样品上样至层析柱，并以相同流速用 2 CV 不含咪唑的缓冲液洗涤，以去除未结合的物质。用 50 ml Falcon 管收集洗脱组分。
  4. 第一次洗涤时，使用含 40 mM 咪唑的纯化缓冲液 3 CV，流速为 1 ml/min。收集 2 ml 的组分。
  5. 第二次洗涤时，使用含 100 mM 咪唑的纯化缓冲液 3 CV。收集 2 ml 的组分。
  6. 用含 400 mM 咪唑的纯化缓冲液 3 CV 从 HisTrap 柱上洗脱 CFTR。收集 2 ml 的组分。
  7. 检测洗脱组分中的荧光信号（步骤 2.8）。
  8. 保留峰值组分的部分样品用于 SDS-PAGE 分析。其余峰值组分样品迅速冷冻后于 -80 °C 保存，或直接进入下一步纯化流程。

5. CFTR 的凝胶渗透色谱（GPC）纯化

  1. 用 1.2 个柱体积的 ddH2O 平衡色谱柱（Superose 6 10/300 GL），随后用 1.2 个柱体积的 GPC 缓冲液进行平衡。
  2. 在步骤 5.1 期间，在 4 °C 下使用 100,000 MWCO 的离心浓缩管，对 GFP 荧光最强的 Ni 亲和纯化组分进行浓缩。若在 DDM 中进行纯化，避免将样品浓缩至蛋白浓度超过 0.3 mg/ml，否则将导致显著的样品损失。从浓缩装置中取出截留液，并在 4 °C 下以 100,000 ×g 离心 30 分钟，以沉淀大颗粒物质。
  3. 将此样品上样至色谱柱，并用 1.2 个柱体积的 GPC 缓冲液进行等度洗脱。收集 0.5 ml 的组分。
  4. 按照第 2.8 节方法测定 GFP 荧光，以确定含有 CFTR 的组分。保留每管少量样品（例如 50 μl），用于 SDS-PAGE 分析。
  5. 用液氮速冻各组分，并在 -80 °C 下保存。

6. CFTR 的重建

  1. 将脂质（步骤 1.8）以 100:1（w/w）的脂质-蛋白比例加入纯化的 CFTR 中，在 4 °C 下孵育 1 小时。同样设置仅含脂质的对照组，用相同体积的 GPC 缓冲液替代纯化蛋白。
  2. 使用疏水性吸附珠从蛋白/脂质混合物中去除去垢剂。用 5 CV 的 ddH2O、5 CV 的 70%（v/v）乙醇、5 CV 的 ddH2O 以及 5 CV 不含去垢剂的 GPC 缓冲液依次洗涤吸附珠。每毫升纯化蛋白中加入 200 mg 洗涤后的吸附珠，于 4 °C 轻柔振荡过夜孵育。
  3. 用细头移液器吸头将重构成分从吸附珠中转移至新的离心管中。

7. ATP酶活性的测定

  1. 使用改良的Chifflet法26,27，在96孔板中测定CFTR特异性ATP酶活性。用磷酸钠储备液（0.65 mM）配制0–20 nmol磷酸标准品，终体积为50 µl。使用CFTR缓冲液与ATP酶缓冲液1:1混合液稀释磷酸盐储备液。
  2. 将重组CFTR和空白脂质体分别与1:100（v/v）ATP酶抑制剂（步骤1.9）在冰上孵育10分钟。每组至少使用5 μg重组CFTR。
  3. 加入ATP（步骤1.9），使其终浓度为2 mM，在25 °C孵育1小时。通过向各孔（包括标准品孔）加入40 μl 10%（w/v）SDS（步骤1.9）终止反应。
  4. 每孔加入100 μl缓冲液A（步骤1.10），孵育10分钟。再向每孔加入100 μl缓冲液B（步骤1.10），在适用于96孔板的紫外/可见光分光光度计中于800 nm波长处测定吸光度。
  5. 利用磷酸盐标准品将800 nm处的吸光度转换为释放的磷酸量。通过减去背景信号（仅含脂质体的孔）计算ATP水解速率。
  6. 对于未重组的CFTR，使用CFTR缓冲液进行背景读数，并遵循相同实验流程。

结果

上述方案是一种高效分离富含CFTR微粒体的方法，在细胞破碎及粗制微粒体制备过程中，CFTR的回收率几乎达到完全（图1）。其他细胞破碎方法也可有效采用。我们曾使用法国压力细胞（French pressure cell），以及其他高压/空化装置（也可结合红宝石靶撞击）进行操作，均获得同等效率。出于操作便捷性和设备初始成本较低的考虑，我们认为珠击法（bead-beating method）为最佳选择。

使用LPG溶解并纯化CFTR获得了 80 μg 蛋白/L 培养液在 >90% 纯度（图2）。高产量归因于LPG对CFTR的有效增溶（比较 图2b，第2道和第4道）。此外，CFTR与柱材料的高效且紧密结合导致未结合组分中CFTR的损失极小，并且在洗涤组分中未检测到CFTR图2，第3、5和6泳道）。洗脱蛋白的纯度为 >90%，通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶结合CFTR条带及杂质条带的密度测定法估算。凝胶过滤色谱（GPC）将LPG纯化的CFTR与低分子量杂质分离图4，下图）

使用DDM纯化CFTR的方案可获得约60%的纯度和每升约50 μg的产量（图3）。对凝胶过滤层析（GPC）在约10 ml处洗脱的组分进行负染电镜（EM）分析（图4）显示，DDM纯化的CFTR包含直径为20–30 nm的聚集体以及直径约10 nm的较小颗粒（数据未显示）。这些小聚集体可能具有可逆的结合与解离特性，因为使用截留分子量为1 MDa的超滤膜无法去除电镜下可见的聚集体。LPG纯化的样品无法吸附至辉光放电处理的载网，因此采用未染色组分进行冷冻电镜（cryo-EM）分析。结果显示，样品颗粒大小相对较小（直径6–8 nm），且具有高度均一性（数据未显示）。

最后，检测了纯化蛋白的ATP酶活性（图5）。作为ABC蛋白家族的一员，CFTR具有两个核苷酸结合结构域（NBDs），能够结合和/或水解ATP。实验数据显示，以LPG增溶状态纯化的蛋白无法水解ATP，而在DDM存在时仅表现出较弱的ATP酶活性（图5，空心柱）。在添加脂质并去除去垢剂后，经DDM纯化的样品其ATP酶活性提高了4倍（13 nmol ATP/min/mg蛋白）。对使用LPG分离的CFTR，在添加脂质并去除LPG后，其活性也得到恢复，但最终活性低于经DDM纯化并重组的样品（1.5 nmol ATP/min/mg蛋白）。

显示不同离心速度下蛋白质分离的电泳凝胶；箭头指示条带。
图 1. 在微粒体分离和洗涤过程中不同离心步骤的细胞裂解液（CL）、上清液（S）和沉淀（P）中鸡CFTR蛋白水平的监测。 通过GFP标签的凝胶内荧光显影SDS-PAGE凝胶。细胞破碎后在14,000 × g离心的上清液几乎含有全部CFTR（包括降解产物）。在200,000 × g超速离心后，全长CFTR全部沉淀，部分片段仍留在上清液中。盐洗涤微粒体在100,000 × g超速离心后，几乎所有CFTR均进入沉淀，同时进一步去除了部分片段。

显示蛋白质条带的SDS-PAGE凝胶电泳结果；左侧为分子量标记物。
图2. 通过固定化金属离子亲和层析法在LPG中纯化鸡CFTR蛋白。 各组分通过SDS-PAGE分析，随后进行考马斯亮蓝染色（上图）和GFP标签的荧光检测（下图）。泳道：(1) 微粒体。(2) LPG溶解的微粒体。(3) 未结合物质。(4) 不溶性物质。(5) 和 (6) 分别为40 mM和100 mM咪唑洗涤组分。(7) 用400 mM咪唑洗脱的组分。

显示蛋白质分离结果的SDS-PAGE电泳凝胶，包含洗脱和洗涤泳道。
图3. 通过固定化金属离子亲和层析法在DDM中纯化鸡CFTR。 各组分经SDS-PAGE分析后进行考马斯亮蓝染色。左侧图显示洗脱前的各组分；右侧图显示连续的洗脱组分，箭头所指为CFTR。后续组分中富含一种40 kDa的污染物，质谱鉴定该污染物为核糖体蛋白L3。

尺寸排阻色谱和凝胶电泳结果；蛋白质紫外吸收峰。
图 4. 通过凝胶过滤色谱纯化鸡CFTR蛋白。 经镍亲和色谱纯化的CFTR蛋白被浓缩后上样至GPC柱。上图显示了在含有LPG-14（实线）或DDM（虚线）的缓冲液中纯化的CFTR的洗脱曲线叠加图。SDS-PAGE分析（下图）显示，CFTR的洗脱体积介于8至11 ml之间。

ATP酶活性柱状图；比较DDM、DDM+脂质、LPG、LPG+脂质；酶活性分析。
图5. 纯化的鸡CFTR组分的ATP酶活性。 在ATP酶抑制剂混合物存在下，采用改良的Chifflet法26检测在DDM或LPG中纯化的蛋白（空心柱），以消除F型、P型和V型ATP酶的背景活性。在去除去垢剂并添加脂质后也测定了ATP水解速率（实心柱）。图中显示了均值和标准差（n=3）。有脂质与无脂质条件下ATP酶活性的均值差异，以及DDM与LPG中的活性差异均具有统计学意义（p<0.05）。

讨论

我们此前已描述了一种小鼠CFTR过表达的方法14。自该方案发表以来，我们利用相同的系统表达并纯化了多种不同的CFTR直系同源物。迄今为止测试的所有直系同源物在LPG去垢剂中均能良好纯化，而DDM纯化在不同直系同源物之间的效果则表现出较大差异（数据未显示）。这种灵活性体现了酵母表达系统的优势：可以相对快速地筛选大量构建体，从而选择出适用于特定目的的构建体。

在用 DDM 溶解之前，先用含有 1 M NaCl 的缓冲液洗涤酵母微粒体，可获得更纯净的微粒体制备物，并减少后续步骤中的杂质。此步骤在 LPG 方案中并非必需，因为最终的 CFTR 样品在不进行微粒体洗涤的情况下纯度已超过>90%。此外，在 DDM 中进行纯化时，需对溶解和纯化所用的缓冲液进行若干调整，主要是添加额外的甘油和盐。这些调整共同显著增强了 DDM 溶解蛋白与层析柱的结合能力。

DDM 纯化方法仍有改进空间，特别是需要去除一种 40 kDa 的主要污染物。根据质谱分析，该污染物来源于酵母核糖体亚基 L3，该蛋白似乎对镍树脂具有内在亲和力。L3 蛋白中并无明显的多聚组氨酸序列，但当其结合于核糖体时的三维结构（PDB = 1FFK）显示，折叠后的 L3 亚基可能形成一个多聚组氨酸簇。在 LPG 纯化产物中该条带问题较小，可能归因于 LPG 去垢剂更为剧烈的性质。

尽管在DDM中的纯化效果似乎不如LPG，但像DDM这样的温和去垢剂可能更适用于功能和结构分析，并且已被用于多项膜蛋白的X射线晶体学研究15-21。此外，我们的结果表明，与在DDM中纯化相比，使用LPG会导致CFTR的ATP酶功能丧失。因此，我们建议在需要高纯度CFTR的应用中选择基于LPG的纯化方案，例如翻译后修饰的表征或抗体的制备；而在需要保持蛋白质活性和完整天然构象的应用中，则推荐采用基于DDM的纯化方案作为更优选择。

综上所述，本实验方案描述了一种可重复的CFTR蛋白纯化方法，该方法使用两性离子去污剂LPG-14或非离子型去污剂DDM进行CFTR的分离。因此，本方法所涵盖的CFTR纯化条件范围较以往报道的方法更为广泛10-13。此外，当本方法与高产量酵母培养系统（如20 L发酵罐）以及高通量细胞收获系统（如6 L低速离心转子）联用时，可获得毫克级的纯化CFTR蛋白。所获得的CFTR蛋白带有可切割的GFP标签，便于在各种生物化学与生物物理检测中对蛋白进行便捷监测。

本文所述试剂（含鸡CFTR的质粒或冷冻酵母细胞）可通过美国囊性纤维化基金会获取。

披露

作者对本研究不存在竞争性财务利益或其他冲突性利益。

致谢

本工作由美国囊性纤维化基金会（CFF）通过其CFTR三维结构联盟资助。TR由英国囊性纤维化信托基金研究生奖学金资助，NC由英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）研究生奖学金资助。我们感谢CFF CFTR三维结构联盟的同事们提供的帮助与建议，以及在密码子优化的鸡CFTR序列和纯化标签设计方面给予的支持。 

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 μm 注射器滤器 SartoriusFC121
100 kDa 截留分子量离心浓缩管（PES 膜）VivaspinVS0641
2 ml 微量离心管Sarstedt72.695
40Ti 转子Beckman Coulter337901
50 ml 无菌 Falcon 管Sarstedt62.547.254
三磷酸腺苷二钠盐（Na2ATP）Sigma-AldrichA26209
液相色谱系统GE Healthcare28-4062-64
氨基乙基苯磺酰氟（AEBSF）Sigma-AldrichA8456
玻璃珠振荡细胞破碎仪BioSpec1107900
台式离心机 HERMLEZ300
台式离心机 Eppendorf5417R
台式微量离心机 Fisher13-100-511
盐酸苄脒Sigma-Aldrich434760
疏水性 SM-2 吸附珠BioRad152-3920
溴酚蓝Sigma-Aldrich114391
离心管Beckman Coulter357000
凝胶成像系统BioRad170-808
胆固醇Sigma-AldrichC8667
抑肽酶 Sigma-AldrichC7268
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD8418
二硫苏糖醇（DTT）Sigma-Aldrich43815
E. coli 总脂质提取物Avanti lipids100500
环氧琥珀酰-亮氨酰胺基丁烷（E-64）Sigma-AldrichE3132
酸洗玻璃珠SigmaG8772
甘油Fisher65017
HisTrap HP 柱（5 ml）GE Healthcare17-5247-05
快速考马斯亮蓝染色液NovexinISB1L
离心机 JA-17 转子Beckman Coulter369691
亮抑蛋白酶肽Merck108975
溶血磷脂酰甘油-14（LPG）Avanti lipids858120
MgSO4Sigma-AldrichM7506
凝胶电泳槽 SDS-PAGE 系统BioRad165-8006
n-十二烷基-β-D-麦芽糖吡喃苷（DDM）AffymetrixD310S
NaClSigma-AldrichS6191
NaN3Sigma-AldrichS2002
NH4ClSigma-AldrichA9434
寡霉素Sigma-Aldrich75351
超速离心机Beckman Coulter392050
预染蛋白质标准品FermentasSM1811
脱盐柱（Sephadex G-25）GE Healthcare17-0851-01
胃蛋白酶抑制剂 ASigma-AldrichP4265
苯甲基磺酰氟（PMSF）Sigma-AldrichP7626
SCH28080Sigma-AldrichS4443
十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma-AldrichL37771
硫氰酸钠（NaSCN）Sigma-Aldrich251410
凝胶过滤 10/300 GL 柱GE Healthcare17-5172-01
Tris 碱FormediumTRIS01
超速离心管Beckman Coulter355618
涡旋混合器Star LabsN2400-0001
超声波水浴仪UltrawaveF0002202
多功能酶标仪BioTekBTH1MF

参考文献

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CFTR 纯化酵母表达去垢剂增溶镍亲和层析凝胶过滤层析ATP酶活性检测脂质重组DDM缓冲液LPG-14去垢剂微粒体分离
囊性纤维化跨膜电导调节蛋白在Saccharomyces cerevisiae中表达后的纯化
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