通过高剪切均质化与连续浓缩制备基于脂质的高浓度氧微泡乳剂

摘要

我们描述了利用高剪切均质化和连续浓缩方法制备大量用于静脉输氧的脂质基氧微泡（LOMs）的工艺。

摘要

充气微泡已被开发用作超声造影剂和药物递送载体。微泡可通过超声处理、机械搅拌、微流控装置或均质化等方法处理表面活性剂制备而成。近年来，基于脂质的氧微泡（LOMs）被设计用于在医疗紧急情况下通过静脉输注输送氧气，以逆转危及生命的低氧血症，预防继发性器官损伤、心脏骤停和死亡。本文介绍了利用闭环高剪切均质器规模化制备高氧含量微泡的方法。该工艺可在90分钟内生产2升浓度较高的LOMs（体积占比90%）。所得微泡的平均直径约为2 μm，当稀释至60%体积时，其流变学特性与血液一致。该技术具备高产能和高氧气纯度的优点，表明其可能适用于转化医学研究实验室。

引言

由蛋白质、聚合物和脂质外壳组成的微泡已被开发用于药物递送、基因治疗以及超声造影剂^1-5。由于这些治疗用途需要微泡在血管内持久存在，因此通常使用惰性、高分子量的气体（如全氟碳化物）填充此类微泡⁶，这类气体在血液中溶解度低，有助于稳定微泡结构^3,4。

近年来，脂质基氧微泡（LOMs）被设计用于递送治疗剂量的氧气，可能在气道阻塞或低氧血症期间维持终末器官的氧供，并防止血流动力学不稳定⁷。用于静脉气体递送的乳剂在设计上需具备不同于超声造影剂或靶向药物递送系统的特点。首先，由于机体消耗大量氧气（约200 ml/min），LOMs必须能够大规模制备和注射，这就要求生产工艺具备高效率。其次，制造过程应为闭环系统，以避免LOMs（应完全充满100%氧气）暴露于环境空气中而导致氮气污染。第三，由于LOMs的用途是静脉气体递送，应在考虑乳剂黏度限制的前提下，尽可能提高其气体含量⁷。最后，与所有静脉注射制剂一样，必须精确控制颗粒粒径分布，以避免微血管阻塞⁸。

目前已有多种成熟的微泡制备方法。超声法利用高强度、低频率的超声作用于含有表面活性剂（如两亲性磷脂）的乳剂气-液界面，在存在气相空间的条件下生成微泡^7,9。通过调节超声频率、功率和脉冲持续时间，可控制该过程，并定制所得微泡的粒径分布；然而，超声法在临床用微泡的生产中很少被采用。混合法是在密闭系统中对表面活性剂和气体进行剧烈机械搅拌，但该方法也难以放大以适应大体积生产²。基于液滴的微流控技术可实现对微泡粒径分布的精确控制^10-13。尽管传统上该技术难以放大，已有研究报道了多通道、高速微流控系统，可提高微泡的生产效率¹³。采用上述任一方法制备的微泡，可能需要在制备后进行粒径减小处理，例如离心分级^14,15和微泡浮选^16,17。

另一种成熟的制备高度稳定微泡的方法是剪切均质化⁶，该方法可在微泡表面形成稳定的六边形磷脂排列结构¹⁸。基于这一原理，我们描述了采用在线高剪切均质器来制备自组装脂质氧微泡（LOMs）¹⁹。在此过程中，均质器利用高速旋转的刀片与双层精细网状乳化筛网紧密作用，产生高强度的机械和流体剪切力，从而形成微泡。通过该系统连续浓缩脂质乳液，可获得逐渐提高的气体浓度，进一步通过离心还可实现更高的浓度富集。

方案

1. 系统设置

该系统由一个配备单级搅拌器的储存浓缩罐（HCT）、一个在线高剪切均质机、一个在HCT与均质机之间输送液体的滚筒泵以及一个换热器组成（图1）。

1. 将一个已灭菌、带广口的 4 L 玻璃收集容器（配备 2 个底端接口和 3 个侧端接口）放置于单级搅拌器下方。将搅拌头降至容器口部，并使用橡胶密封圈或胶带确保气密性连接（以防止环境空气污染顶空）。
2. 将 HCT 的一个底端接口 (图 1，接口 #1) 连接一段无菌的 3/8”（内径）透明软管，长度约 10”，末端安装三通旋塞，用于收集浓缩乳液。
3. 将第二个底端接口 (图 1，接口 #2) 连接一段无菌的 3/8”（内径）软管，长度约 36”。将此软管穿过滚轴泵。将高剪切均质机的入口端连接一个带有两个接口的 T 型接头，并按如下方式连接：将来自接口 #2 的软管经滚轴泵后连接至 T 型接头的侧端口；将另一端口通过低流量氧气流量计连接至氧气钢瓶。
4. 将高剪切均质机的出口端连接至维持在 4 °C 的管式换热器的入口端。将换热器的出口端连接至 HCT 的回流接口 (图 1，接口 #3)，形成一个闭合循环系统。
5. 通过流量计将氧气钢瓶连接至 HCT (图 1，接口 #4)。将一个与大气相通的气体成分监测仪连接至 HCT 的顶部接口 (图 1，接口 #5)。
6. 若需保持无菌，每次使用前应通过高压灭菌法对玻璃和金属部件进行灭菌，通过环氧乙烷对软管组件和塑料连接件进行灭菌。若产品需进行 体内 测试，此步骤尤为重要。

2. LOM 制造

1. 将 20 g GMP 级 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）和 10 g 胆固醇加入 HCT 底部。向 HCT 中加入 1 L Plasma-Lyte A 溶液，手动搅拌 1 分钟，尽可能将脂质充分分散至水相中。
2. 将单级搅拌器浸入水相中，确保整个搅拌头完全被水相覆盖。确认 HCT 顶部密封严密（参见上述步骤 1.1），且无开放的侧向接口。打开连接至接口 #4 的气体源，待 HCT 顶空氧气浓度达到 >95% 后停止。在 10 L/min (LPM) 流速下，此过程约需 10 分钟。
3. 使用单级搅拌器以 5,000 rpm 转速混合前体乳液 5 分钟。所得混合物应呈乳白色，无可见脂质团块。混合完成后，未使用的脂质-水混合物可在 4 ºC 下储存，最多可保存 30 天，限单次使用。
4. 开启滚筒泵（1.3 LPM），用前体乳液对整个封闭循环系统进行预灌注。系统预灌注完成后，保持泵以 1.3 LPM 持续运行。
5. 开始制造 LOMs 时，将管路内高剪切均质机开启至 7,500 rpm。随即以 0.5 LPM 流速向均质机入口段通入氧气。保持 HCT 内单级搅拌器以 3,500 rpm 运行。LOMs 在管路内均质机的转子叶片与乳化筛网界面处形成 (图 2)。数 分钟内，液体应明显变得更粘稠。更严谨的方法是测定粘度随时间的变化，可在制备过程中从接口 1 取样，并使用粘度计进行分析。
   注意：若从搅拌器出口管路中观察到明显气泡，则表明通入管路内均质机的氧气流量过高。应逐步降低气体流速，直至液体呈不透明状且无可见气泡。
6. 系统运行 15 分钟后，关闭高剪切均质机及其氧气进气。继续运行 HCT 中的单级搅拌器，直至乳液被完全移除；此举可防止相分离，并保持 HCT 内产物的均匀性。
   注意：在连续浓缩阶段，充气乳液的体积应增至初始体积的约 2–3 倍 。若未观察到该现象，请检查氧气是否正常流入高剪切均质机，并确认前体乳液中脂质浓度是否正确。生产效率随脂质浓度降低而下降。

3. LOM 的收集、浓缩、评估与保存

1. 将一个无菌的改良140 ml鲁尔锁紧注射器连接到收集容器底部端口#1的旋塞上。抽取100 ml液体。将注射器盖紧后重复操作，直至所有液体被完全移除。
   1. 通过将100 ml空气吸入注射器，然后用锯子切除140 ml刻度以上多余的活塞和注射器材料来改装注射器。使用带齿镊子拉动活塞，以填充和排空注射器。此改装有助于更方便地进行离心。
2. 将注射器放入冷冻（4 ºC）吊桶式离心机中，针帽端朝下，以225 × g离心10分钟。
3. 离心后会出现三层物质。排出并弃去底部多余的浑浊水相。第二层呈亮白色，含有浓缩的LOM。使用三通旋塞将浓缩泡沫转移至气体不渗透的注射器中，以防止环境气体污染。弃去最上层，该层含有因LOM破裂而释放的游离氧气。
4. 可通过检测浓缩泡沫中气体含量是否达到或超过90%来评估泡沫质量。气体浓度按以下公式计算：
   气体体积百分比 = [(泡沫重量 / 泡沫体积) - 1] × 100
   1. 作为第二项质量控制，可通过光遮蔽法测定微泡粒径，以确认其是否处于预期范围内。需注意，均质化时间或配方的改变可能会影响气泡大小。
5. 用鲁尔锁紧接头将玻璃注射器紧密封盖。浓缩LOM可在使用时用Plasma-Lyte A稀释。注射器可储存于22、4或-20 ºC；较低温度可能提供更长的储存稳定性⁷。

结果

高剪切均质化能够实现高效的（即 一个下午内即可制备出满足动物实验所需的足量LOMs，且无需专业技术。熟练后，可在90分钟内制备多达2 L的浓缩LOMs。

微泡的大小和形态通过光学显微镜和光阻法进行评估。当 10 μl 观察到LOMs样本，可见球形LOMs，且脂质碎片相对较少 （图3A）。当使用GMP产品时，这一点尤为明显。当采用光遮蔽法对同一批LOMs样品进行评估时，平均粒径为2.624±0.332 μm （SD）。超过90%的LOMs <10 μm 直径不一，且群体呈多分散性 （图3B）.

乳液黏度高度依赖于气体分数（因此也依赖于微泡浓度）。采用40 mm平行板几何结构，通过稳态流动扫描对不同气体浓度的2 ml LOM等分试样进行研究，施加的应力范围为0.1至 10,000 μN·m。所有含气量的LOM气体分数均表现出剪切稀化行为，且在较高气体分数下该现象更为显著。含有60%体积气体的LOM表现出与血液相似的流变特性 ...

讨论

制备高浓度、高氧合度液态氧载体（LOM）最关键的步骤包括：1）确保HCT内的顶空始终保持充分氧合；2）确保脂质辅料的纯度达到最佳（包括储存条件和使用符合GMP标准的产品）；3）在启动系统前，确保脂质粉末与水相充分混合均匀；4）密切注意HCT内气体体积分数的增加，确保气体体积分数不超过70%。

我们在此描述的方法利用高剪切均质化技术制备中空微泡。两亲性脂质与水相混合形成悬浮液，并以此将脂质导入在线均质器中。采用符合药品生产质量管理规范（GMP）级别的脂质 体内 研究中通常优先选用，因为它们所含的脂质聚集体和杂质较少。脂质还容易发生脂质氧化（尤其是在含氧液体中储存时）以及细菌污染。当疏水性尾部在在线均质器内围绕形成的小型氧气微泡排列时，便会生成脂质氧微粒（LOMs）。 （图2） 以7,500 rpm均质化LOM时，微泡在转子叶片尖端与定子内壁之间被研磨，承受额外的机械应力。同时，当LOM以高速被迫通过超细网孔乳化筛时，还会经历液压剪切，进一步减小颗粒尺寸。剪切力会在在线均质器及单级混合器局部产生热量，因此在返回HCT前需使用在线热交换...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DSPC）	Avanti Polar Lipids	770365	替代产品：NOF America（Coatsome MC-8080）生产的非GMP级产品
胆固醇	Sigma Aldrich	C75209
Plasma-Lyte A	VWR	80089-818	也可使用氯化钠（NaCl）
玻璃收集容器	Specialty Glass, Inc.	定制	联系人：Pam Zurbrick - 281-595-2210
气体成分（氧气）监测仪	Precision Medical	PM5900L
Sarns 8000 滚压泵	Calicut Medical	16407	模块化灌注系统的一部分
BIOtherm 热交换器	Medtronic	ECMOtherm-II
Verso 实验室在线混合器	Silverson Machines, Inc	TH-IL-102-VERSO	使用多级工作头及带T型接头的前端延长装置
Silverson Verso 进口端T型接头	Process Innovations	定制	联系人：Brian Leavitt - 508-423-2266
L5M-A 实验室混合器	Silverson Machines, Inc	NC0136483	使用网状乳化筛（细）
Rochester-Ochsner 齿状镊	Fisher Scientific	13-812-18
140 ml 注射器	Kendall Healthcare Monoject	8881114030	确保为鲁尔锁扣式。
IX71 倒置光学显微镜	Olympus	IX71
Retiga-2000R 显微镜相机	QImaging	RET-2000R-F-M-12
Accusizer 780A 自动稀释粒径分析仪	PSS-NICOMP Particle Sizing Systems	已停产