活体神经末梢中内体动态的四维荧光成像可视化

摘要

四维（4D）成像技术被用于研究活体脊椎动物神经末梢中两种内体之间的行为及其相互作用。这些微小结构的运动在三维空间中得以表征，从而能够确认内体融合和胞吐等事件的发生。

摘要

四维（4D）光成像技术已被用于研究游蛇腹横肌运动神经末梢内微小结构的行为。原始数据由3D z轴序列的时间推移图像组成。每个z轴序列包含4至20幅图像，使用落射荧光光学系统在焦平面间距为400至1,500 nm的条件下采集。图像堆栈的采集步骤（如焦距调节、激发波长切换和数码相机操作）尽可能实现自动化，以最大化成像速率并减少光照对组织的损伤。采集完成后，图像堆栈集合经过反卷积处理以提高空间分辨率，随后转换为所需的3D格式，并用于生成适合多种基于计算机分析的4D“动态图像”，具体分析方式取决于实验所需的数据。其中一项应用是研究神经末梢中两类内体的动态行为——大内体（MEs）和酸性内体（AEs），这两类内体的尺寸（两种类型均为200–800 nm）处于或接近衍射极限。在每个时间点获取3D信息相较于传统时间推移成像具有多项优势。特别是，结构的尺寸和运动速度可随时间被定量分析，而无需失去清晰的焦点。4D成像数据示例显示，MEs会靠近质膜并消失，提示其可能通过胞吐作用释放，而非仅仅垂直移出单一焦平面。此外，通过在三个正交投影中观察到两种含染料结构之间的重叠，可推断MEs与AEs之间存在潜在的融合现象。

引言

活体组织的延时成像可直观呈现动态的结构-功能关系，而这种关系在单时间点成像的固定样本或活体样本中无法观察到。然而，获取时间信息通常需要以降低光学分辨率作为代价。高数值孔径的油浸物镜由于焦深范围狭窄，在活体组织成像中并不实用，因此只能选择水浸物镜或干镜作为替代方案。此外，共聚焦光学系统虽然能提供更高的分辨率，但由于其所需的光照强度相对较高，可能引发光毒性，因此在某些活体样本中无法使用^1,2。最后，尽管目前已有一些可提供更高分辨率的实时或延时光学技术，但其应用范围仅限于目标结构可被置于物镜数百纳米范围内的样本¹。本文所述方法利用相对低成本的设备，具有良好的通用性，且相较于常用的延时成像技术可提供更优的分辨率，适用于独立实验室以及成像平台。

该方法利用传统的落射荧光显微镜，结合高灵敏度的数码相机以及专门设计用于快速获取不同焦平面（z轴堆栈）图像序列的硬件装置。每个z轴堆栈均经过数字去卷积处理以提高分辨率。三维时间序列（四维）成像的一个特点是能够精确追踪运动中的细胞器或其他结构。在正确设置的情况下，所成像的结构不会失焦，且可在三个方向上观察并量化其运动。因此，被标记的结构不会仅仅因为漂移出狭窄的焦平面而在一个或多个时间序列图像中消失。该方法还可作为评估微小结构之间相互作用及可能融合的灵敏工具。对于接近衍射极限（数百纳米）的结构，即使合并图像显示其各自标记存在重叠，传统的落射荧光或共聚焦图像也无法确证融合的发生³。虽然图像重叠提示可能发生融合，但仍有可能是两个物体在水平或垂直方向上相隔一段小于衍射极限的距离。相比之下，三维或四维成像允许从三个正交方向分别观察物体。若在所有三个视角下均呈现融合形态，则可显著提高判断的可信度。此外，在某些活体样本中，若假定已融合的物体表现出方向性运动或布朗运动，并且两种标记在时间进程中同步移动，则可进一步提供融合的证据。当然，当结构接近衍射极限时，从背景中分辨结构本身或将结构确认为包含两种染料（即融合）的可信度并非绝对。若条件允许，采用荧光共振能量转移（FRET）⁴等专门技术更为合适。

方案

1. 使用活体染料对制备样本进行染色

1. 关于束带蛇的解剖方案，请参见 Stewart et al.⁵ 和 Teng et al.⁶。爬行动物组织在低温条件下保存时，其生理活性维持时间更长，且细菌污染较少（见下文）。哺乳动物组织通常在室温或更高温度下维持。
2. 进行溶酶体活体染料染色时，将染料以1:5,000比例（0.2 μM）溶解于冷的爬行动物林格液中。在4 °C下孵育15分钟。用冷林格液多次洗涤。应尽快成像。
3. 使用KCl刺激进行FM1-43染色时，将染料以1:500比例（7 μM）稀释于高KCl林格液中。在4 °C下孵育最多30-60秒。用冷林格液快速洗涤三次，每次约1分钟。应尽快成像。
4. 使用高渗（蔗糖）刺激进行FM1-43染色时，将染料按上述方法稀释于0.5 M蔗糖林格液中。在4 °C下孵育2-5分钟。参照上述步骤1.3，用冷林格液洗涤。应尽快成像。
5. 通过电刺激进行FM1-43染色时，请参见 Teng et al.⁶。简言之，将标本置于含有生理盐水溶液和染料的培养皿中。使用预编程的200 μsec矩形脉冲串刺激神经（~7 V，30 Hz，18 μsec）。参照上述步骤1.3，用冷林格液洗涤。应尽快成像。

2. 设置成像前的准备工作

1. 将样本放置为使目标结构尽可能靠近显微镜物镜。
2. 如果使用倒置显微镜，应采用底部带有圆形薄盖玻片的成像腔室。通常，成像腔室应具有薄的不锈钢底面，并在中央固定一片直径为25 mm、厚度为#1的玻璃盖玻片。如果使用正置显微镜，则不需要底部盖玻片，但配备盖玻片有助于透射光成像例如 微分干涉差（DIC）以定位样本并找到感兴趣的物体。
3. 选择合适的物镜以获得尽可能高的三维分辨率。数值孔径（n.a.）、工作距离、放大倍数以及物镜类型（干镜、水浸镜和油浸镜）之间存在权衡。对于组织培养等较薄的样品，最佳选择是油浸物镜。使用正置显微镜时，将盖玻片漂浮在水性浴液上，并在盖玻片顶部与物镜之间使用浸油。
4. 如果使用去卷积软件，供应商可能会为特定物镜提供预设的点扩散函数（PSFs）。若未提供此类信息，或选用的物镜不在支持列表中，则应通过成像荧光微点或类似的衍射极限物体来确定点扩散函数。^7,8.

3. 设定所需的景深及每个延时成像帧所需的图像数量

1. 选择合适的总景深，以确保在 z 方向上移动或相互作用的感兴趣结构在移动过程中不会消失或失焦。z 轴方向的成像范围应略大于待成像细胞或细胞突起的垂直尺寸。对于脊椎动物的运动神经末梢，通常为 15–20 µm。
2. 计算每次焦距变化所需的 z 轴步进距离。z 轴方向的分辨率取决于物镜的特性，通常约为 x-y 平面分辨率的四分之一。若使用共聚焦成像或去卷积软件，z 轴分辨率会有所提高。可通过在 z 方向上有意识地过采样来提升最终分辨率⁵，但亦请参见下文步骤 3.3。对于 40–100X 物镜，典型的步进间隔范围为 400–1,500 nm。每次 z 轴步进成像之间应关闭照明光源。
3. 确定每个 z 层叠图像中的图像数量，即所需景深除以步进间隔。完成一个典型 z 层叠图像所需时间为 1–10 秒。快速移动的物体（100 nm/秒）在三维图像堆栈中可能出现模糊，因为每个图像平面对应略微不同的时间点。此外，每增加一幅图像都会加剧光漂白和潜在的光毒性（见讨论部分）。若存在上述任一情况，应选择更大的 z 步进距离以减少每层叠中的图像数量。后续可通过图像插值软件进行补偿（见下文步骤 6.3）。

4. 选择延时成像的帧率

通过实验选择一个刚好足以平滑解析随时间变化（如运动、相互作用或融合事件）的速率⁹采样不足可能导致运动伪影（采样误差），而过度采样则会不必要地增加光照暴露。应从同一标本采集单个较长序列或多个重复序列，每个序列的总时间间隔相对较小。例如 10 个时间点 × 30 秒间隔 = 5 分钟。如果可能，使用连续的落射荧光照明观察样本，以粗略估算运动速度，包括整个样本是否存在漂移。

5. 完成特定样本的所有活体成像

爬行动物标本通常可保持稳定约1-2小时，若置于低温环境则时间更长。

6. 根据预期用途分析数据

1. 保留所有原始数据文件。尽管数字存储通常不是问题，但即使使用快速的个人计算机或工作站，处理时间仍然显著。因此，将图像裁剪为感兴趣区域 [ROI]。确保在整个时间过程中，整个感兴趣区域始终位于裁剪窗口内。
2. 使用适当的软件和正确的点扩散函数对图像堆栈进行去卷积。确认分辨率得到提高，并且去卷积算法未产生任何伪影。图3展示了示例图像。
3. 使用插值算法扩展 z 轴表观分辨率。建议将实际 1.5 μm 的图像平面间距通过 6 倍扩展为表观 0.25 μm 的间距。或者，结合使用过采样（步骤 3.2）和插值方法。
4. 根据需要进行对比度、亮度、噪声滤波、光漂白及其他典型图像处理调整。图像处理标准规定，对于大多数科研工作，应对所有图像（包括同一堆栈内及不同时间点的图像）应用相同的校正。应评估特定调整在所有图像中的影响⁹。
5. 选择特定的显示模式以导出数据。最直接的显示方式是使用红-绿或红-蓝立体图像（图3中的示例）、立体图像对，或配合快门眼镜交替显示左/右眼帧。立体图像仅限单色显示。如有需要，可增强图像的表观深度以改善 z 轴视觉分辨率。
6. 尝试各种滤波和图像增强技术。例如，拉普拉斯滤波有助于提高微小结构相对于背景的对比度。该方法增强运行窗口中心像素的亮度，同时降低周围区域的亮度。注意某些滤波方法组合使用时效果不佳。
7. 如果样品随时间发生显著漂移，应进行漂移校正。即使添加药物以抑制动作电位和突触电位，活体肌肉中仍常出现此类移动。使用像素配准算法（例如 IMARIS、Adobe AfterEffects、ImageJ 的 TurboReg 插件）可对延时图像进行对齐，从而减少但通常无法完全消除此类运动。

结果

所示数据来自蛇类神经肌肉接头（见低倍和高倍放大图像） 图3；内吞染料（FM1-43）摄取产生弥散状荧光，充满每个突触小结，尤其是这些终末内的大内吞体（MEs）和酸性内吞体（AEs）⁵神经活动期间，通过大规模内吞作用形成内吞小泡（MEs）¹⁰ 且其数量在活动停止后随时间呈指数级下降⁶使用4D活体成像技术旨在确定MEs是否向质膜移动并迅速消失，提示其数量减少可能是由于部分MEs发生了胞吐作用。所有此类MEs在一个时间点存在（以及此前的时间点），而在下一个时间点（及之后）则完全消失。因此，其消失所需时间短于我们的时间帧间隔（最短为30秒），这与胞吐作用的特征一致。另一种未被4D成像数据支持的假说是，MEs通过囊泡出芽的方式缓慢解体直至消失。囊泡出芽确实会发生⁶但至少部分ME在出芽期间或出芽后通过胞吐作用释放⁵. 图1 和 视频 S1 说明在两个延时成像帧之间一个ME的消失过程。那些注定消失的ME在两帧或更多帧中未表现出形状或亮度的变化...

讨论

4D成像最关键的方面是控制光照的持续时间和强度。光漂白会降低图像的信噪比，其影响可能严重也可能不严重，具体取决于多种因素，包括荧光染料的选择。对活体组织的非特异性损伤（光毒性）与光漂白相关，有时可通过专为此目的设计的荧光探针^2,12，或通过合适的明场光学手段（如微分干涉差成像，DIC）观察形态学变化来识别。

然而，可以诱导产生一种生理效应，该效应发生在远低于与光漂白和光毒性相关光照强度的水平下。例如，在早期实验中，使用多个在刺激后不同时间点固定的样品，测量了短暂刺激后随时间推移膜内陷结构（MEs）消失的速率⁶。按照最小化荧光衰减的标准操作，样品在观察前始终保持避光。当采用4D活体成像进行类似实验时，在整个实验过程（约20–60分钟）中保留了更多的膜内陷结构，且未发生消失现象。若使用相同的活体成像方案，但不实际进行图像采集，仅在实验开始和结束时各获取一次3D图像以限制光照暴露，即可使内体消失的整体速率恢复至与固定样品相当的预期水平。

进一步的故障排查表明，信号消失的速率在一定程度上与实...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>仪器设备
SGC5	Biotium，加利福尼亚州海沃德	70057	终浓度：10 mM
FM1-43FX	Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德	F35335	终浓度：7 mM
LysoTracker Red	Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德	L7528	终浓度：0.2 mM
pH 7.2 的爬行动物林格液
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO₄4			1.8 mM
KH2PO4 （二碱基）			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
高钾氯化钾爬行动物林格液，pH 7.2
NaCl			86 mM
KCl			60 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO₄4			1.8 mM
KH2PO4 （二碱基）			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
高蔗糖林格液 pH 7.2
NaCl			145 mM
KCl			2.5 mM
CaCl2			3.6 mM
MgSO₄4			1.8 mM
KH2PO4 （二碱基）			1.0 mM
HEPES			5.0 mM
蔗糖			0.5 M（17.1 g/50 ml）
Axioplan 200 倒置显微镜	卡尔·蔡司，美国纽约州桑伍德		www.zeiss.com
N-Achroplan 63倍水镜；数值孔径=0.9；工作距离=2.4 mm	卡尔·蔡司，美国纽约州桑伍德		www.zeiss.com
DG4组合光源/激发滤光轮切换器	Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州	175W 氙弧灯	www.sutter.com
Lambda 10-2  发射滤光轮切换器	Sutter Instruments，诺瓦托，加利福尼亚州		www.sutter.com
Sensicam CCD 相机	库克仪器公司，纽约州托纳万达		www.cookecorp.com
Cascade 512 CCD相机	Photometrics，图森，亚利桑那州		www.photometrics.com
成像培养皿——自制——直径11厘米；内置直径25毫米、1号盖玻片；带磁性针脚
<强>软件
Slidebook 5.0	Intelligent Imaging Innovations，丹佛，科罗拉多州	去卷积；漂移校正；三维与四维数据呈现	www.intelligent-imaging.com
IMARIS 7.5.2	Bitplane，南温莎，康涅狄格州	漂移校正；三维与四维数据展示	www.bitplane.com
AfterEffects CS6	Adobe，美国加利福尼亚州圣何塞	漂移校正	www.adobe.com
ImageJ 1.46	美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州	多种插件可用；立体对构建	http://rsbweb.nih.gov/ij
Zeiss LSM	卡尔·蔡司，纽约州桑伍德	立体图像对构建	www.zeiss.com