幼年斑马鱼脊髓横断术

摘要

脊髓横断后，成年斑马鱼在损伤后六周内可实现功能恢复。为了利用幼鱼的透明特性以及更快的恢复速度，我们介绍了一种横断斑马鱼幼体脊髓的方法。横断后，我们观察到感觉功能在损伤后2 天开始恢复，损伤后3天出现C形弯曲运动。

摘要

哺乳动物在脊髓损伤后难以实现感觉和运动功能的恢复，原因在于损伤平面以下轴突无法再生，以及脊髓神经发生难以重新启动。然而，一些无羊膜动物（包括斑马鱼） Danio rerio 即使在脊髓完全横断后，仍表现出感觉和功能的恢复。成年斑马鱼是研究脊髓损伤后再生的成熟模式生物，其感觉和运动功能在6周内恢复 损伤后数周。为了利用 体内 利用透明斑马鱼幼鱼中可观察的再生过程以及成体中无法获得的遗传工具，我们采用斑马鱼幼鱼研究脊髓横断后的再生。本文展示了一种可重复且可验证地横断斑马鱼幼鱼脊髓的方法。横断后，我们的数据显示感觉功能恢复始于2 损伤后数天（dpi），在3 dpi时可观察到C形弯曲运动，5 dpi时恢复自由游泳。因此，我们建议将幼年斑马鱼作为成年斑马鱼的补充工具，用于研究脊髓损伤后的恢复过程。

引言

人类脊髓遭受重大创伤后，通常会导致损伤平面以下永久性瘫痪和感觉丧失，这是由于轴突无法再生或神经发生无法重新启动所致^1,2。然而，与哺乳动物不同的是， 无羊膜动物（包括蝾螈和斑马鱼（Danio rerio））即使在脊髓完全横断后仍能实现有效恢复^3,4。

成年斑马鱼是研究脊髓损伤后恢复过程的成熟模型^5-7在成年斑马鱼中，完全脊髓横断后，感觉和运动功能的重建在6周内可见 损伤后数周⁸为了研究再生过程 体内，我们转向了透明的斑马鱼幼体⁹.

本文介绍一种使用斜面显微注射针作为手术刀，对受精后5天（dpf）的斑马鱼幼鱼进行脊髓横断的方法，该方法改良自Bhatt等人的研究。 等¹⁰ 该方法具有高通量、低死亡率和可重复性的优势。经过练习，每小时可截断300条幼虫，且截断后存活率超过6 数月的横断实验涉及超过3,600只动物，其中98.75% ± 0.72%存活至损伤后7天（dpi）。我们的数据显示感觉和运动功能也迅速恢复：在损伤后1天（dpi），受伤鱼的所有运动仅由胸鳍驱动；然而，到损伤后2天（dpi），幼鱼开始对横断部位尾侧的钨针触碰产生反应，到3 dpi时恢复C型弯身运动，并在5 dpi时表现出捕食性游泳行为¹¹通过乙酰化微管蛋白抗体染色，我们证实了在损伤后1天时损伤部位无轴突存在，但在损伤后5天时轴突已跨越损伤部位。我们认为该方案将为研究脊髓损伤后轴突再生和神经发生提供一种有价值的技术。

方案

斑马鱼的饲养和繁殖均按照标准程序进行；实验已获得犹他大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 手术板的制备

1. 根据制造商说明，使用60 mm培养皿和Sylgard 184硅胶弹性体试剂盒制备手术板。培养皿填充不得超过一半，静置使其聚合。盖好后于室温保存。

2. 玻璃微电极的制备

1. 使用显微拉针仪加热并牵拉薄壁硼硅酸盐毛细管，采用与制备显微注射针头相同的参数来制备微移液管。
2. 在解剖显微镜下，用镊子将微移液管尖端折断至直径约为 200 µm。
3. 先用微型研磨仪将断裂边缘修整成 35° 斜面，再进行第二次 25° 斜面修整。确保尖端锋利且光滑。将修整完成的微移液管存放于培养皿中的少量黏土上。

3. 斑马鱼幼体的制备

1. 手术前7天，设置雄性和雌性斑马鱼的交配缸。
2. 次日早晨在开灯后3 hr 收集胚胎，以确保获得最大产量。若使用如 Tg(elevl3:eGFP)^knu3 的转基因报告品系，则将受精胚胎分选至含25 ml E3培养基的100/100 mm培养皿中，于28.5 °C培养。若使用野生型，则将受精胚胎分选至含25 ml E3培养基的25/100 mm培养皿中，于28.5 °C培养。
3. 若使用报告品系，在48 hpf时筛选具有荧光表达的胚胎。将确认的胚胎以25/100 mm培养皿、25 ml E3培养基的密度，在28.5 °C条件下继续培养至成熟。
4. 当幼鱼达到5 dpf时，通过在Sylgard上覆盖E2 + 10 mg/L硫酸庆大霉素（GS）+ Tricaine制备手术用培养皿。
   1. 在100 mm培养皿中加入25 ml E2 + GS，制备恢复培养皿。
   2. 将三根棉签捆扎在一起，制备手术刀具，形成具有三个凹槽的三角形工具。
   3. 将已制备的微量移液管用胶带固定于其中一个凹槽内，安装到棉签工具上。
5. 若重复使用微量移液管，应在安装至棉签前，使用1 ml注射器和27 G 针头以E2 + GS冲洗至通畅。

4. 手术

1. 每次对一板幼鱼（25条）使用三卡因（Tricaine）进行麻醉。当鱼不再对触碰产生反应时，表明麻醉充分。手术前必须确保鱼完全麻醉，否则在手术刀接触时会发生抽搐。手术在解剖显微镜下进行。
2. 将幼鱼转移至手术板。
   1. 在最大放大倍数下，逐个旋转幼鱼，使其侧卧，背部朝向持手术刀的手。
   2. 将镊子放置在Sylgard表面，倾斜跨过幼鱼的宽度。
   3. 将玻璃手术刀抵住镊子的一臂，于肛孔水平在幼鱼的背外侧切入，注意不要切过脊索的腹侧边缘。扭转手术刀以切断脊髓。
   4. 对剩余幼鱼重复上述操作。
      注意：若幼鱼出现出血，则无法从手术中恢复。应立即将其从手术板移除，并通过过量三卡因实施安乐死。
3. 完成一批幼鱼的手术后，将受伤个体转移至恢复板，以促进麻醉剂的清除。
   1. 注意：在收集受伤幼鱼进行转移时，应从头部或尾部开始拾取，避免弯曲幼鱼而对其损伤部位造成应力。
      注意：所有用于手术的器械均可重复使用，包括微量移液器。

5. 恢复

1. 将受伤的幼鱼从恢复板转移至含有25 ml E2 + GS的100 mm培养皿中，每皿放25尾。置于28.5 °C培养箱中使其恢复。
2. 每天检查培养皿，移除病弱和死亡个体。在培养基中出现Coleps（淡水原生动物）之前不要更换培养基。更换培养基时，不要将鱼转移到新的培养皿，而是尽可能吸除原有培养基，并在同一培养皿中加入新鲜培养基。根据需要重复此操作以减少Coleps的数量。
3. 每天投喂少量粉末状幼鱼饲料。
   注意：在受伤幼鱼恢复运动能力之前，不得投喂活体饵料（例如，草履虫或轮虫），否则活体饵料会定植于伤口部位并导致幼鱼死亡。

结果

为了减轻损伤部位周围组织的损伤程度，微移液管尖端的适当斜面处理至关重要。图1A展示了一个正确磨制的尖端。使用过宽的尖端（图1B）容易导致更高的死亡率，因为更可能划伤背主动脉；而使用过窄的尖端（图1C）则容易从皮肤表面滑脱，无法有效切割组织。

为了练习该技术，建议使用报告基因品系（如 Tg(elevl3:eGFP)^knu3）来可视化脊髓。 图2A 显示了在损伤后1天（1 dpi）活体 Tg(elevl3:eGFP) 斑马鱼完全横断的脊髓，而 图2B 显示了同一条活鱼在3 dpi时的情况。图2C 和 图2D 展示了在固定处理后的 Tg(dbx1a:eGFP) 斑马鱼中，于3 dpi时损伤部位的高倍放大图像，分别对应完全性（图2C）和不完全性（<...

讨论

初次学习该技术时，我们建议单次操作不超过50-100次横切。掌握该技术后，我们能够以每 小时最多处理300个胚胎的速度进行操作；然而，达到这一通量水平需要每周持续练习数月。我们还建议使用报告基因品系进行练习，并通过验证确保横切完全，直至脊髓横切不完全的发生率降至1%以下。

成年斑马鱼脊髓横断是一种研究损伤后轴突再生和神经发生作用的成熟且可靠的技术。将该分析应用于幼体生物，可使我们能够观察恢复过程 体内此外，我们还能利用成年斑马鱼中所不具备的遗传学工具，来研究各种基因在再生过程中的作用， 例如, Tcf7l1a¹².

最初为研究脊髓横断后神经发生而开发的该技术，也可用于检测感觉功能的恢复：受伤动物在损伤后2天（dpi）即对损伤部位尾端的触觉刺激产生反应，且轴突在损伤后5天（dpi）已跨越损伤部位。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
60 毫米培养皿	VWR	82050-544
100 毫米培养皿	VWR	89038-968
PDMS，Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒	Fisher Scientific	NC9644388
硼硅酸盐毛细管：外径 1.00 毫米，内径 0.78 毫米	Warner Instruments Inc.	64-0778
镊子	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
解剖显微镜	Nikon	SMZ6454
微电极研磨仪	Narishige	EG-44
硫酸庆大霉素	Amresco Inc.	0304-5G	溶于水配制成 10 mg/ml 溶液，-20 °C 保存
三卡因（Tricaine）	Acros Organics	118000100
棉签，木柄，6 英寸	Fisher Scientific	23-400-101
1 毫升注射器	BD	309625
27 G 针头	BD	305109
幼鱼饲料	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	-20 °C 保存
微电极拉制仪	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 溶液（1 升）； 室温保存
17.5 克 NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75 克 KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90 克 CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90 克 MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41 克 KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12 克 Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 溶液（10 毫升）； 现配现用，多余部分弃去
0.35 克 NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 溶液（1 升）； 室温保存
50 毫升 20x E2 溶液
2 毫升现配的 500x NaCO3 溶液