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方法文章

通过水动力基因递送在小鼠中瞬时表达蛋白质

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DOI：

10.3791/51481

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2014年5月5日

 , 
1Department of Biological Sciences, Hunter College, CUNY

通讯作者： Jayne Raper <raper@genectr.hunter.cuny.edu>

本文内容

摘要

通过水动力基因递送法对裸DNA进行体内转染，可将基因导入动物组织，且引发的炎症反应极小。该方法能够产生足量的基因产物，从而可用于分析基因功能与调控机制，以及蛋白质结构与功能。

摘要

高效表达外源基因 体内 在研究基因功能和开发疾病治疗方法方面具有至关重要的意义。近年来，水动力基因递送（HGD）已成为一种简单、快速、安全且有效的将外源基因导入啮齿类动物的方法。该技术依赖于快速注射大量生理溶液所产生的流体动力，以增加灌注器官细胞膜的通透性，从而将DNA导入细胞。HGD的主要优势之一是能够使用裸质粒DNA（pDNA）将外源基因导入哺乳动物细胞。利用质粒导入外源基因操作简便、效率高，且与病毒载体相比具有显著的安全性。HGD最初用于小鼠的基因递送，目前已广泛用于向小鼠、大鼠以及有限程度上的其他动物递送多种物质，包括寡核苷酸、人工染色体、RNA、蛋白质和小分子。本实验方案描述了小鼠中的HGD操作，并重点阐述该方法中对成功实施该技术至关重要的三个关键环节：针头正确插入静脉、注射体积以及递送速度。文中举例说明了该方法在两种编码分泌型灵长类特异性蛋白——载脂蛋白L-I（APOL-I）和结合珠蛋白相关蛋白（HPR）——的基因瞬时表达中的应用。

引言

自从Liu et al. 和 Zhang et al. 首次描述以来，水动力基因递送（HGD）已成为在啮齿类动物模型系统中研究基因功能不可或缺的工具1,2。该技术通过在短时间内（5-7秒）将大量液体（8-12%体重）快速注入小鼠尾静脉，以促进靶器官细胞对质粒DNA的摄取1,2。这些条件可在肝脏中实现高效的基因表达，而在肾脏、脾脏、肺和心脏中的基因表达水平较低。

注射10 μg pCMV-LacZ质粒可转染多达40%的肝细胞，使水动力基因递送（HGD）成为最高效的非病毒性 体内 迄今为止的基因递送方法1与病毒载体不同，质粒DNA易于制备，且不会在啮齿类宿主中引发免疫反应3 且不会与内源性病毒发生重组而带来健康风险。此外，由于HGD递送的DNA分子无需包装，该方法适用于递送长达150 kb的细菌人工染色体（BAC）4. 通过水动力方法递送的其他类型分子还包括RNA5-10，吗啉寡聚核苷酸11蛋白质12,13 以及其他小分子12,14. 文献中的优秀综述已讨论了HGD相较于其他递送方法的优缺点15-20 多位作者已对该操作步骤提供了详细描述21-23.

通过水动力基因递送法（HGD）将外源基因导入小鼠体内是安全且有效的1-3,24，该方法在大鼠中也取得了类似的成功25。经过某些改进后，已在鸡26、兔27和猪28中开展了概念验证实验，然而，该技术在较大型动物中的体内应用仍面临挑战。使用该方法时，另一个常见的局限性在于，目前许多可用的哺乳动物表达载体缺乏实现持久、高水平基因表达所需的元件。使用pCMV-Luc质粒时，靶器官中的基因表达在HGD后十分钟内即可检测到，但初始的高水平表达在注射后第一周内迅速下降1。长期的外源基因表达是否可行，取决于质粒设计中所使用的启动子和内含子3,24，然而，维持高水平的基因表达通常需要重复注射。因此，HGD可能不太适用于研究由长期暴露于有害蛋白或其产物所导致的慢性疾病。尽管存在这些局限性，HGD仍是一种极为强大的工具，可用于研究某个基因及其突变体在体内的潜在作用、蛋白质的治疗效果与调控机制，以及建立疾病动物模型（综述见15）。例如，可通过将不同的基因构建体分别导入相应基因敲除的小鼠体内，从而确定蛋白质特定结构域或氨基酸的功能。此外，该技术可用于任何品系的小鼠。

本方案描述了小鼠的HGD技术，重点介绍实现成功转染所需的关键技术要点：静脉内针头插入的正确操作、注射体积及给药速度。该方法的应用在非洲锥虫病的小鼠模型中得到演示，非洲锥虫病是一种对人类和家畜具有致死性的疾病29,30尽管多种锥虫可引起家畜疾病，但由于人类血液中存在称为锥虫溶解因子（trypanosome lytic factors, TLFs）的先天免疫复合物，大多数锥虫无法在人体内致病。29,31,32这些成孔型高密度脂蛋白（HDL）含有两种独特的灵长类特异性蛋白质：HPR（配体），可促进TLFs进入锥虫；以及APOL-I（裂解组分）。31,33-38. 布氏罗得西亚锥虫 能够感染人类，原因是表达了一种血清抗性相关蛋白（SRA），该蛋白可结合并中和人类APOL-I34,39. 由于狒狒TLF具有不同的APOL-I蛋白，因此不会被SRA中和40如先前报道，使用哺乳动物表达载体（pRG977）在小鼠中转基因表达狒狒TLF组分可提供对感染人类的锥虫的保护作用40此处展示的代表性数据说明了如何应用水动力基因递送技术来研究蛋白质的治疗效果。

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方案

本研究所述所有实验均经纽约市立大学亨特学院机构动物照护与使用委员会批准。

1. 无内毒素质粒DNA的制备

  1. 从新鲜划线的选择性平板中挑取含有目的基因的单个细菌菌落，该基因位于哺乳动物表达载体中。
  2. 按照 commercially available 无内毒素质粒提取试剂盒说明书中的推荐步骤进行细菌培养与收集。
  3. 根据 commercially available 无内毒素质粒提取试剂盒的操作流程，从细菌细胞中纯化无内毒素质粒 DNA。
  4. 使用无内毒素的塑料器皿，并小心操作 DNA，以确保在去除内毒素后不会重新污染 DNA 样品。
  5. 通过微体积紫外分光光度计在 260 nm 处测定吸光度来测量无内毒素质粒 DNA 的浓度，可采用下述方法或标准比色皿型分光光度计。
    1. 按以下步骤清洁微体积分光光度计样品固定系统的下部和上部光学表面：将 1 μl 干净的去离子水用移液器加到下部光学系统表面，合上杠杆臂并轻敲数次，使上部光学系统浸润，然后打开杠杆臂，用纸巾擦拭干净。
    2. 打开微体积分光光度计的软件，选择核酸检测模块。
    3. 在下部光学系统表面加入 1 μl 干净的去离子水，放下杠杆臂，在程序软件中选择“初始化”。初始化完成后，用纸巾清洁两个光学表面。
    4. 加入 1 μl 无内毒素 TE 缓冲液（10 mM Tris-Cl, pH 8.0；1 mM EDTA）作为空白样，选择程序软件中的“空白”进行空白测定。空白测定完成后，用纸巾清洁两个光学表面。
    5. 加入 1 μl 无内毒素 DNA 样品，选择程序软件中的“测量”进行样品测定。记录 DNA 浓度，并通过屏幕上显示的 260/280 nm 吸光度比值评估 DNA 纯度。由于 HGD 实验中理想使用高纯度 DNA（260/280 比值为 1.8），应避免使用比值低于 1.7 的 DNA 样品。测定完成后，用纸巾清洁两个光学表面。

2. 小鼠称重

  1. 以适合该品系的方式标记小鼠。注意：不建议通过标记尾巴来进行识别。
    1. 对于毛色为白色的小鼠品系（例如 Swiss Webster），使用黑色标记笔在其背部做标记。根据需要随时间重新涂抹标记。
    2. 对于毛色为黑色的小鼠品系（例如 C57BL/6），应提前数天通过耳部打孔进行标记。
  2. 将小鼠轻轻放入置于电子天平上的动物称重托盘或容器中，逐只称重。在实验当天记录每只实验小鼠的体重。

3. 注射器的准备

  1. 注射混合液的制备
    1. 根据每只小鼠注射5 - 50 μg无内毒素质粒DNA的标准，计算所需DNA的总量。
      1. 通过实验确定质粒DNA的最佳用量。
      2. 在计算所需DNA量时，应额外按每组多一只小鼠计算，以确保注射器装液充分。为便于计算，参考以下示例：对4只实验组和4只对照组小鼠（每只体重25 g）进行注射，每只小鼠注射50 μg质粒DNA。在此情况下，计算时应按每组5只小鼠计：5 × 50 μg = 每组需250 μg DNA。
    2. 根据每只小鼠注射量为体重的10%，计算所需生理盐水（0.9%氯化钠）的体积。
      1. 根据上述示例，每只25 g小鼠需在2.5 ml生理盐水（2.5 g液体）中注射50 μg质粒DNA。
      2. 在计算整组小鼠所需生理盐水量时，应额外按每组多一只小鼠计算，以确保注射器装液充分。以该实验为例，每组按5只小鼠计算所需生理盐水量：5 × 2.5 ml = 每组12.5 ml生理盐水（共25 ml）。注意：若同组小鼠体重差异超过10%，应分别配制注射混合液。
    3. 使用经批准可用于人体、不含防腐剂和内毒素的无菌生理盐水，规格为10 ml多剂量西林瓶。
    4. 使用连接在20 ml注射器鲁尔锁接头上的20号针头（0.9 mm × 25 mm），从生理盐水瓶中抽取液体，并将注射器内容物排入50 ml锥形管中。为便于在配制DNA-生理盐水注射混合液时精确移液，应收集比实验所需总量更多的生理盐水。以上述实验为例，即使计算所需生理盐水量仅为25 ml，也应从3个10 ml西林瓶中抽取生理盐水（总计约30 ml）。
    5. 将计算量的DNA用移液器加入另一个50 ml锥形管中。操作时注意移液器本体勿接触管壁，以防引入内毒素。根据示例，将250 μg对照组和250 μg实验组质粒DNA分别加入不同的锥形管中。
    6. 使用血清移液管向DNA中加入所需体积的生理盐水。以上述实验为例，向每种主混合液（实验组和对照组）中加入12.5 ml生理盐水。
    7. 所有溶液在注射前应恢复至室温。
  2. 注射器的准备
    1. 为每只小鼠准备一支无菌3 ml鲁尔锁注射器，使用无菌20号针头（0.9 mm × 25 mm）将DNA-生理盐水混合液吸入注射器中。注意避免产生气泡。避免使用更大容量的注射器，因其注射流速难以精确控制，且单手操作较大注射器较为困难。将多余的DNA-生理盐水混合液排回锥形管中，可重复使用。
    2. 更换为无菌27号针头。完全充满液体，确保无气泡。根据小鼠体重调整DNA-生理盐水混合液的注射体积。
    3. 未加盖的针头不得接触任何非无菌表面。如需重新盖帽，可采用单手操作法：将针帽置于平坦表面，不使用另一只手握持针帽，将针头插入后，将带帽针头轻压于坚固物体上以确保针帽固定。此时注射器已准备好用于尾静脉注射。

4. 流体动力学DNA递送

  1. 请注意，麻醉小鼠可能会降低其存活率。避免在过冷的环境中进行水动力基因递送（HGD），因为低温也会降低存活率。如果房间环境温度为 20 °C 或使用了麻醉剂，则在操作后应将小鼠置于设定为 37 °C 的加热垫上，以防止动物死亡。若使用麻醉，需确保小鼠在加热垫上时口鼻无遮挡，并持续观察直至其完全恢复。在进行 HGD 前，不得剥夺小鼠的食物或饮水。
  2. 加温小鼠以扩张血管。
    1. 将小鼠笼（含垫料）放置于加热垫上 5 分钟，使垫料温度达到约 38–39 °C。温度应足够低，以确保小鼠可在加热垫上停留较长时间。
    2. 或者，将小鼠轻轻放入背侧固定器中，限制程度尽可能小。用浸有温水的纱布轻轻夹住小鼠尾巴，加热约 1 分钟。如有需要，允许小鼠调整体位。用纸巾擦拭尾巴使其干燥。
    3. 或者，将笼子置于加热灯下不超过 2 分钟以加热小鼠。若使用加热灯，需谨慎操作，避免小鼠过热。
  3. 大体积尾静脉注射
    1. 用实验室胶带将背侧固定器固定在平坦表面上。
    2. 抓住小鼠尾巴，将其轻柔地放入固定器中，并插入塞子。使用尽可能小的限制力以固定尾巴，同时确保小鼠能够自由呼吸。
    3. 若在操作过程中小鼠出现严重不适，应立即将其从固定器中取出，并允许其休息。
    4. 调整小鼠位置，使一侧尾侧静脉清晰可见。从正上方观察小鼠尾部：尾部中央呈红色的条纹为动脉，而两侧呈蓝色的条纹为尾侧静脉。
    5. 用酒精棉片彻底擦拭小鼠尾巴。
    6. 用非注射手将尾部夹紧于食指与中指之间，使尾巴从食指下方穿过，跨过中指和无名指，再从小指下方穿出。拇指保持自由可动状态。（图 1A）
    7. 用另一只手再次用酒精棉片擦拭待注射区域，待其自然干燥。
    8. 用注射手拿起已装液的注射器，以拇指与其他四指夹持针筒主体，切勿触碰推杆。
    9. 将注射器与尾巴平行放置，针尖朝向小鼠身体，针头斜面（倾斜边缘）朝上。
    10. 将针头插入尾静脉。只有当静脉定位准确时才进行注射，此时针头应无阻力地滑入静脉。注意，针头插入深度因人而异，但不建议完全插入，以免增加静脉撕裂风险。避免移动针头。
    11. 用持尾手的拇指压紧针座，并将针座紧贴尾巴以固定针头位置。切勿施加过大压力，也不要握持针杆，以免阻碍液体流入静脉。此时用食指松持尾巴，以免影响注射（图 1A）。
    12. 调整持注射器的手，使食指和中指握住针座法兰，拇指置于推杆末端（图 1A）。
    13. 用拇指以连续、均匀的动作推动推杆，在 6–8 秒内完成全部液体的注射。
    14. 拔出针头，并用纸巾轻压尾部以止血。
    15. 将小鼠从固定器中取出，放入放置在加热垫上的恢复笼中（垫料温度应为 37–38 °C）。若注射室温度较低，此步骤对小鼠存活至关重要。握住小鼠尾巴直至出血完全停止。
    16. 在水动力 DNA 递送后观察小鼠 1 小时。由于 HGD 引起的短暂心律失常，初期出现喘息和不动是正常现象，但需确保小鼠约 5 分钟内出现恢复迹象。若小鼠呼吸变得极为微弱，可轻柔按摩其腹部以促进呼吸。请注意，恢复速度可能因小鼠品系不同而略有差异。
    17. 将小鼠送回饲养笼，并确保其有充足的食物和饮水供应。
  4. 采用另一种手部姿势进行大体积尾静脉注射
    1. 将小鼠放入固定器中，并按照前述步骤 4.3.1 至 4.3.5 进行注射前准备。
    2. 将非注射手平放在平坦表面上，四指弯曲成 90 度角，除拇指外的所有手指上下叠放，形成一个平台。将小鼠尾巴夹在拇指与食指之间（图 1B）。
    3. 用另一只手再次用酒精棉片擦拭待注射区域，待其自然干燥。
    4. 用注射手握住注射器，以手指夹持针座和推杆末端，准备注射。
    5. 按照前述步骤 4.3.9 至 4.3.17 完成后续操作。

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结果

将针头准确插入小鼠尾静脉（如图1所示）是通过流体动力法转染成功递送转基因的前提。然而，该技术最具挑战性的部分通常是保持针头在尾静脉内稳定不动，以便在6-8秒内完成全部注射体积的注入。注射过程中的微小失误可能导致转染效率和蛋白表达显著降低。因此，对每次实验的水动力基因递送（HGD）效果进行监测至关重要。如果由于缺乏高灵敏度抗体而难以通过蛋白质印迹法检测目标转基因蛋白（例如狒狒APOL-I），则可通过共注射携带易于检测蛋白基因的质粒来评估注射效率。在图2所示的实验中，小鼠被注射了50 μg携带三种不同6XHIS标记位点的狒狒APOL-I基因之一的质粒，以及50 μg另一质粒（相同表达载体设计），该质粒携带未标记的狒狒HPR（bHPR）。本实验的主要目的是评估在选定序列位置添加6XHIS标签是否干扰狒狒APOL-I蛋白的正确加工与分泌。然而，如果标签的加入破坏了蛋白的正确折叠，从而影响其分泌，则很难判断蛋白表达缺失是由于加工障碍还是HGD失败所致。此外，由于缺乏足够灵敏的抗体，即使在基因成功递送的情况下（通过小鼠对人类感染...

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讨论

若操作正确，水动力基因递送（HGD）是一种极为安全且有效的转基因递送方法。HGD 成功的关键步骤包括：1）将适量的 DNA 溶于大体积的生理盐水中；2）注入小鼠尾静脉；3）在 8 秒内完成注射。

尽管注射操作本身无疑需要一定的手法技巧，但这一六秒程序的成功往往取决于实验的充分准备。为实现最大基因表达所需的质粒DNA（pDNA）量可能因所用质粒及目标基因的不同而有很大差异，因此每种应用所需的最适DNA注射量应通过实验确定。对于小鼠，通常推荐的DNA用量范围为5–50 μg，超过此范围后基因表达可能达到平台期。在我们的实验中，注射50 μg携带APOL-I或HPR基因的pRG977质粒，可在水动力基因递送（HGD）后的前两天内导致循环蛋白水平显著升高。两种蛋白的血液浓度在随后几天内显著下降，约在第10天时降至检测限以下（38及未发表数据）。最适DNA量应溶于相当于小鼠体重8–12%体积的生理溶液中进行递送1,2。尽管包括我们在内的大多数研究人员使用生理盐水作为注射...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢 Xia Liu（再生元制药公司）最初向我们传授了 HGD 技术，感谢 Russell Thomson 博士（阿尔伯特·爱因斯坦医学院）在该技术各个方面的持续指导。本研究由纽约市立大学亨特学院启动资金和美国国家科学基金会 Bread 项目 IOS-1249166 资助。我们感谢纽约大学朗格尼医学中心组织病理学核心实验室纽约大学癌症研究所中心支持基金（NIH/NCI 5 P30CA16087-31）提供的小鼠肝脏组织学分析支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
酒精消毒片Webcol6818
AST试剂盒，比色法 AmpliteAAT Bioquest13801
50 ml 锥形管BD Falcon352070
内毒素清除型质粒大提试剂盒（EndoFree Plasmid Maxi Kit）Qiagen12362
吸水纸（KimWipes）KIMTECH34120
小鼠尾部照明器（Mouse Tail Illuminator）Braintree ScientificMTI RST或同等产品
针头，20 G × 1 (0.9 mm × 25 mm)BD305175
针头，27 G × 1/2 (0.9 mm × 25 mm)BD305109
pRG977（哺乳动物表达载体）Regeneron Pharmaceuticals需签订材料转移协议
氯化钠注射液，0.9% USP 10 ml，Hospira FisherNC9054335
3 ml 带鲁尔锁扣接头的注射器（Syringe, 3 ml, Luer-Lok Tip）BD309657必须使用鲁尔锁接头以承受HGD产生的压力

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