通过水动力基因递送法对裸DNA进行体内转染，可将基因导入动物组织，且引发的炎症反应极小。该方法能够产生足量的基因产物，从而可用于分析基因功能与调控机制，以及蛋白质结构与功能。
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本文内容
摘要
摘要
高效表达外源基因 体内 在研究基因功能和开发疾病治疗方法方面具有至关重要的意义。近年来，水动力基因递送（HGD）已成为一种简单、快速、安全且有效的将外源基因导入啮齿类动物的方法。该技术依赖于快速注射大量生理溶液所产生的流体动力，以增加灌注器官细胞膜的通透性，从而将DNA导入细胞。HGD的主要优势之一是能够使用裸质粒DNA（pDNA）将外源基因导入哺乳动物细胞。利用质粒导入外源基因操作简便、效率高，且与病毒载体相比具有显著的安全性。HGD最初用于小鼠的基因递送，目前已广泛用于向小鼠、大鼠以及有限程度上的其他动物递送多种物质，包括寡核苷酸、人工染色体、RNA、蛋白质和小分子。本实验方案描述了小鼠中的HGD操作，并重点阐述该方法中对成功实施该技术至关重要的三个关键环节：针头正确插入静脉、注射体积以及递送速度。文中举例说明了该方法在两种编码分泌型灵长类特异性蛋白——载脂蛋白L-I（APOL-I）和结合珠蛋白相关蛋白（HPR）——的基因瞬时表达中的应用。
引言
自从Liu et al. 和 Zhang et al. 首次描述以来，水动力基因递送（HGD）已成为在啮齿类动物模型系统中研究基因功能不可或缺的工具1,2。该技术通过在短时间内（5-7秒）将大量液体（8-12%体重）快速注入小鼠尾静脉，以促进靶器官细胞对质粒DNA的摄取1,2。这些条件可在肝脏中实现高效的基因表达，而在肾脏、脾脏、肺和心脏中的基因表达水平较低。
注射10 μg pCMV-LacZ质粒可转染多达40%的肝细胞，使水动力基因递送（HGD）成为最高效的非病毒性 体内 迄今为止的基因递送方法1与病毒载体不同，质粒DNA易于制备，且不会在啮齿类宿主中引发免疫反应3 且不会与内源性病毒发生重组而带来健康风险。此外，由于HGD递送的DNA分子无需包装，该方法适用于递送长达150 kb的细菌人工染色体（BAC）4. 通过水动力方法递送的其他类型分子还包括RNA5-10，吗啉寡聚核苷酸11蛋白质12,13 以及其他小分子12,14. 文献中的优秀综述已讨论了....
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方案
本研究所述所有实验均经纽约市立大学亨特学院机构动物照护与使用委员会批准。
1. 无内毒素质粒DNA的制备
- 从新鲜划线的选择性平板中挑取含有目的基因的单个细菌菌落，该基因位于哺乳动物表达载体中。
- 按照 commercially available 无内毒素质粒提取试剂盒说明书中的推荐步骤进行细菌培养与收集。
- 根据 commercially available 无内毒素质粒提取试剂盒的操作流程，从细菌细胞中纯化无内毒素质粒 DNA。
- 使用无内毒素的塑料器皿，并小心操作 DNA，以确保在去除内毒素后不会重新污染 DNA 样品。
- 通过微体积紫外分光光度计在 260 nm 处测定吸光度来测量无内毒素质粒 DNA 的浓度，可采用下述方法或标准比色皿型分光光度计。
- 按以下步骤清洁微体积分光光度计样品固定系统的下部和上部光学表面：将 1 μl 干净的去离子水用移液器加到下部光学系统表面，合上杠杆臂并轻敲数次，使上部光学系统浸润，然后打开杠杆臂，用纸巾擦拭干净。
- 打开微体积分光光度计的软件，选择核酸检测模块。
- 在下部光学系统表面加入 1 μl 干净的去离子水，放下杠杆臂，在程序软件中选择“初始化”。初始化完成后，用纸巾清洁两个光学表面。
- 加入 1 μl 无内毒素 TE 缓冲液（10 mM Tr....
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结果
将针头准确插入小鼠尾静脉（如图1所示）是通过流体动力法转染成功递送转基因的前提。然而，该技术最具挑战性的部分通常是保持针头在尾静脉内稳定不动，以便在6-8秒内完成全部注射体积的注入。注射过程中的微小失误可能导致转染效率和蛋白表达显著降低。因此，对每次实验的水动力基因递送（HGD）效果进行监测至关重要。如果由于缺乏高灵敏度抗体而难以通过蛋白质印迹法检测目标转基因蛋白（例如狒狒APOL-I），则可通过共注射携带易于检测蛋白基因的质粒来评估注射效率。在图2所示的实验中，小鼠被注射了50 μg携带三种不同6XHIS标记位点的狒狒APOL-I基因之一的质粒，以及50 μg另一质粒（相同表达载体设计），该质粒携带未标记的狒狒HPR（bHPR）。本实验的主要目的是评估在选定序列位置添加6XHIS标签是否干扰狒狒APOL-I蛋白的正确加工与分泌。然而，如果标签的加入破坏了蛋白的正确折叠，从而影响其分泌，则很难判断蛋白表达缺失是由于加工障碍还是HGD失败所致。此外，由于缺乏足够灵敏的抗体，即使在基因成功递送的情况下（通过小鼠对人类感染.......
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讨论
若操作正确，水动力基因递送（HGD）是一种极为安全且有效的转基因递送方法。HGD 成功的关键步骤包括：1）将适量的 DNA 溶于大体积的生理盐水中；2）注入小鼠尾静脉；3）在 8 秒内完成注射。
尽管注射操作本身无疑需要一定的手法技巧，但这一六秒程序的成功往往取决于实验的充分准备。为实现最大基因表达所需的质粒DNA（pDNA）量可能因所用质粒及目标基因的不同而有很大差异，因此每种应用所需的最适DNA注射量应通过实验确定。对于小鼠，通常推荐的DNA用量范围为5–50 μg，超过此范围后基因表达可能达到平台期。在我们的实验中，注射50 μg携带APOL-I或HPR基因的pRG977质粒，可在水动力基因递送（HGD）后的前两天内导致循环蛋白水平显著升高。两种蛋白的血液浓度在随后几天内显著下降，约在第10天时降至检测限以下（38及未发表数据）。最适DNA量应溶于相当于小鼠体重8–12%体积的生理溶液中进行递送1,2。尽管包括我们在内的大多数研究人员使用生理盐水作为注射.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢 Xia Liu（再生元制药公司）最初向我们传授了 HGD 技术，感谢 Russell Thomson 博士（阿尔伯特·爱因斯坦医学院）在该技术各个方面的持续指导。本研究由纽约市立大学亨特学院启动资金和美国国家科学基金会 Bread 项目 IOS-1249166 资助。我们感谢纽约大学朗格尼医学中心组织病理学核心实验室纽约大学癌症研究所中心支持基金（NIH/NCI 5 P30CA16087-31）提供的小鼠肝脏组织学分析支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酒精消毒片 | Webcol | 6818 | |
| AST试剂盒，比色法 Amplite | AAT Bioquest | 13801 | |
| 50 ml 锥形管 | BD Falcon | 352070 | |
| 内毒素清除型质粒大提试剂盒（EndoFree Plasmid Maxi Kit） | Qiagen | 12362 | |
| 吸水纸（KimWipes） | KIMTECH | 34120 | |
| 小鼠尾部照明器（Mouse Tail Illuminator） | Braintree Scientific | MTI RST | 或同等产品 |
| 针头，20 G × 1 (0.9 mm × 25 mm) | BD | 305175 | |
| 针头，27 G × 1/2 (0.9 mm × 25 mm) | BD | 305109 | |
| pRG977（哺乳动物表达载体） | Regeneron Pharmaceuticals | 需签订材料转移协议 | |
| 氯化钠注射液，0.9% USP 10 ml，Hospira | Fisher | NC9054335 | |
| 3 ml 带鲁尔锁扣接头的注射器（Syringe, 3 ml, Luer-Lok Tip） | BD | 309657 | 必须使用鲁尔锁接头以承受HGD产生的压力 |
参考文献
- Liu, F., Song, Y., Liu, D. Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther. 6, 1258-1266 (1999).
- Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. High levels of foreign gene expression in hepatocyt....
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重印与许可
