一种吞噬作用检测方法：评估中枢神经系统吞噬细胞与神经元相互作用的实验方案

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，具有高度吞噬或摄取其细胞外环境中物质的能力。本文介绍了一种广泛适用、可靠且高度定量的检测方法，用于可视化并测量小胶质细胞介导的突触组分的吞噬作用。

摘要

吞噬作用是一种细胞将其周围细胞外环境中的物质（整个细胞、细胞碎片、残骸等）吞入并随后消化这些物质的过程，通常通过溶酶体降解实现。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，其吞噬功能已在多种生理和病理条件下被广泛描述，包括神经退行性疾病（例如，阿尔茨海默病中的β-淀粉样蛋白清除）以及健康大脑的发育过程（例如，突触修剪）^1-6。以下方案是一种吞噬检测方法，旨在可视化并定量分析发育中的小鼠视网膜-外侧膝状体系统中小胶质细胞介导的突触前输入的吞噬情况⁷。尽管该检测方法在此特定背景下用于评估小胶质细胞的功能，但类似的方法也可用于评估脑内其他吞噬细胞（例如，星形胶质细胞）以及身体其他部位的吞噬细胞（例如，外周巨噬细胞），也可应用于其他存在突触重塑的情境（例如，脑损伤/疾病）。

引言

突触环路在动物的一生中持续发生重塑。在发育中的大脑中，突触会过量形成，随后必须经历突触修剪过程，即选择性地消除一部分突触，同时保留并强化其余的突触^8-10。这一过程对于实现成年神经系统所特有的精确连接模式至关重要。在成年个体中，突触仍具有可塑性，尤其是在学习与记忆过程中。这种可塑性的结构基础被认为包括树突棘和突触前终扣的增加和/或消失^11-13。除了在健康神经系统中的作用外，突触重塑也参与神经系统疾病或损伤过程^12,14,15。例如，在脊髓损伤后，被切断的轴突需要进行重塑并形成新的突触，以实现功能恢复^16-19。

突触可塑性的一个重要方面是吞噬作用，即吞噬即将被清除的突触的过程^3,5,20。我们最近在健康出生后小鼠大脑的突触修剪背景下揭示了这一现象⁷。具体而言，在发育性突触修剪的高峰期和特定脑区——丘脑的出生后背外侧膝状体核（dLGN）中，大脑常驻免疫细胞和吞噬细胞——小胶质细胞被证实能够吞噬突触前输入。对该吞噬过程进行基因或药物阻断会导致突触连接持续存在缺陷。

在本实验方案中，我们描述了一种可靠且高度定量的检测方法，用于测量吞噬细胞对突触前输入的吞噬作用。本文将以发育中的视网膜丘脑系统为例介绍该检测方法，该系统包括位于视网膜内的视网膜神经节细胞（RGCs），其向背外侧膝状体（dLGN）投射....

方案

1. RGC 突触前输入的顺行标记

注意：所有涉及动物使用的实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）的全部指南，由机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并监督。

1. 对实验区域和器械进行灭菌处理。
2. 使用含 4 vol % 异氟烷的气体在 Plexiglas 诱导室中对小鼠进行麻醉（该浓度异氟烷适用于新生至成年小鼠）。密切观察小鼠状态，避免过度麻醉。注意：应使用真空废气清除系统，避免吸入麻醉气体。
3. 麻醉 1–3 分钟后（年龄较大的小鼠所需时间较短），通过轻捏尾部（无反应为宜）并观察呼吸频率（呼吸应缓慢且稳定）来确认麻醉深度是否合适。
4. 将小鼠侧置于体视显微镜下，将输送 3–4 vol % 异氟烷的鼻罩覆盖于口鼻部（出生后 10 天内（P10）的新生鼠约需 4 vol %；< P10 的新生鼠使用 ~4 vol %；>P10 的小鼠使用 ~3 vol %）。
5. 暴露巩膜。对于睁眼前期的新生鼠注射，使用小型弹簧剪刀剪开眼睑，并向后牵拉皮肤以暴露巩膜。对于较大龄小鼠，可用手指向后牵拉眼部周围皮肤以暴露巩膜。注意：在新生鼠中，有时需要在眼角处做另一条垂直切口。剪切眼睑角落时需格外小心，此处存在血管，若被切断会导致大量出血。
6. 使用无菌 30.5 G 针头在巩膜起始处的眼侧壁刺入一个小孔。进针时应仅使针尖斜面进入眼内，避免插入过深而损伤晶状体。

结果

近期，我们利用该吞噬实验在发育中的视网膜丘脑系统中可视化并量化了小胶质细胞对突触前输入的吞噬作用（图1）⁷。分别使用CTB-594和CTB-647对CX3CR1-EGFP杂合小鼠的视网膜神经节细胞（RGCs）进行顺行示踪，注入左眼和右眼。完成示踪后，对背外侧膝状体（dLGN）内EGFP阳性的小胶质细胞进行成像。随后对这些图像进行表面渲染以进行体积测量。

利用该技术，我们发现在dLGN发育过程中突触重塑的高峰期（P5），突触前输入被小胶质细胞吞噬（图6）。仅4天后，当大部分重塑过程接近完成时（P9），被吞噬的输入结构数量显著减少。此外，在经典补体级联相关蛋白缺陷的小鼠中，吞噬和修剪过程均受到破坏（图6），而神经元放电活动的调控同样会导致该过程异常（数据未显示）⁷。

讨论

为了准确测量吞噬作用，必须对被吞噬的物质进行标记，以便研究人员在溶酶体降解发生后仍能观察到该物质。此外，还需要高分辨率成像，并结合使用相关软件，使研究人员能够观察整个细胞的体积并量化其内容物。在本实验方案中，我们描述了一种高度可靠且可定量的检测吞噬细胞介导吞噬作用的方法，该方法利用与Alexa染料偶联的霍乱毒素B亚基（CTB）标记被吞噬的物质，结合高分辨率共聚焦显微镜和三维重建技术。本实验室已成功应用该方法分析发育中小鼠脑内小胶质细胞对正在进行突触重塑的突触前输入结构的吞噬作用（视网膜-外侧膝状体系统）⁷。此外，该技术具有高度敏感性，能够在非病理条件下区分不同发育阶段之间以及野生型与基因敲除小鼠之间吞噬作用的细微变化。通过稍作调整，本方案还可适用于通过延时成像研究活体组织中的吞噬过程。此外，该方案也可用于研究疾病状态下吞噬细胞与神经元之间的相互作用。

注意事项

该检测方法最有用的特点之一是能够标记神经元投射，使其在进入溶酶体降解途径后仍保持可见。然而，由于神经元本身被标记，可能难以区分细胞的哪一部分已被吞噬。这.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
加热垫	Vet Equip, Inc.	965500
加热垫用温水来源	Kent Scientific	TP-700
体视显微镜	DSC Optical	Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope
带冷冻台的滑动式切片机	Leica	SM2010 R
切片机刀片	Leica	14021607100
荧光解剖显微镜	Nikon	SMZ800 with Epi-fluorescence attachment
转盘共聚焦显微镜	Perkin Elmer	UltraView Vox Spinning Disk Confocal
10 µl Hamilton 气密式注射器	Hamilton	80030	每种颜色染料/示踪剂使用不同的注射器
Hamilton 针头	Hamilton	7803-05，规格：钝头，1.5"
Alexa 标记的霍乱毒素 β 亚基（CTB）	Invitrogen	488: C22841	用无菌生理盐水重悬，488 型为 80 µl，594 型为 100 µl，647 型为 20 µl
594: C22842
647: C34778
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Sigma	P4417-50TAB
新霉素和多粘菌素 B 硫酸盐及杆菌肽锌眼膏 USP（抗生素眼膏）	Bausch & Lomb	24208-780-55
30.5 G 针头	Becton Dickinson	305106
弹簧剪刀	Roboz	RS-5630
棉签	Fisher	23-400-125
多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	15710	将16%的溶液用PBS稀释至4%。多聚甲醛有毒，应在通风橱中操作并佩戴个人防护装备。
解剖工具 – 剪刀、镊子、刮刀	小型剪刀：Fine Science Tools	小型剪刀：14370-22
大型剪刀：Roboz	大型剪刀：RS-6820
#55 镊子：Fine Science Tools	#55 镊子：11255-20
刮刀：Ted Pella, Inc.	刮刀：13504
蔗糖	Sigma	S8501-5KG	配制30%的蔗糖PBS溶液（重量/体积）
OCT 包埋剂	VWR	25608-930
称量皿	USA Scientific	2347-1426
24孔板	BD Biosciences	353047
磷酸二氢钠	Sigma	S6566-500G	配制0.2 M 磷酸二氢钠（PB-A）水溶液（ddH2O）和0.2 M 磷酸氢二钠（PB-B）水溶液（ddH2O）。配制0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）时，取19 ml PB-A 和81 ml PB-B，加ddH2O定容至200 ml
磷酸氢二钠	Sigma	S5136-500G
盖玻片，22 × 50 mm，No. 1.5	VWR	48393 194
带电荷的显微镜载玻片	VWR	48311-703
Vectashield 封片剂	Vector Laboratories	H-1200