一种吞噬作用检测方法：评估中枢神经系统吞噬细胞与神经元相互作用的实验方案

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，具有高度吞噬或摄取其细胞外环境中物质的能力。本文介绍了一种广泛适用、可靠且高度定量的检测方法，用于可视化并测量小胶质细胞介导的突触组分的吞噬作用。

摘要

吞噬作用是一种细胞将其周围细胞外环境中的物质（整个细胞、细胞碎片、残骸等）吞入并随后消化这些物质的过程，通常通过溶酶体降解实现。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，其吞噬功能已在多种生理和病理条件下被广泛描述，包括神经退行性疾病（例如，阿尔茨海默病中的β-淀粉样蛋白清除）以及健康大脑的发育过程（例如，突触修剪）^1-6。以下方案是一种吞噬检测方法，旨在可视化并定量分析发育中的小鼠视网膜-外侧膝状体系统中小胶质细胞介导的突触前输入的吞噬情况⁷。尽管该检测方法在此特定背景下用于评估小胶质细胞的功能，但类似的方法也可用于评估脑内其他吞噬细胞（例如，星形胶质细胞）以及身体其他部位的吞噬细胞（例如，外周巨噬细胞），也可应用于其他存在突触重塑的情境（例如，脑损伤/疾病）。

引言

突触环路在动物的一生中持续发生重塑。在发育中的大脑中，突触会过量形成，随后必须经历突触修剪过程，即选择性地消除一部分突触，同时保留并强化其余的突触^8-10。这一过程对于实现成年神经系统所特有的精确连接模式至关重要。在成年个体中，突触仍具有可塑性，尤其是在学习与记忆过程中。这种可塑性的结构基础被认为包括树突棘和突触前终扣的增加和/或消失^11-13。除了在健康神经系统中的作用外，突触重塑也参与神经系统疾病或损伤过程^12,14,15。例如，在脊髓损伤后，被切断的轴突需要进行重塑并形成新的突触，以实现功能恢复^16-19。

突触可塑性的一个重要方面是吞噬作用，即吞噬即将被清除的突触的过程^3,5,20。我们最近在健康出生后小鼠大脑的突触修剪背景下揭示了这一现象⁷。具体而言，在发育性突触修剪的高峰期和特定脑区——丘脑的出生后背外侧膝状体核（dLGN）中，大脑常驻免疫细胞和吞噬细胞——小胶质细胞被证实能够吞噬突触前输入。对该吞噬过程进行基因或药物阻断会导致突触连接持续存在缺陷。

在本实验方案中，我们描述了一种可靠且高度定量的检测方法，用于测量吞噬细胞对突触前输入的吞噬作用。本文将以发育中的视网膜丘脑系统为例介绍该检测方法，该系统包括位于视网膜内的视网膜神经节细胞（RGCs），其向背外侧膝状体（dLGN）投射突触前输入（图1A）。首先，将介绍一种溶酶体降解抗性的顺行标记策略，用于在dLGN中可视化RGC特异性的突触前输入（图1）^7,21。随后，将详细阐述利用共聚焦显微镜结合三维（3D）表面体积重建技术进行成像及定量测量吞噬作用的方法。该方法基于固定组织样本，但也可调整用于活体成像研究。需要强调的是，尽管该检测方法已在健康出生后视网膜丘脑系统中得到验证，但其同样可应用于研究大脑中其他吞噬细胞-神经元相互作用，以及疾病状态下的相关过程，还可拓展至其他器官系统中吞噬细胞功能的研究。

方案

1. RGC 突触前输入的顺行标记

注意：所有涉及动物使用的实验均按照美国国立卫生研究院（NIH）的全部指南，由机构动物护理和使用委员会（IACUC）审查并监督。

1. 对实验区域和器械进行灭菌处理。
2. 使用含 4 vol % 异氟烷的气体在 Plexiglas 诱导室中对小鼠进行麻醉（该浓度异氟烷适用于新生至成年小鼠）。密切观察小鼠状态，避免过度麻醉。注意：应使用真空废气清除系统，避免吸入麻醉气体。
3. 麻醉 1–3 分钟后（年龄较大的小鼠所需时间较短），通过轻捏尾部（无反应为宜）并观察呼吸频率（呼吸应缓慢且稳定）来确认麻醉深度是否合适。
4. 将小鼠侧置于体视显微镜下，将输送 3–4 vol % 异氟烷的鼻罩覆盖于口鼻部（出生后 10 天内（P10）的新生鼠约需 4 vol %；< P10 的新生鼠使用 ~4 vol %；>P10 的小鼠使用 ~3 vol %）。
5. 暴露巩膜。对于睁眼前期的新生鼠注射，使用小型弹簧剪刀剪开眼睑，并向后牵拉皮肤以暴露巩膜。对于较大龄小鼠，可用手指向后牵拉眼部周围皮肤以暴露巩膜。注意：在新生鼠中，有时需要在眼角处做另一条垂直切口。剪切眼睑角落时需格外小心，此处存在血管，若被切断会导致大量出血。
6. 使用无菌 30.5 G 针头在巩膜起始处的眼侧壁刺入一个小孔。进针时应仅使针尖斜面进入眼内，避免插入过深而损伤晶状体。
7. 让玻璃体液从小孔自然流出，并使用无菌棉签吸收液体。
8. 待玻璃体液停止流出后，将连接于预装顺行示踪染料的 Hamilton 注射器的钝头针插入小孔。注意：应缓慢进针，避免穿透眼球对侧壁或损伤晶状体。
9. 缓慢将染料注入眼内。通常使用与 Alexa 594、647 或 488 荧光染料偶联的霍乱毒素 β 亚基（CTB-594、CTB-647 或 CTB-488，5–6 µg/µl）进行视网膜神经节细胞（RGC）输入通路的顺行示踪。对于新生鼠（≤P10），注射 1–2 µl 即可；对于 >P10 的小鼠，约需 3 µl。注：Alexa 系列染料特别耐溶酶体降解。
10. 将针头在小孔中停留数秒后，再缓慢拔出。
11. 使用棉签吸收多余液体，防止染料外漏。
12. 在眼部涂抹少量抗生素软膏。若眼睑经手术切开，应轻柔地将眼睑复位闭合。
13. 如需注射双眼，请在另一只眼重复上述操作。
14. 注射完成后，将小鼠置于加热灯下或加热垫上，直至其从麻醉中开始恢复。
15. 将小鼠放回清洁的饲养笼中，并进行监测，确保其完全清醒后再返回动物群。

2. 准备组织以进行成像

该组织制备方案适用于吞噬细胞带有荧光标记的报告基因小鼠（例如，小胶质细胞使用 CX3CR1-EGFP）。若无可用的报告基因品系，研究人员可对组织切片进行免疫染色（见讨论部分）。

1. 注射后约24小时，处死小鼠并解剖脑组织。
2. 在装有4%多聚甲醛（PFA）的Falcon管中于4 °C下浸没固定脑组织过夜。注意：PFA具有毒性，应在通风橱或下吸式操作台中操作，并穿戴个人防护装备，避免吸入或皮肤接触。备注：固定时间可缩短（≥4小时）。此外，也可先采用4% PFA灌注固定，再进行2–24小时浸没固定。然而，对灌注固定与浸没固定的新生及成年脑组织进行比较，结果显示在成像质量或定量分析方面无显著差异。
3. 用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗脑组织3次。
   1. 将脑组织和PFA倒入一个空的称量皿中。
   2. 使用刮勺将脑组织转移至另一个盛有PBS的称量皿中。
   3. 将脑组织清洗两次 更多 在PBS中（将脑组织转移至另外两个装有PBS的称量皿中）。
4. 将脑组织转移至装有30%蔗糖溶液的Falcon管中，置于4 °C条件下，直至脑组织沉降至管底（24–48小时）。
5. 一旦脑组织下沉，即可准备切片。以下步骤用于使用带冷冻台的滑动式切片机（也可使用冰冻切片机）制备40 µm的漂浮切片。
   1. 使用剃须刀片去除不需要的脑组织部分（对于背外侧膝状体，去除脑组织的头端和尾端部分）。
   2. 将脑组织置于干冰上的铝箔中速冻。在此期间，冷冻切片机载台，并向24孔板的每个孔中加入0.5 ml 0.1 M磷酸盐缓冲液（PB）。
6. 将冷冻脑组织（应呈不透明状）固定于冷冻台。
   1. 在载物台上涂抹少量最佳切割温度化合物（OCT）。
   2. 一旦OCT开始结冰，立即将脑组织放入OCT中，待切片的一端应朝上（例如，对于外侧膝状体核（dLGN），应使其尾侧朝上。
   3. 用极细的干冰粉末覆盖脑组织和OCT包埋剂。
   4. 将干冰置于脑组织/OCT上约30秒。
   5. 使用大号画笔清除干冰。脑组织和OCT应冻结在载物台上。
7. 开始切片组织，直至到达目标区域（ROI）。
8. 到达目标区域后，使用小号毛笔从刀片上取下切片，并转移至含有0.1 M PB的24孔板中（步骤2.5.2）。在取切片前，需先将毛笔浸入0.1 M PB中润湿，以保持其湿润。注意：切片可在0.1 M PB中于4 °C条件下保存过夜。
9. 切片收集完毕后，在荧光解剖显微镜下观察顺行标记，并选取包含目标区域（ROI）的切片。
10. 用小号画笔将切片移至载玻片上。
    1. 在带电的显微镜载玻片上滴加少量0.1 M PB溶液。
    2. 将组织切片转移至PB溶液中。
    3. 使用PB和画笔来定位并展开组织。
    4. 使用擦镜纸吸去多余的磷酸缓冲液，注意避免将组织切片一并吸走。
    5. 静置至完全风干。
    6. 在每个切片上滴加少量封片剂，然后盖上盖玻片（22 × 50 mm，No. 1.5）。
    7. 用指甲油密封载玻片边缘，并于 -20 °C 保存至成像实验。注意：尽管建议在制备后一周内进行成像，载玻片在成像前于 -20 °C 可保存数周。

3. 组织成像

所有图像均在转盘共聚焦显微镜（UltraView Vox 转盘共聚焦显微镜，配备半导体激光器（405 nm、445 nm、488 nm、514 nm、561 nm 和 640 nm））上采集。也可使用任何具备采集高分辨率 z 轴层扫图像能力的显微镜进行成像例如，激光扫描共聚焦显微镜、落射荧光显微镜结合去卷积处理等）。帧尺寸通常为 1,000 × 1,000 像素。

1. 在10倍放大倍数下找到感兴趣区域（ROI）并采集图像。对于视网膜-外侧膝状体系统中小胶质细胞的成像，ROI为最内侧的背外侧膝状体（dLGN）切片。
2. 切换至更高放大倍数（通常使用60倍平场复消色差物镜，数值孔径NA = 1.4）。
3. 使用0.2 µm的z轴步长，采集第一个包含吞噬细胞的视野图像。
4. 每只动物额外采集15–19个包含吞噬细胞的视野图像。

4. 为定量分析准备图像（ImageJ）

1. 在 ImageJ 中打开 z-stack 图像。
2. 转到图像菜单，选择颜色并拆分通道。
3. 从包含被吞噬物质的通道中减去背景。
   1. 选择包含被吞噬物质的通道窗口（例如，突触前输入）。
   2. 转到“Process”菜单并选择“Subtract Background”。在dLGN中进行顺行示踪以标记突触前输入时，使用10像素的滚动球半径。注意：滚动球半径需通过经验确定。然而，它 通常应等于图像中不属于背景的最大物体的半径。
4. 抚平含有吞噬细胞的通道。
   1. 选择包含吞噬细胞的通道窗口（例如小胶质细胞
   2. 转到“Process”菜单，选择“Filters”中的“Mean”。使用1.5的均值滤波器（此操作可平滑图像，便于后续步骤中的表面渲染）。
5. 从含有吞噬细胞的通道中减去背景。
   1. 选择包含吞噬细胞的通道窗口（例如小胶质细胞
   2. 转到“Process”菜单，选择“Subtract Background”（设置需通过实验确定）。对于EGFP阳性的小胶质细胞，使用50像素的滚动球半径。
6. 通过点击图像菜单，选择颜色，然后合并通道来合并通道。
7. 从合并文件中裁剪出包含吞噬细胞的感兴趣区域（ROI），以加快表面渲染速度（见步骤5）。
   1. 使用工具栏中的矩形选择工具，在感兴趣区域（ROI）周围绘制一个方框。
   2. 转到图像菜单并选择裁剪。
8. 再次分离通道（参见步骤 4.2）。
9. 将每个通道另存为独立的TIFF文件。

5. 在 Imaris 中准备用于定量分析的图像

1. 打开 Imaris 软件，并确保左上角菜单中已选中 Volume 图标（图2）。
2. 打开裁剪后图像的第一个通道（可任意选择任一通道首先打开，但需保持一致）。
3. 添加其他通道。转到 Edit 菜单，选择 Add Channels，然后在文件中选择下一个通道。（如有更多通道，请重复此步骤）。注意：如需更改颜色，请进入 Display Adjustment 窗口并点击通道名称（图3A），将弹出对话框以调整颜色。若未显示 Display Adjustment 窗口，请转到 Edit 菜单并选择 Display Adjustment。
4. 调整像素值。转到 Edit 菜单并选择 Image Properties。在此窗口中调整 x、y 和 z 方向的像素值（这些数值取决于显微镜、物镜、相机及 z 轴步进采集参数，可在图像采集所用软件中找到）。
5. 第 5.5 步将生成一幅非常小的图像。如需调整大小，请点击右下角的 Fit 图标（图2）。
6. 在 Display Adjustment 窗口中，使用左侧和中间的三角形滑块分别调整每个通道的亮度和对比度。

6. 吞噬细胞的三维（3D）表面重建

1. 在顶部工具栏中，确保已选择 Surpass 模式（图3C).
2. 在显示调整窗口中，取消勾选除吞噬细胞通道外的所有通道。这将使这些通道从视野中移除。
3. 单击表面渲染图标（图2).
4. 左下角将显示一个创建窗口（图4A），确保在此窗口中未勾选“Segment ROI”。单击底部的蓝色前进按钮。
5. 调整平滑度。
   1. 在下一个窗口中，从下拉菜单中选择吞噬细胞通道（图4B）。这会调整显示的细节量，应通过实验确定（小胶质细胞通常采用 0.1 µm 平滑处理）。
   2. 选择绝对阈值法。
   3. 单击底部的蓝色前进按钮。
6. 对图像进行阈值处理。
   1. 单击直方图并拖动，直至图像显示适当图4C）。这通过旋转图像凭经验确定，以确保叠加在荧光图像上的灰色表面能够准确表示实际表面。注：要进行旋转，请在屏幕右上方的指针菜单中选择“Navigate”（导航）。图3B），点击并按住图像以旋转。要将图像恢复至原始方向，请从“视图”菜单中选择“原点位于左下角”。
   2. 单击底部的蓝色前进按钮。
7. 在下一个窗口中，可以选择按大小等条件过滤掉某些表面。除非图像噪声非常严重，否则不要进行过滤，并删除任何自动出现的过滤器。单击底部的绿色箭头，完成吞噬细胞的表面渲染。随后将出现一组新的选项卡（图5)
8. 如有必要，删除不属于目标吞噬细胞部分的任何表面结构。
   1. 确保在指针菜单中已选择“Select”选项（图3B).
   2. 单击任意要删除的表面，使其变为黄色。如需删除多个表面，请在按住控制键的同时单击各个表面。
   3. 在铅笔标签下点击“删除”。
9. 选择并合并吞噬细胞的所有表面为一个整体表面。
   1. 点击漏斗图标（即 筛选标签页； 图5C).
   2. 点击“添加”。
   3. 选择任意滤镜，将直方图拖至最左侧（所有表面应变为黄色）。
   4. 返回到铅笔工具选项卡，然后单击合并。
10. 转到图表选项卡（图 5A）并点击“详细信息”，选择要显示的任意参数。选择体积（图5D）。要显示多个参数，请转至左下角的扳手图标（图2）并选择要记录的参数。
11. 记录吞噬细胞的体积并保存文件，然后继续操作。

7. 被吞噬物质的三维表面渲染

1. 为被吞噬细胞吞噬的物质创建一个新通道。
   1. 在选中吞噬细胞表面的情况下，点击铅笔标签。
   2. 点击“Mask All”（全选掩膜）。
   3. 在弹出的对话框中，选择对应于被吞噬物质的通道（例如，突触前输入的顺行示踪；图5B）。
   4. 应用掩膜前勾选“duplicate channel”（复制通道），然后点击确定。
   5. 在“Display Adjustment”（显示调整）窗口中将出现一个新通道，其中仅包含被吞噬并位于吞噬细胞内部的物质。
2. 对包含全部被吞噬和未被吞噬物质的通道进行表面重建。
   1. 在“Display Adjustment”窗口中，除将要进行表面重建的通道外，取消勾选所有其他通道，并取消勾选为吞噬细胞创建的表面。
   2. 再次点击表面重建图标（见步骤6.3），并按照与吞噬细胞相同的步骤（步骤6.4–6.11）为该通道创建表面。注意：在平滑和设定阈值前（步骤6.5；图4B），务必选择正确的通道。记录所使用的阈值（见步骤6.6；图4C）。该数值也可在表面重建完成后获得（Wand标签；图5A）。
3. 记录全部被吞噬和未被吞噬物质的体积，并在继续操作前保存文件。
4. 对被吞噬物质（位于吞噬细胞内部的物质）进行表面重建。
   1. 仅可视化被吞噬物质的新通道的荧光信号（见步骤7.2.1）。
   2. 按照上述相同步骤操作（步骤7.2–7.3）。注意：在平滑处理前，务必从下拉菜单中选择正确的通道（选择步骤7.1中创建的新通道）。在阈值窗口中，手动输入用于重建全部被吞噬和未被吞噬物质时所设定的阈值（见步骤7.2.2）。
5. 记录被吞噬物质的体积，并在继续操作前保存文件。

8. 计算视野的总体积

1. 为任意通道创建一个新的表面。
2. 在阈值设置窗口（步骤 6.6）中，将直方图完全向左滑动，使整个视野区域均被生成表面。
3. 完成整个视野区域的表面生成，并记录体积（步骤 6.7–6.11）。
4. 保存文件。

9. 计算吞噬物质的量

1. 使用以下算法计算完全吞噬和未吞噬物质通道的密度：
   完全吞噬和未吞噬物质的体积（步骤 7.3）/ 视野体积（步骤 8）
2. 使用以下算法计算每个细胞的吞噬百分比：
   （吞噬物质体积（步骤 7.5）/ 吞噬细胞总体积（步骤 6.11））× 100
   备注：为校正细胞大小的差异，数据已归一化至吞噬细胞的总体积。如果步骤 9.1 的数值在不同视野间差异较大，则可能需要将步骤 9.2 的数据归一化至步骤 9.1 的计算结果。

结果

近期，我们利用该吞噬实验在发育中的视网膜丘脑系统中可视化并量化了小胶质细胞对突触前输入的吞噬作用（图1）⁷。分别用CTB-594和CTB-647对CX3CR1-EGFP杂合小鼠的视网膜神经节细胞（RGCs）进行顺行示踪，注入左眼和右眼。完成示踪后，对背外侧膝状体（dLGN）内EGFP阳性的小胶质细胞进行成像。随后对这些图像进行表面渲染以进行体积测量。

利用该技术，我们发现，在dLGN发育过程中突触重塑的高峰期（P5），突触前输入被小胶质细胞吞噬（图6）。仅4天后，当大部分重塑过程接近完成时（P9），被吞噬的输入结构数量显著减少。此外，在经典补体级联相关蛋白缺陷的小鼠中，吞噬和修剪过程均受到破坏（图6），而神经元放电活动的干预也会导致类似异常（数据未显示）⁷。

讨论

为了准确测量吞噬作用，必须对被吞噬的物质进行标记，以便研究人员在溶酶体降解发生后仍能观察到该物质。此外，还需要高分辨率成像，并结合使用相关软件，使研究人员能够观察整个细胞的体积并量化其内容物。在本实验方案中，我们描述了一种高度可靠且可定量的检测吞噬细胞介导吞噬作用的方法，该方法利用与Alexa染料偶联的霍乱毒素B亚基（CTB）标记被吞噬的物质，结合高分辨率共聚焦显微镜和三维重建技术。本实验室已成功应用该方法分析发育中小鼠脑内小胶质细胞对正在进行突触重塑的突触前输入结构的吞噬作用（视网膜-外侧膝状体系统）⁷。此外，该技术具有高度敏感性，能够在非病理条件下区分不同发育阶段之间以及野生型与基因敲除小鼠之间吞噬作用的细微变化。通过稍作调整，本方案还可适用于通过延时成像研究活体组织中的吞噬过程。此外，该方案也可用于研究疾病状态下吞噬细胞与神经元之间的相互作用。

注意事项

该检测方法最有用的特点之一是能够标记神经元投射，使其在进入溶酶体降解途径后仍保持可见。然而，由于神经元本身被标记，可能难以区分细胞的哪一部分已被吞噬。这...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
加热垫	Vet Equip, Inc.	965500
加热垫用温水来源	Kent Scientific	TP-700
体视显微镜	DSC Optical	Zeiss Opmi -6 Surgical Microscope
带冷冻台的滑动式切片机	Leica	SM2010 R
切片机刀片	Leica	14021607100
荧光解剖显微镜	Nikon	SMZ800 with Epi-fluorescence attachment
转盘共聚焦显微镜	Perkin Elmer	UltraView Vox Spinning Disk Confocal
10 µl Hamilton 气密式注射器	Hamilton	80030	每种颜色染料/示踪剂使用不同的注射器
Hamilton 针头	Hamilton	7803-05，规格：钝头，1.5"
Alexa 标记的霍乱毒素 β 亚基（CTB）	Invitrogen	488: C22841	用无菌生理盐水重悬，488 型为 80 µl，594 型为 100 µl，647 型为 20 µl
594: C22842
647: C34778
磷酸盐缓冲液 (PBS)	Sigma	P4417-50TAB
新霉素和多粘菌素 B 硫酸盐及杆菌肽锌眼膏 USP（抗生素眼膏）	Bausch & Lomb	24208-780-55
30.5 G 针头	Becton Dickinson	305106
弹簧剪刀	Roboz	RS-5630
棉签	Fisher	23-400-125
多聚甲醛（PFA）	Electron Microscopy Sciences	15710	将16%的溶液用PBS稀释至4%。多聚甲醛有毒，应在通风橱中操作并佩戴个人防护装备。
解剖工具 – 剪刀、镊子、刮刀	小型剪刀：Fine Science Tools	小型剪刀：14370-22
大型剪刀：Roboz	大型剪刀：RS-6820
#55 镊子：Fine Science Tools	#55 镊子：11255-20
刮刀：Ted Pella, Inc.	刮刀：13504
蔗糖	Sigma	S8501-5KG	配制30%的蔗糖PBS溶液（重量/体积）
OCT 包埋剂	VWR	25608-930
称量皿	USA Scientific	2347-1426
24孔板	BD Biosciences	353047
磷酸二氢钠	Sigma	S6566-500G	配制0.2 M 磷酸二氢钠（PB-A）水溶液（ddH2O）和0.2 M 磷酸氢二钠（PB-B）水溶液（ddH2O）。配制0.1 M 磷酸盐缓冲液（PB）时，取19 ml PB-A 和81 ml PB-B，加ddH2O定容至200 ml
磷酸氢二钠	Sigma	S5136-500G
盖玻片，22 × 50 mm，No. 1.5	VWR	48393 194
带电荷的显微镜载玻片	VWR	48311-703
Vectashield 封片剂	Vector Laboratories	H-1200