完全性脊髓损伤及脑组织解剖后续整体染色操作方案 原位 幼体海七鳃鳗的杂交

摘要

七鳃鳗在完全脊髓损伤后能够恢复运动功能。然而，某些脊髓投射神经元具有良好的再生能力，而另一些则不然。本文阐述了海七鳃鳗幼体（以及近期完成变态的成体）的饲养技术、完全脊髓横断手术的实施方法，以及全脑和脊髓整体装片的制备方法。 原位 杂交。

摘要

在完全性脊髓损伤后，海七鳃鳗最初在横断水平以下出现瘫痪。然而，数周后它们能够恢复运动能力，这一过程伴随着脊髓内轴突以及脑干发出的脊髓投射轴突的短距离再生（数毫米）。在36个可识别的大型脊髓投射神经元中，有些神经元轴突再生能力较强，而另一些则较弱。这些神经元在整体中枢神经系统标本中可被最方便地识别。为了理解脊椎动物中枢神经系统损伤后有利于或抑制轴突再生的神经元内在机制，我们分析了强再生神经元与弱再生神经元之间的基因表达差异，并研究脊髓横断对基因表达的影响。本文介绍了在淡水水箱中饲养幼体及近期完成变态的成年海七鳃鳗、在显微镜下实施完全脊髓横断，以及制备脑和脊髓整体标本用于原位杂交的技术。简而言之，动物在16℃条件下饲养 °C，并在含1%苯佐卡因的七鳃鳗任氏液中进行麻醉。使用虹膜剪从背侧入路横断脊髓，随后将动物置于23 °C的新鲜水箱中恢复。对于 原位 杂交后，动物重新麻醉，通过背侧入路取出脑和脊髓。

引言

在哺乳动物中，脊髓损伤（SCI）是一种破坏性疾病，会导致损伤部位以下的功能永久性丧失，因为受损的轴突无法穿过创伤区域并重新连接到其相应的靶点。与哺乳动物不同，八目鳗在完全脊髓损伤后能够恢复运动功能¹。有趣的是，八目鳗具有一组36个可投射至脊髓的神经元，由于其体积较大，在整体脑组织标本中可被单独识别^2,3（图1）。高位完全脊髓横断会切断所有这些脊髓投射神经元的轴突。我们课题组及他人的前期研究表明，即使在脊髓损伤后功能恢复的情况下，其中一些神经元仍表现出极低的再生能力（被认为是“再生能力差的神经元”），而另一些神经元通常能够使轴突穿过损伤部位实现再生（被认为是“再生能力强的神经元”）^2,3。这一特性使得八目鳗成为一种有趣的脊椎动物模型，可用于研究再生能力强与弱的脊髓投射神经元之间基因表达的差异，进而揭示在相同外部环境中尝试轴突再生的神经元其内在再生能力差异的分子基础¹。

利用该模型，我们先前已证明，再生能力较低的脊髓投射神经元会表达轴突导向分子受体，如 UNC5^4,5 和 neogenin⁶，这些受体分别介导了 netrin 和 RGM 的抑制作用。此外，通过使用该方法，我们课题组还发现，只有再生能力良好的神经元在损伤后及再生过程中表现出神经丝蛋白表达的恢复。最近，Busch 和 Morgan⁷ 通过免疫荧光技术显示，再生能力差的神经元在损伤后 α-synuclein 的表达升高，作者认为这与“再生能力差”的脊髓投射神经元在完全性脊髓横断后缓慢死亡的现象相关^5,7,8。因此，七鳃鳗完全性脊髓损伤模型已成为研究轴突切断后何种因素决定脊髓投射神经元成为“再生能力差”类型的非常有用的模型。

为了开展我们的研究，我们在损伤后设定的时间点进行完全性脊髓横断手术以及后脑解剖，以制备全组织标本 原位 杂交。在本文方法学文章中，我们提供了一套详细的实验方案，用于正确实施幼体七鳃鳗全脊髓损伤手术，随后的动物饲养维护，以及最终的脑组织解剖和整体脑标本制备 原位 杂交。已有文献详细报道了在幼体七鳃鳗脑组织中进行整体原位杂交的实验方案。⁹ 此外，该脊髓损伤与脑组织解剖方案也可用于后续对脑组织进行免疫组织化学或其他组织学方法的处理。

方案

有关本方案中使用的所有材料，请参见表1。

实验已获得天普大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 动物

1. 从密歇根湖支流、特拉华河支流（宾夕法尼亚州）或缅因州的溪流中采集野生型海七鳃鳗（Petromyzon marinus L.）幼体，体长为 10 – 14 cm（4 – 7 龄）。
2. 在实验室中，将幼体以每组 50 - 100 尾的密度饲养于 50 加仑的淡水水箱中，水温维持在 16 °C。水箱底部铺约 2.5 厘米厚的碎石，供幼体钻埋；水需经活性炭过滤，并使用气石曝气至少 48 小时，以去除氯及其他杂质，之后方可放入七鳃鳗。动物无需额外喂食，因其可循环利用自身产生的碎屑物，直至使用当天为止。

2. 完全性脊髓横断

1. 在脊髓手术前，配制一份文昌鱼任氏液，其成分为：110 mM NaCl、2.1 mM KCl、2.6 mM CaCl₂₂，1.8 mM MgCl₂ 和 10 mM Tris 缓冲液；pH 7.4。
2. 为进行脊髓横切，将幼虫置于小容器中，用含1%三卡因甲磺酸盐的冰镇林格液麻醉。
3. 麻醉后，将动物置于一个装有半满Sylgard（硅胶）的培养皿中，使用4枚昆虫针（直径0.15 mm）固定动物位置以进行手术（一枚置于动物吻部，一枚置于尾部，另两枚置于第5节段水平两侧）。^th 鳃）。用任氏液将培养皿几乎加满至顶部。在体视显微镜下进行手术时，将盛有幼体的培养皿置于冰上。
4. 进行脊髓横断时，沿背侧正中线，使用手术刀（#11）在第5椎体水平做一纵向切口^th 用鳃部观察脊髓。首先将刀片尖端朝上插入皮肤切开，然后非常轻柔地剪开肌肉组织，直至从上方可见脊髓。用昆虫针制作两个钩子，用于钩住体壁使其保持张开，以便进行脊髓横断操作。
5. 在第5节段完全横断脊髓^th 使用剪刀（Castroviejo #8）从鳃部垂直于脊髓插入，用一次干净利落的切割完全横断脊髓。在体视显微镜下观察脊髓的切断端，确认脊髓已被完全横断。随后，使用镊子（#5）在横断后重新对齐脊髓的切断端。
6. 完成脊髓横断后，用一对精细镊子闭合背部体壁的切口，并将幼体置于冰上1小时，使伤口干燥。在冰与幼体之间放置一片滤纸，并用七鳃鳗任氏液浸湿。低温可维持动物存活，同时促进伤口晾干，从而有助于防止感染。
7. 然后将幼虫转移至装有冰水的小型水箱中（每箱1条幼虫），处理24小时。
8. 在脊髓横断术后1天检查受损的幼虫，通过行为学确认损伤部位尾端无任何运动。若幼虫仅能移动损伤部位头端的头部（位于第5体节水平），则认为脊髓横断完全^th 鳃）。如果出现此情况，现在可将幼虫转移至盛有室温（23℃）淡水的独立容器中（每容器1条幼虫）。 °C）以恢复至选定的时间点。
9. 在恢复期间，每2至3天更换一次水。

3. 大脑解剖及大脑样本制备 原位 杂交

1. 在损伤后的预定时间点，重新麻醉幼体七鳃鳗，将其置于含有任氏液的培养皿中并固定，按上述方法进行脑组织解剖。
2. 用手术刀在鼻孔与松果体器官之间做一横向切口，以取出脑组织。随后用镊子夹住脑组织，同时使用Castroviejo剪刀开始剪除脑周围组织。
3. 脑暴露后，用镊子去除脉络丛，并使用牵开钩撑开动物头部以暴露脑神经。随后用Castroviejo剪刀横向切断脊髓。用一把镊子夹住脊髓，同时用另一把镊子剪断脑神经，从而分离出脑组织。
4. 解剖后，将脑组织置于一小块硅胶上，用两枚昆虫针插入嗅球，一枚插入脊髓，以固定其位置。随后，用剪刀沿背侧中线切断脑的后联合和 cerebrotectal 联合，将翼板向两侧展开，并用四枚昆虫针将其平展固定于硅胶上。图2).
5. 将带有脑组织的硅胶片转移至含有4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（pH 7.4）的离心管中，在旋转摇床上室温固定3小时。
6. 固定后，按照先前所述方法（Swain 等，1994）。对照组或假手术组动物的脑组织必须始终与损伤组动物的脑组织平行处理。整装幼虫脑可采用以下方法进行研究： 原位 杂交，因其扁平且纤薄的形态以及缺乏髓鞘¹⁰，从而使大脑变得相当透明。

结果

作为使用该方法可获得结果的一个示例，图2展示了整体染色脑组织的代表性图像，显示了对照组以及损伤后两周的幼体七鳃鳗中可识别的脊髓投射神经元内新生素（neogenin）转录本的表达情况。关于新生素在完全脊髓横断后表达变化与七鳃鳗可识别脊髓投射神经元再生能力之间关系的完整细节，请参见先前的研究⁶。简而言之，研究结果表明，损伤后，可识别的脊髓投射神经元中新生素受体的表达发生变化。在完全脊髓横断后两周，新生素受体优先在再生能力差的神经元（如M1、I1、I2、I4或Mth神经元）中表达（见图2B）。这些结果展示了本实验方案的应用效果，并提示新生素受体可能参与了这些细胞再生失败的过程。

讨论

本文介绍了一种在幼体海七鳃鳗中进行完整脊髓横断及后脑解剖的详细方案。该方法可通过整体脑原位杂交技术，分析脊髓损伤后投射至脊髓的可识别神经元之间基因表达的差异。本方案的关键步骤是正确实施完整的脊髓横断，可通过体视显微镜下观察脊髓切断端来控制操作，并在24小时后用镊子轻触幼体吻部，观察损伤部位尾侧是否无运动反应以确认横断成功。此外，为保障动物术后恢复，手术所用剪刀必须锋利，且需一次性完成干净利落的切割，以确保脊髓被完全横断。

在手术期间以及伤口晾干的一小时内将动物置于冰上，并在术后最初24小时内将其置于冰水环境中，可显著提高动物受伤后的存活率。在此阶段之后，伤口已闭合，动物即可转移至室温的淡水水箱中饲养。

由于在较高温度下，大多数幼体七鳃鳗在损伤后能够恢复完整的运动行为功能，因此允许其在室温下恢复，而不是在通常的低温环境下恢复¹¹。在完全脊髓横断术后8至10周可观察到正常运动模式的恢复。

在完成选定时间点的全脊髓横断和幼体脑组织解剖后，不仅可对幼体脑组织...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三卡因甲烷磺酸盐	光谱	TR108	用于安乐死的 PBS 中苯佐卡因饱和溶液
手术刀 #3	Fine Science Tools (FST)	10003-12
手术刀刀片：#11	Fine Science Tools	10011-00
Castroviejo剪刀#8	Fine Science Tools	15002-08
4号镊子 && #5	杜蒙，瑞士	Roboz RS4955	#4 用于脊髓解剖；#5 用于剥离脑膜
体视显微镜	Olympus	SZ51
Sylgard	道康宁公司	184
昆虫针 0.15、0.20 mm	奥斯特利茨	无目录编号	0.15 毫米用于固定脑和脊髓；0.20 毫米用于躯体
带盖 7 ml 高密度聚乙烯闪烁管	Fisher Scientific	03-337-1
16% 多聚甲醛	电子显微镜科学（EMS）	19210	用 PBS 稀释至 4%