实验室估算多氯联苯同系物从猎物向湖鳟（Salvelinus namaycush）的净营养级传递效率

摘要

本文介绍了一种用于实验室估算多氯联苯（PCB）同系物从猎物向食鱼性鱼类净营养级传递效率的技术。为了最大限度地将实验室结果外推至野外实际情况，应使用该食鱼性鱼类在自然环境中通常摄食的鱼类作为饵料进行喂养。

摘要

本文描述了一种在实验室条件下估算多氯联苯（PCB）同系物从猎物向食鱼性鱼类净营养转移效率（γ）的技术方法。在为期135天的实验室实验中，我们将从密歇根湖捕获的圆白鲑（Coregonus hoyi）投喂给饲养在八个实验室水箱中的湖鳟（Salvelinus namaycush）。圆白鲑是湖鳟的天然猎物。在其中四个水箱中，采用相对较高的水流速率以确保湖鳟具有较高的活动水平；而在另外四个水箱中则采用较低的水流速率，使湖鳟保持较低的活动水平。以每个水箱为单位，记录实验期间每天湖鳟摄食的食物量。每条湖鳟在实验开始和结束时均进行称重。实验开始时，从每个水箱中随机安乐死4至9条湖鳟；实验结束时，将每个水箱中剩余的全部10条湖鳟均实施安乐死。我们测定了实验开始时湖鳟体内、实验结束时湖鳟体内以及投喂给湖鳟的圆白鲑体内75种PCB同系物的浓度。基于这些测量数据，计算出每个水箱中75种PCB同系物各自的γ值。进一步分别计算出活跃与不活跃湖鳟组中每种PCB同系物的平均γ值。由于实验在八个水箱中进行了重复，因此可估算平均γ值的标准误差。此类实验的结果可用于风险评估模型，以预测在不同环境污染物暴露情景下，人类和野生动物食用受污染鱼类所面临的未来风险。

引言

在影响鱼类累积污染物速率的所有因素中，鱼类从所摄食物中保留污染物的效率是最重要的因素之一^1-3。目前已开发出风险评估模型，用于预测在不同环境污染物暴露情景下，食用受污染鱼类的人群和野生生物所面临未来的风险，而这些预测结果的可靠性在很大程度上取决于鱼类从食物中保留污染物效率的估计值的准确性⁴。

捕食者摄入的食物中污染物通过肠道壁转运的效率称为总营养级转移效率⁵。通过捕食者肠道壁转运的污染物中，有一部分可能最终会因净化作用和/或代谢转化而损失。捕食者对摄入食物中污染物的保留效率，包括因排泄和代谢转化所导致的任何损失，称为净营养级转移效率⁶。

有机污染物从猎物向鱼类的总营养级转移效率似乎随污染物的化学性质而变化，其中包括以辛醇-水分配系数 K_ow^3,7 衡量的亲脂性。根据 Thomann³ 建立的经验关系，当 log K_ow 值介于 5 至 6 之间时，总营养级转移效率相对较高。依据 Thomann³ 关系，当 log K_ow 从 6 增加到 10 时，总营养级转移效率以每单位 log K_ow 下降 50% 的速率呈指数下降。

然而，在大多数情况下，多氯联苯（PCB）同系物从猎物向鱼类的总摄取效率和净营养级传递效率似乎并不遵循Thomann³提出的关系。尽管PCB同系物从食物向湖泊白鲑（Coregonus clupeaformis）的营养级传递效率符合Thomann⁸提出的关系，但PCB同系物在大西洋鲑（Salmo salar）⁹、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）¹⁰、银鲑（Oncorhynchus kisutch）¹¹和北方狗鱼（Esox lucius）¹¹中的营养级传递效率与log K_ow的关系很弱，甚至毫无关联。

本研究的总体目标是介绍一种在实验室中估算多氯联苯（PCB）同系物从猎物向食鱼性鱼类净营养转移效率的实验技术。选择湖鳟（Salvelinus namaycush）作为本实验中的食鱼性鱼类，是因为湖鳟在实验室水箱中相对易于维持。选择圆腹鲱（Coregonus hoyi）作为喂饲湖鳟的饵料鱼，是因为在自然环境中湖鳟会捕食圆腹鲱¹²。此外，我们还确定了从本实验室实验估算出的湖鳟净营养转移效率是否符合Thomann³关系模型。我们还评估了湖鳟的活动程度是否对PCB同系物的净营养转移效率（γ）产生显著影响。据信，近年来劳伦提安五大湖中湖鳟的活动水平有所增加，这是因为食物网的变化导致湖鳟需分配更多能量用于寻找食物¹³。在一组水箱中，通过施加相对较高的水流速率迫使湖鳟进行运动；而在另一组水箱中，通过施加相对较低的水流速率使湖鳟保持相对静止状态。最后，本文讨论了实验过程中必须严格遵循的具体操作细节，以确保γ值估算的最高准确性，并使实验室结果能够适用于野外环境，同时探讨了基于本实验室技术的未来研究方向。净营养转移效率既可在实验室中估算，也可在野外进行测定，两种方法各有优缺点。γ值估算的准确性依赖于摄食量估算的准确性。在实验室中，若遵循适当的操作规程，可准确测定鱼类的摄食量；而在野外，鱼类的摄食量通常通过生物能量学模型进行估算。使用生物能量学模型推算摄食量可能在摄食量估算中引入较大不确定性。已有研究表明，对于湖鳟而言，生物能量学模型估算摄食量时无明显偏差^14,15，但对于湖白鲑，生物能量学模型估算的摄食量存在明显偏差^15,16。另一方面，由于实验室与野外环境中的摄食率存在差异，实验室估算的净营养转移效率可能不适用于野外情况¹⁷。来自实验室和野外的证据均表明，摄食率可影响γ值^14,17。

本研究中用于在实验室估算 γ 的方法适用于捕食性鱼类以猎物鱼类为食，且能够准确追踪捕食者摄食猎物鱼类数量的情况。为此，实验人员必须在将食物放入水族箱前称量所有食物；并且必须能够从水族箱中取出所有未食用的食物，然后称量剩余未食用的食物。此外，应配备足够的一套混合器和匀浆器，以实现对捕食鱼和猎物鱼样品充分的均质化处理。最后，用于测定多氯联苯（PCB）同系物浓度的气相色谱-质谱联用仪器必须具备检测和定量分析较低浓度下各单个 PCB 同系物的能力。

方案

1. 实验室实验

1. 获取实验期间用于喂养捕食性鱼类的猎物鱼。最好从野外捕获这些猎物鱼，随后将其冷冻并储存在约 -30 °C 的环境中。可考虑将商业捕捞作业作为猎物鱼的潜在来源。
2. 将捕食性鱼类引入实验所用的实验室水族箱中。在先前的研究中，每个 870-L 的水族箱最多引入了 15 条捕食性鱼类，每个 2,380-L 的水族箱最多引入了 30 条捕食性鱼类^16,18。
3. 使捕食性鱼类适应所选定的猎物鱼饮食。一旦完成适应，应在实验开始前继续维持该饮食 1–3 个月。
4. 从猎物鱼批次中随机选取 10 至 20 个复合样本作为存样。每个复合样本中猎物鱼的数量可在 3 至 100 条之间，具体取决于猎物鱼的大小。每个复合样本应使用双层袋封装，冷冻并储存在约 -30 °C 的环境中。
5. 通过牺牲每个水族箱中 30% 至 50% 的鱼类来启动实验。
   1. 为实施安乐死，将 8 g Finquel 与 45 L 水混合于一个大型塑料容器中，然后将鱼放入含有 Finquel 溶液的容器中。
   2. 鱼类安乐死后，将来自同一水族箱的所有牺牲个体装入一个袋子，再进行双层封装，并在约 -30 °C 下储存，直至处理时取出。
   3. 称量每个水族箱中剩余每条鱼的体重，并记录重量；称重过程可能需要使用麻醉剂。
   4. 为实施麻醉，将 4.6 g Finquel 与 45 L 水混合于一个大型塑料容器中，然后将鱼放入含有 Finquel 溶液的容器中。
   5. 等待数分钟，待麻醉剂生效后再进行称重。
6. 在实验的每一天，解冻适量的猎物鱼，并将其切割成每块约 1 至 5 g 的小块。称量将要放入每个水族箱中的猎物鱼量，然后将猎物鱼块投入各个水族箱，允许捕食性鱼类摄食约 1 小时。之后移除所有未食用的食物，使其在空气中干燥约 20 分钟，再称量每个水族箱中剩余的未食用食物。每天记录投入每个水族箱的食物量及未食用食物的量。
   注：在本代表性实验中，湖鳟每天被提供其在一个摄食周期内可完全摄食的食物量¹⁸。然而，也可对捕食性鱼类实施固定配额喂养^16,19。
7. 通过牺牲每个水族箱中所有剩余的捕食性鱼类来终止实验。为实施安乐死，将 8 g Finquel 与 45 L 水混合于一个大型塑料容器中，然后将鱼放入含有 Finquel 溶液的容器中。记录每条牺牲鱼类的体重。为获得可靠结果，实验必须持续至少 100 天，最好持续至少 130 天。将来自同一水族箱的所有鱼类放入一个袋子中，再进行双层封装，并在约 -30 °C 下储存，直至处理时取出。

2. 鱼类组织匀浆

1. 选择一组待解冻的捕食性鱼类和/或猎物鱼类复合样品，使其部分解冻。每个复合样品可能需要 0.5 至 1 小时才能完成均质化。
2. 使用合适尺寸的均质器，对每个复合样品进行均质处理。对每个复合样品，取 50 至 100 g 均质液样品，放入已清洗、经丙酮冲洗并标记的容器中。然后盖紧容器，并在约 -30 °C 下保存，直至处理时取出。
3. 每次样品处理之间，需清洗所有用于鱼类均质的设备，并依次用蒸馏水和甲醇进行适当冲洗。

3. 提取

1. 在200 ml烧杯中称取20.0 g解冻的均质鱼组织。
2. 加入约40 g硫酸钠，用刮刀充分混合。
3. 加入含有同系物30、61、161和166的替代加标溶液。加标浓度应使提取物中的最终浓度为20 ng/ml。
4. 在室温下干燥样品，每隔20分钟混合一次。
5. 使样品达到干燥沙子的质地，此时样品即可用于提取。
6. 安装索氏提取装置，使用含聚四氟乙烯沸石的500 ml圆底烧瓶、索氏提取管和冷凝管。
7. 将干燥的鱼样混合物加入带有粗孔烧结圆盘底的玻璃萃取套管或滤纸套管中。
8. 向用于样品的烧杯中加入150 ml 50%正己烷和50%二氯甲烷，边搅拌边用刮刀刮洗烧杯内壁。
9. 将溶剂转移到已连接圆底烧瓶的索氏提取管顶部，使其在索氏提取管和烧瓶之间循环。
10. 再次重复加入150 ml溶剂的操作。
11. 将连接有圆底烧瓶的索氏提取管置于加热装置上，并连接冷凝管。
12. 打开加热装置，使溶剂缓慢沸腾，然后至少提取16小时，确保冷凝管持续供应冷水。
13. 待溶剂冷却后，检查样品烧瓶中是否含有水分。对于含有水分的烧瓶，加入硫酸钠并轻轻旋转，直至水分被硫酸钠完全吸收。
14. 使用氮吹浓缩仪或Kaderna Danish（KD）玻璃装置配合热水浴浓缩样品。
15. 使样品蒸发至体积小于2 ml，然后用少量正己烷洗涤，将样品从玻璃器皿转移至5 ml容量瓶，定容至5 ml。
16. 转移至10 ml样品瓶中，并标注样品信息。

4. 提取物纯化

1. 通过将44克浓硫酸加入100克活化硅胶中，制备酸化硅胶。
2. 将10克酸化硅胶加入底部装有少量玻璃棉塞的小型层析柱中。
3. 用10毫升正己烷预淋洗层析柱后，向柱中加入1毫升样品提取液。
4. 用20毫升正己烷洗脱层析柱，并收集至20毫升锥形玻璃试管中。
5. 将玻璃试管置于氮吹浓缩仪（N-Vap）装置上，在氮气流下并浸入热水中。
6. 浓缩至体积小于1毫升，但不得蒸干。
7. 从氮吹浓缩仪上取下，用少量正己烷洗涤转移至1毫升容量瓶中。
8. 转移至已标记样品信息的1.8毫升自动进样瓶中。
9. 向瓶中加入4 μl内标溶液。样品现可进行分析。

5. 采用负化学电离法的气相色谱-质谱分析

1. 使用标准品校准仪器：标准品以混合物形式提供，包含若干组分良好的同类物。混合物1-5几乎涵盖了Aroclor 1016、1221、1232、1242、1248、1254和1260中所有存在的同类物。混合物1用作多浓度点校准混合液，通过配制至少五个浓度在2至100 ng/ml之间的校准点来确认系统线性。混合物2-5用于每种同类物的单点校准。
2. 将色谱-质谱系统设置为负化学电离模式，以氢气作为载气（1 ml/min），甲烷作为反应气。
3. 采用熔融石英毛细管柱（60 m × 0.25 mm 内径），涂覆DB-XLB固定相，膜厚为0.25 μm，用于分离。程序升温条件为：起始温度60 °C，以25 °C/min升至212 °C，再以1 °C/min升至260 °C，然后以4 °C/min升至280 °C，最后保持4 min。进样口和传输线温度均设为280 °C。使用不分流进样模式，进样量为1至2 μl。
4. 采用内标法分析所有标准品和样品，内标物为¹³C标记的十氯联苯。
5. 通过运行第二个源标准品以及Aroclor 1242和1260进行初始校准的验证，并将Aroclor同类物的预测值与该验证步骤中测得的实测值进行比较。
6. 完成初始校准程序后，方可进行所有样品的全面分析。每分析十个样品后，需运行一次校准检查，使用初始校准所用的任一校准混合物进行。

6. 净营养转移效率的计算

1. 使用以下公式计算每个水箱和每种 PCB 同系物组合的净营养级转移效率 γ：
   ，其中 [PCB_f] 表示实验结束时水箱中捕食性鱼类体内 PCB 同系物的平均浓度，W_f 表示实验结束时水箱中捕食性鱼类的平均体重，[PCB_i] 表示实验开始时水箱中捕食性鱼类体内 PCB 同系物的平均浓度，W_i 表示实验开始时水箱中捕食性鱼类的平均体重，而摄入的 PCB 同系物量是指在整个实验过程中，每条湖鳟鱼平均摄入的 PCB 同系物重量。
2. 通过将猎物鱼复合样品中 PCB 同系物的平均浓度乘以整个实验过程中每条捕食性鱼类所摄食猎物鱼的平均量（重量），来计算上述公式中的分母。

结果

在实验期间，湖鳟表现出显著的生长，初始湖鳟的平均体重范围为694至907克，而实验结束时的平均体重范围为853至1,566克（表1）。在为期135天的实验过程中，每条湖鳟平均摄食量介于641至2,649克之间。实验期间湖鳟体内多氯联苯（PCB）同系物的平均浓度有所上升：实验开始时，PCB同系物的平均浓度范围为0.01至7.14 ng/g（湿重基础），而实验结束时则上升至0.03至29.31 ng/g（表2）。对9月份捕获的bloater的10个混合样品取平均值，PCB同系物浓度范围为0.03至26.56 ng/g；对5月份捕获的bloater的10个混合样品取平均值，PCB同系物浓度范围为0.03至23.52 ng/g（表2）。有关实验中所用bloater的更多细节，请参见Madenjian et al.²¹。

基于全部八个水箱的平均值，γ 的平均估计值范围为 0.309 至 0.988（表 3）。这些平均估...

讨论

为了最准确地估算 γ 值，实验人员必须能够精确追踪实验过程中每个水箱中投放的食物量以及每个水箱中未食用的食物量。为此，实验人员必须能够从水箱中完全移除所有未食用的食物，并准确测定其重量。除了精确追踪捕食性鱼类实际摄食的食物量外，γ 值的准确估算还可能取决于实验持续时间是否足够。鉴于已有大量被广泛引用的实验室研究专门设计用于估算多氯联苯（PCBs）通过食物向鱼类传递的营养级转移效率，其实验时长在105至224天之间^22,23，因此建议实验持续时间至少为100天，更理想的情况是至少130天。此外，若在实验开始时用于PCB测定的捕食性鱼类样本数量不足，则可能在γ值的估算中引入偏差¹⁴。样本量越小，所获取的捕食性鱼类PCB浓度不能代表该水箱中所有捕食性鱼类平均PCB浓度的可能性就越高。理想情况下，应在实验开始时牺牲水箱中一半的鱼类用于PCB测定。

为了最大限度地提高实验室实验结果对野外情况的相关性和适用性，在实验室实验期间应向捕食性鱼类投喂在野外通常被其捕食的猎物鱼类。净营养转移效率可能取决于含有多氯联苯同系物的食物基质的性质^11,24...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
870 升玻璃钢水箱	Frigid Units	RT-430-1
2,380 升玻璃钢水箱	Frigid Units	RT-630-1
三卡因甲磺酸盐（Finquel）	Argent Chemical Laboratories, Inc.	C-FINQ-UE-100G	丁香酚也可用作麻醉剂。
Ashland 厨师刀	Chicago Cutlery	SKU 1106336
砧板	Williams-Sonoma	3863586
Hobart 立式搅拌机（40 夸脱）	Hobart Corporation
1.9 升食品加工机	Robot Coupe, Inc.	RSI 2Y1
聚乙烯袋（多种规格）	Arcan Inc.
I-Chem 广口瓶	I-Chem	220-0125
顶部加载式电子天平	Mettler Toledo	Mettler PM 6000
无水硫酸钠—颗粒状	EMD	SX0760E-3
玻璃提取套管（45 mm × 130 mm）	Wilmad-Lab Glass	LG-7070-114
聚四氟乙烯沸石	Chemware	919120
Rapid Vap 氮气样品浓缩仪	Labconco	7910000
N-Vap 氮气浓缩仪	Organomation	112
索氏提取玻璃装置（500 ml）	Wilmad-Lab Glass	LG-6900-104
正己烷	Burdick & Jackson	货号 211-4
二氯甲烷	Burdick & Jackson	货号 300-4
硅胶	BDH	货号 BDH9004-1KG
Labl Line 5000 多单元提取加热器	Lab Line Instruments
Agilent 5973 气相色谱/质谱仪（带化学电离源）	Agilent	5973N
内标溶液	Cambridge Isotope Laboratories	EC-1410-1.2
PCB 同系物校准标准品	Accustandard	C-CSQ-SET
DB-XLB 毛细管柱（60 m × 0.25 mm，0.25 微米）	Agilent/ J&W	122-1262