眼动追踪、皮质醇与睡眠-清醒巩固间隔：结合方法揭示睡眠与皮质醇对记忆的交互作用

摘要

我们介绍了一种用于发现睡眠与皮质醇在记忆巩固过程中相互作用的实验方案，特别是针对负性情绪唤醒图像的记忆。具体而言，该实验设计结合了眼动追踪、唾液皮质醇分析和行为记忆测试方法，这些方法可同时适用于健康个体和临床受试者。

摘要

尽管皮质醇水平升高和编码后不久的睡眠均有助于记忆巩固，但目前尚缺乏关于这两个因素如何相互作用以影响记忆巩固的文献。本文介绍了一种结合三种方法的研究方案，用于考察皮质醇与睡眠在记忆巩固中的交互作用：眼动追踪、唾液皮质醇分析以及在睡眠和清醒延迟条件下的行为记忆测试。为评估静息状态下的皮质醇水平，参与者在观看场景中的负性与中性物体前提供唾液样本。为测量外显注意力，在编码阶段对参与者的眼动进行追踪。为操控记忆巩固窗口期内是否发生睡眠，参与者要么在晚间进行场景编码，过夜睡眠后于次日早晨接受再认测试，要么在早晨编码并保持清醒，经历相似长度的记忆保持间隔。另设额外的对照组，在早晨或晚间经历20 min 的延迟后进行测试，以控制时间点效应。综合结果显示，仅在经历睡眠阶段后，编码时的静息皮质醇水平与后续记忆之间存在直接关联。通过眼动追踪进一步发现，对于负性刺激，皮质醇对后续记忆的促进作用可能源于皮质醇增强了参与者在编码阶段注视位置与其后续记忆内容之间的关联。总体而言，通过上述方法的结合，揭示了睡眠与皮质醇在记忆巩固过程中的交互效应。

引言

信息巩固的能力依赖于多种因素，其中睡眠和应激激素皮质醇是两个最具影响力的变量。先前的研究表明，通过外源性皮质醇给药或心理社会性应激所引起的皮质醇水平升高，通常与对情绪性刺激的记忆相对于中性刺激的选择性增强相关^1-7。睡眠也被证明对情绪记忆具有类似的选择性作用^8,9：当向受试者呈现由负性或中性物体置于中性背景上组成的场景时，睡眠会解离这些场景的记忆，选择性保留对负性物体的记忆，而对较不显著的场景成分（中性物体和中性背景）的记忆则随之减弱^10-12。

尽管这两类文献分别关注皮质醇和睡眠对情绪记忆的独立影响，但皮质醇与睡眠可能存在交互作用。有趣的是，由于研究皮质醇对记忆影响的实验均包含至少24小时的保持延迟期，这一时段必然涵盖一个晚上的睡眠，因此无法确定睡眠是否为皮质醇发挥促进记忆巩固作用所必需。同样，虽然已有研究显示睡眠更有利于情绪信息的记忆，但这种促进作用在编码阶段皮质醇水平较高的个体中可能更为显著。

因此，不仅需要了解睡眠和皮质醇各自如何独立支持记忆形成，还需要探究睡眠与皮质醇是否相互作用以共同促进记忆形成。毕竟，在正常衰老过程中，睡眠与皮质醇之间存在重要关联¹³，而在与记忆缺陷相关的心理病理状态中也存在类似关联^14,15。只有结合多种研究方法，才能理解睡眠与皮质醇之间的复杂相互作用及其对记忆巩固的影响。具体而言，将唾液皮质醇采集方法与睡眠-清醒对照设计相结合，可判断这两个变量在记忆巩固过程中是否存在交互效应。此外，通过使用眼动追踪技术记录编码阶段的注视行为，还有助于揭示该效应潜在的注意机制。

方案

1. 实验参与者的筛选与准备

1. 招募母语为英语、视力正常或矫正至正常的参与者。参与者应无神经系统、精神科及睡眠相关疾病，且不得服用任何影响中枢神经系统或睡眠结构的药物。确保在目标年龄范围内（例如，18至35岁）招募性别比例相近的参与者，需注意睡眠结构的变化可能早在35岁中期即已出现 ¹⁶。
2. 为最准确地评估睡眠对认知功能的影响，要求参与者在研究开始前保持规律的睡眠作息，并限制饮酒。要求参与者在研究开始前连续五晚每晚睡眠至少7 hr ，且每晚在凌晨2:00前上床休息。同时确保他们在研究开始前5 天内饮酒不超过2 杯，且在研究前一日及研究当日完全禁酒。
3. 在安排日程时，需确保参与者遵守与唾液皮质醇样本采集相关的指导原则（另见第4节）：在编码任务开始前2 hr 内，禁止进行体力活动、进食、饮水（仅允许饮用清水）、吸烟及刷牙。此外，在编码任务开始前至少15分钟内禁止饮水。
4. 安排参与者日程时，若无法实现完全随机分配，需确保参与者在年龄、清晨型-夜晚型问卷¹⁷（MEQ）、贝克抑郁量表¹⁸（BDI）、贝克焦虑量表¹⁹（BAI）得分以及回忆测试前一晚的睡眠时长方面无显著差异。

2. 条件与实验设计

1. 安排睡眠组参与者在晚间（19:00–22:00）进行编码阶段，12小时后在实验室经历完整夜间睡眠再进行提取阶段。安排清醒组参与者在上午（7:00–10:00）进行编码阶段，12小时后在经历完整白天清醒状态后进行提取阶段；确保他们在两个阶段之间不进行任何小睡。
2. 在实验设计中纳入早晨短延迟组和晚间短延迟组（即编码与提取之间仅有20分钟延迟，而睡眠组与清醒组的延迟为12小时），以排除睡眠组与清醒组之间观察到的任何差异可能源于测试时间（早晨 vs. 晚间）而非巩固期间是否发生睡眠的疑虑。这些短延迟条件也可视为“昼夜节律对照”条件。
   1. 安排早晨短延迟组的参与者在上午7:00–10:00之间编码刺激材料，安排晚间短延迟组的参与者在晚上7:00–10:00之间编码刺激材料。在编码后20分钟对参与者进行测试。

3. 刺激材料构建

1. 编码阶段的刺激材料构建。根据具体的实验问题选择刺激材料。本方案重点关注睡眠和皮质醇对情绪记忆的影响，因此编码阶段的视觉刺激由放置在中性背景上的负性物体或中性物体组成的场景构成。
   1. 确保所有情绪性刺激材料此前已被评定过效价和唤醒度^20,21，或者在研究结束后由参与者使用1至7分的李克特量表进行评定。负性物体应被评定为高唤醒度、低效价（例如，唤醒度：5–7分；效价 < 3分，7分制量表中高分分别表示高唤醒度和高积极性），而中性物体应被评定为低唤醒度、效价中性（例如，唤醒度 < 4分；效价：3–5分）。
   2. 随机化与实验设计。在各个实验组块之间（如适用）将负性与中性场景随机混合呈现。本研究采用2 个组块，每个组块持续约10 min ，组块之间允许参与者短暂休息，以缓解眼动仪使用带来的眼部疲劳。对于大多数年轻成年参与者，每10–15分钟安排一次休息可能有益；但如果测试其他人群（例如，儿童），则可能需要更频繁的休息。
2. 提取阶段的刺激材料构建。根据具体的实验问题选择刺激材料。本实验关注对物体的记忆，因此在提取阶段，分别向参与者呈现物体和背景（其中一半在编码阶段出现过，另一半为新刺激）。

4. 皮质醇检测步骤

1. 确保受试者已遵守1.3节中的所有要求：在编码前2 hr 内禁止进行体力活动、进食、饮水（除水以外的任何饮料）、吸烟以及刷牙，且在编码前至少15分钟内不得饮水。
2. 在编码开始前立即指导受试者用约1盎司的水漱口。提醒他们不要吞咽水分，以避免样本被稀释。
3. 让受试者在口腔拭子（见材料）上唾液采集2分钟。
4. 当受试者将口腔拭子放入拭子储存管后，应将拭子保存在约0 ºF的温度下，直至进行分析。

5. 眼动追踪/编码程序

1. 眼动追踪程序。此处使用的眼动追踪设备以500 Hz频率记录被试左眼的注视模式（见材料部分）。也可使用其他类型的眼动仪；为最准确地评估编码阶段的注意力，应遵循所用特定眼动仪的操作说明。
   1. 首先，请参与者坐下，将下巴置于下巴托上，前额紧贴额部固定杆。根据需要调整座椅高度和下巴托位置，确保屏幕中心与参与者的眼睛齐平。
   2. 确保眼动仪对参与者的注视位置追踪精度在1°以内，需让每位参与者完成一次校准任务。理想情况下，应根据设备系统采用9点或17点校准，但3点或5点校准也可能足够。
   3. 首先，要求参与者用眼睛跟随屏幕上的黑点移动至不同位置，并在黑点停止时注视该点。
   4. 眼动仪准确校准后，询问参与者是否准备开始任务，然后按下“record”按钮。
2. 编码过程。要求参与者执行一项可能促进深度编码的任务，例如通过鼠标点击进行判断 他们会接近还是远离该场景（例如，左=接近；右=后退）如果他们在现实生活中遇到它¹⁰。参见 图2 用于编码过程的可视化展示。
   1. 允许参与者进行一次短暂的自主休息（例如在每个区块之间留出约10至60秒的休息时间，以便受试者可以离开眼动仪，休息眼睛，为继续实验做好准备。请受试者在准备继续时予以示意。
3. 眼动数据分析。为测量参与者对场景中特定区域的注意力，可使用软件绘制兴趣区域²² （感兴趣区域）围绕这些部分。
   1. 绘制感兴趣区域（AOI）后，计算参与者注视该AOI的时间占整个场景观察时间的比例。或者，统计参与者在特定时间段内向该AOI发出的眼跳次数。

6. 学习-测试间隔时间

1. 确保睡眠条件与清醒条件下的编码与提取之间的延迟时长相等（例如，12 小时），以及第 2 阶段的延迟时长 对照条件（例如，20 分钟）。
   1. 对于睡眠参与者，确保12 hr 延迟包括大约 8 小时 睡眠。相反，需确保清醒组参与者在此期间不睡觉或小憩。
   2. 要求“早晨和傍晚短延迟”组的参与者在20分钟内留在实验室 最短延迟时间。告知他们在此期间可以自由活动，但不得小睡。

7. 识别程序

1. 延迟期结束后，对参与者进行记忆测试。
   1. 要求参与者通过按键盘上的相应按键（例如，“1” = 旧；“2” = 新），判断所呈现的刺激是“旧的”（曾出现在先前学习过的场景中），还是“新的”（未曾在先前学习过）。

结果

睡眠和皮质醇对情绪性和中性刺激记忆的影响

第一个被验证的假设是：在编码阶段升高的皮质醇水平会促进对情绪性刺激的记忆，相较于中性刺激更为显著，且该效应依赖于编码与提取之间是否发生睡眠。图4A展示了皮质醇对负性物体记忆的影响。在睡眠组（红色）中，皮质醇的标准化水平（x轴）与对负性物体的记忆（y轴）呈直接相关关系，而在清醒组（灰色）中则无此关系。组别（睡眠 vs. 清醒）与皮质醇的交互作用显著 [t(41) = 2.23, β = 2.92, p = 0.031]：若参与者在编码与提取之间有睡眠，则编码时较高的皮质醇水平可预测对负性物体的记忆 [t(24) = 2.31, β = 0.43, p = 0.031]；若保持清醒，则无此预测作用 [t(16) = 0.40, β = 0.10, p = 0.70；见图4A]。这些显著效应并非由性别、月经周期或关键的时间段（一天中的时间）所导致，这一点通过进一步分析早晨短延迟组和晚上短延迟组的数据得以确认。对于中性记忆（见图4B），观察到类似但较弱的模式。在睡眠组（蓝色）中，编码前的皮质醇水平（x轴）与对中性物体的记忆（y轴）存在边缘显著的相关性 [t(24) = 1.76, β = 0.34, p = .092]，而在清醒组（灰色）中则无此相关性 [t(16) = 0.98, β = 0.25, p = 0.34]。皮质醇与组别的交互作用呈边缘显著 [t(41) = 1.95, β = 2.55, p = 0.059]。

睡眠和皮质醇对编码与巩固阶段注意力相互作用的影响

有假设认为，皮质醇对情绪记忆的有益作用，部分可能源于皮质醇在编码阶段能够将信息“标记”为需要记住的重要内容，从而导致这些信息在睡眠期间得到后续优先处理。这一“情绪标记”概念表明，编码唤起性刺激会激活神经机制，进而引起被标记突触的长期可塑性变化^23-25. 编码期间升高的皮质醇水平可能有助于建立这些标记，从而在巩固过程中选择性地保存这些信息。为了探究这一可能性，对眼动追踪数据进行了分析，以确定较高的皮质醇水平是否会增加基于睡眠的巩固过程优先增强在编码阶段获得最多关注的信息记忆的可能性。首先，计算每位参与者在每个场景中注视各个物体的时间比例（即，计算其相对于总观察时间的比例。随后，根据每位参与者的识别数据，对场景进行事后分类，将其分为参与者后续记得物体的场景和后续遗忘物体的场景。最后，计算一个得分，以反映后续记住的物体与后续遗忘的物体在注视时间上的差异（见 图5）。例如，如果参与者观看随后被记住的物体的时间占场景出现在屏幕上的总时间的平均比例为75%，而观看随后被遗忘的物体的时间占场景出现在屏幕上的总时间的平均比例为65%，则他们的 注视时间差异 得分将为10%。

与先前分析睡眠和皮质醇对记忆影响的方法类似（图4），采用线性回归分析检验睡眠和皮质醇对编码阶段注视时间差异的影响，该差异以后续记忆为函数。对于负性物体（见图6A），在睡眠组（红色表示）中，静息皮质醇水平（横轴）边缘显著地预测了编码阶段的注视时间差异（纵轴）与后续记忆的关系 [t(23) = 1.869, β = 0.37, p = 0.075]，但在清醒组（灰色表示）中无此预测作用 [t(16) = 0.168, β = 0.043, p = 0.87]。皮质醇与分组之间的交互作用显著 [t(40) = -2.04, β = -2.99, p = 0.049]，并且关键的是，这一显著效应并非由性别、月经周期或一天中的时间所导致。对于中性物体（见图6B），在睡眠组（蓝色表示）和清醒组（灰色表示）中均未发现皮质醇的显著效应，且皮质醇与分组之间的交互作用也不显著。

图 1．本视频报告所述实验流程的可视化展示，按组别划分。 该图展示了四组受试者（睡眠组、清醒组、早晨短延迟组和傍晚短延迟组），以及每组在编码前皮质醇采样、编码和提取的时间安排。

图 2．编码阶段所用刺激材料的可视化展示。 该图显示，每个场景均由一个负性或中性物体置于中性背景前构成。同时显示，参与者每观看每个场景三秒钟，在此期间需判断若在现实生活中遇到该场景，他们会趋近还是避开。

图3．提取阶段所用刺激材料的视觉呈现。该图显示，在再认记忆测试中，参与者分别接受物体和背景的呈现。这些物体和背景要么是在编码阶段先前呈现过的（“旧”），要么是此前在实验情境中从未见过的（“新”）。

图4. 皮质醇对负性和中性物体记忆的影响。A展示了标准化皮质醇水平对负性物体记忆的影响。B展示了标准化皮质醇水平对中性物体记忆的影响。图例：睡眠组[红色菱形（负性），蓝色菱形（中性）]，清醒组[灰色方块]，睡眠组线性拟合[红色线（负性），蓝色线（中性）]，清醒组线性拟合[灰色线]。

图 5. 编码（左）和提取（右）过程的可视化示意图，与眼动分析中评估的因变量（编码期间注视时间的差异与后续记忆的关系）相关。 该图展示了眼动分析中因变量（编码期间注视时间的差异与后续记忆的关系）的计算方法。具体而言，该得分反映了参与者在编码期间注视那些之后被记住的物体（“命中”）所用时间的比例，减去在编码期间注视那些之后被遗忘的物体（“未命中”）所用时间的比例。

图6. 皮质醇对编码阶段注视时间差异的影响，作为后续对负性与中性物体记忆的函数。注视时间计算为参与者在观看整个场景期间注视场景中物体的时间占总观看时间的比例。随后计算一个分数，以反映后续被记住物体与未被记住物体之间注视时间的差异，并采用线性回归分析检验皮质醇和睡眠对该分数的影响。A 显示了负性物体的结果，而B 显示了中性物体的结果。图例：睡眠组 [红色菱形（负性），蓝色菱形（中性）]，清醒组 [灰色方块]，睡眠组线性拟合 [红色线（负性），蓝色线（中性）]，清醒组线性拟合 [灰色线]。

讨论

该实验设计首次证明，编码前皮质醇对记忆的有益作用仅在巩固期包含睡眠时才具有显著性。只有通过同时测量皮质醇水平并操控巩固间隔期是否包含睡眠，才能确定睡眠与皮质醇对记忆具有交互作用。这一设计对于确定先前研究中学习前皮质醇水平与负性刺激记忆增强之间的关联^1,5至关重要，这些研究中皮质醇的作用效应可能正是由于巩固间隔期内存在睡眠所致。

考虑到睡眠与清醒状态的设计需要在一天中的不同时间对两组参与者进行测试，这一发现显得更加引人注目。皮质醇遵循昼夜节律²⁶，清晨时皮质醇水平最高，傍晚时最低。因此，睡眠组参与者均在傍晚进行记忆编码，其皮质醇水平处于相对较低且较窄的范围内；而清醒组参与者在早晨进行记忆编码，其皮质醇水平更高且变异性更大。采用该设计表明，即使在相对较低的皮质醇水平下存在微小差异，也足以影响睡眠期间的记忆巩固。然而，皮质醇的昼夜变化也使实验设计变得复杂。未来的研究可考虑以不同方式控制皮质醇昼夜变化的影响。其中一种方法是采用午间小睡范式重复本研究的结果。因为在小睡与清醒条件下，皮质醇水平在统计学上是等效的，此类范式中的皮质醇昼夜波动将不再成为干扰因素。

尽管关于皮质醇如何与睡眠相互作用以增强情绪记忆巩固的许多问题仍有待解答，但目前的研究提供了证据，表明编码前皮质醇对经历至少24小时延迟后的情绪记忆具有促进作用 包括睡眠^1,5,27 可能是由于皮质醇与睡眠依赖的记忆巩固过程之间的相互作用所致。若实验设计中未设置一个条件包含睡眠而另一条件不包含睡眠的延迟间隔，则无法确定睡眠是否为观察到该效应所必需的因素。此外，通过评估参与者在编码阶段的眼动注视情况，研究发现皮质醇对情绪记忆的促进作用可能源于其调节了编码期间对情绪信息的注意程度与随后睡眠中该信息巩固之间的关系：当皮质醇水平升高时，参与者在编码阶段注视的内容与其后续记忆内容之间的关联更强。这种现象可能是因为编码阶段升高的皮质醇将这些情绪信息“标记”为需要记住的重要信息，从而促使睡眠在巩固期间选择性地增强这些显著信息。

这种独特的方法组合——睡眠与清醒状态的对比设计、静息状态下唾液皮质醇水平的测量、编码过程中眼动注视的评估，以及行为再认记忆测试的实施——不仅揭示了皮质醇与睡眠在记忆巩固过程中的交互作用，还确定了该效应背后潜在的注意机制。总体而言，本研究可作为如何整合通常独立使用的方法学以更深入理解影响认知的各变量之间复杂相互作用的范例。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Salimetrics 口腔拭子 (SOS)	Salimetrics	5001.02
拭子储存管 (SST)	Salimetrics	5001.05
眼动仪	SensoMotoric Instruments (SMI)	iView X Hi-Speed