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方法文章

通过等离激元纳米颗粒的光学追踪分析卤虫无节幼体（Artemia salina）的运动

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DOI：

10.3791/51502

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2014年7月15日

 ,  ,  , 
1Photonics and Optoelectronics Group, Ludwig-Maximilians-Universität

本文内容

摘要

我们利用等离子体纳米颗粒的光学追踪技术来探测和表征水生生物的运动频率。

摘要

我们展示了光镊如何作为一种灵敏的工具，用于分析小型水生生物运动所产生的流体振动。通过光镊捕获的单个金纳米颗粒作为传感器，用于量化水样中无节幼体（Artemia salina）的节律性运动。该方法通过监测被捕获纳米颗粒因无节幼体活动而产生的随时间变化的位移来实现。随后对纳米颗粒位置进行傅里叶分析，得到表征所观察物种运动特征的频率谱。本实验表明，该方法能够在无需直接观察幼体的情况下测量和表征小型水生幼虫的活动，并可获取幼虫相对于被捕获颗粒位置的信息。总体而言，该方法可为了解水生生态系统中某些物种的生命活力提供新视角，并有望拓展传统水样分析方法的应用范围。

引言

基于化学和生物指标的水质评估对于了解水生生态系统的状态和环境条件具有重要意义1-3。传统的化学水质分析方法主要依据感官性质或理化参数的测定。而生物指标则是指某些动物物种，其存在与否及其生存能力可反映其所处生态系统的环境状况以及污染物的影响。典型的生物指示物种包括桡足类（Copepods），这是一类小型水生甲壳动物，几乎存在于所有类型的水体环境中4,5。通过观察水样中这些物种的活动性和存活状态，即可获得有关生态系统整体状况的信息5。桡足类的幼虫称为无节幼体（Nauplii），它们依靠头部触角的节律性摆动在水中游动（每个幼虫头部区域有三对附肢）6。这些摆动的频率和强度直接反映了动物的年龄、健康状况及其所处的环境条件7-10。对这些样本的研究通常需要在显微镜下直接观察并计数无节幼体的触角摆动次数。由于其体型较小（约100–500 µm）11，这类测量往往需要逐个进行，或需将单个无节幼体固定在基质上。

本文展示了一种利用光镊捕获的金纳米粒子作为超灵敏探测器，观测水样中桡足类幼虫活动的新方法。光镊技术通常被许多研究团队用作精细的实验工具，以施加或测量分子间低至皮牛顿（piconewton）量级的力12-14。近年来，光镊的应用范围已扩展至通过监测被光阱限制的纳米和微米级粒子的运动，来观察液体介质中的声学振动和溶剂涨落15。浸没在液体中的粒子会受到布朗运动的影响。然而，在光阱内部，这种运动会被强的、由激光诱导的梯度力部分抑制。因此，通过调节激光功率，可以调控光阱的刚度以及粒子在激光束焦点内的定位。同时，通过监测粒子在光阱中随时间变化的运动，可以揭示光阱势能的特性，并分析分子与粒子之间的相互作用。该方法使得检测运动物体在其液体环境中产生的流体运动的频率、强度和方向成为可能。我们展示了如何将这一通用理念应用于获取单个无节幼体（Nauplius）运动的频率谱，而无需直接干扰样本。这种实验方法提出了一种高灵敏度观测水生生物运动行为的全新通用概念。对于生物指示物种的观测，该方法有望拓展当前水质分析的技术手段，并可用于获取有关水生生态系统健康状况与完整性的信息。

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方案

1. 实验设置

  1. 使用直立显微镜和数值孔径（NA）= 1.2 的暗场油浸聚光镜进行暗场照明。使用100倍放大、数值孔径（NA）= 1.0 的水浸物镜观察和捕获颗粒。使用10倍放大、数值孔径（NA）= 0.2 的干镜物镜追踪无节幼体（Nauplius）的运动。
  2. 采用1,064 nm连续波激光器的光镊系统，并将激光耦合至直立显微镜中。将光镊的激光功率设定为100 mW（在物镜后用功率计测量）。
  3. 使用CMOS高速相机或数码单反（DSLR）相机检测并成像光镊中金颗粒的运动以及无节幼体（Nauplius）的运动。
  4. 使用陷波滤光片防止激光进入相机。
  5. 使用功率计测量物镜后的激光功率。

2. 样品制备

  1. 用移液器将一滴水（180 µl）滴加到显微镜载玻片上，并将样品置于暗场显微镜下。
  2. 从一个小水箱中吸取一个无节幼体（Nauplius），加入水滴中。
  3. 使用10X空气物镜观察无节幼体在溶液中的运动，并记录视频流。
  4. 使用直径为60 nm的金纳米颗粒作为检测器，观察无节幼体产生的流体运动。因此，向水滴中加入5 µl高度稀释的颗粒溶液，使在100X水浸物镜下视野中大约可见一个颗粒。

3. 颗粒追踪实验

  1. 使用光镊捕获一个金纳米颗粒。为此，通过移动显微镜载物台，将1,064 nm的捕获激光靠近溶液中扩散的金纳米颗粒。光吸引力会将金纳米颗粒拉向激光束的焦点位置。被捕获的颗粒不再发生扩散，而是保持固定位置。使用DSLR相机以50 Hz的帧率对被捕获的纳米颗粒进行30秒的视频采集。
  2. 关闭光镊的激光，使金纳米颗粒从捕获位点释放。
  3. 使用颗粒追踪程序读取视频流中每一帧画面下光学捕获金颗粒的位置信息。对颗粒随时间变化的x-y位置进行快速傅里叶变换（FFT），可获得频率谱。
    注意：此处使用自行编写的“IGOR PRO”计算机程序代码，用于分析颗粒在x-y平面上随时间的位置变化及进行FFT分析。
  4. 作为自行编写IGOR代码的替代方案，可使用免费的“Video Spot Tracker”程序对视频中的颗粒进行追踪，并使用商业软件“Origin”对追踪数据执行傅里叶变换：
    1. 将视频文件拖动至已打开的“Video Spot Tracker”程序中。
    2. 用鼠标点击视频流第一帧图像中的颗粒，此时会出现一个圆形的兴趣区域。
    3. 在顶部命令窗口中选择“symmetric”（对称）和“optimize”（优化），以优化颗粒追踪效果。
    4. 在顶部命令窗口中点击“logging”（记录），并选择保存数据的文件夹。追踪数据将以数据表格形式保存。
    5. 在追踪程序左侧命令窗口中点击“play video”（播放视频），等待程序完成对视频所有帧的分析。
    6. 关闭程序，并使用“Origin”打开保存的数据表格。将数据列的值设置为“y1”和“y2”。
    7. 在“Origin”数据表格中，将每个视频帧的时间间隔设置为“x”。
    8. 选中x-position列，在顶部命令窗口中选择“Data Analysis”（数据分析）和“FFT”（快速傅里叶变换）进行变换。对y-position列重复此步骤。
    9. 绘制x方向和y方向计算得到的FFT信号幅值随频率变化的图谱。

4. 数值模拟

  1. 使用计算机程序“Mathematica”计算60 nm金颗粒的极化率α。
    1. 根据Kuwata et al.16 提出的公式(1)计算极化率：
      用于光学吸收分析的极化率公式，光子学研究中的公式图像。 (1)
    2. 在程序代码中定义以下三个参数：金颗粒的波长依赖性复介电函数、纳米颗粒半径以及周围介质的折射率。
  2. 根据Agayan et al.17 对聚焦高斯光束电场分布的描述，计算作用在60 nm金颗粒上的光力：
    高斯光束半径公式，\( E(r) = E_0 \sqrt{\frac{2}{\pi} \frac{\omega_0}{\omega(z)}} \)，公式。 (2)
    1. 使用Agayan et al.17 中的公式(3)-(6)分别计算作用在颗粒上的梯度力和散射力：
      光学梯度力公式，\(F_{grad_z}\)，公式，激光捕获，光子学，科学分析。 (3)
      光学力公式；示意图；描述光子学背景下梯度力的计算。 (4)
      光-物质相互作用研究中的Fscatt_z公式；散射力的数学表达式。 (5)
      光学中的散射力公式；电磁散射方程；高斯光束参数。 (6)
    2. 在程序代码中定义激光功率、物镜数值孔径以及纳米颗粒的复极化率等参数。
    3. 将梯度力与散射力相加，计算光学捕获中作用在金颗粒上的总光力。
  3. 通过同时按下“Control”和“Enter”运行模拟。

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结果

实验装置的示意图如图1A所示。为了在光学捕获中检测60 nm金颗粒的位移，必须采用暗场配置15。选择波长为1,064 nm的捕获激光，以确保对检测用金颗粒实现稳定的束缚12,14。显微镜中的分束器用于将捕获光束聚焦通过物镜，同时使用陷波滤光片防止捕获激光进入实验的检测装置。无节幼体在光学捕获的金纳米颗粒周围的水溶液中进行运动（图1B）。该生物体在液体介质中产生的流体振动会传播并作用于光学捕获的颗粒。

图2A 显示了被激光束捕获的单个60 nm金纳米颗粒的暗场图像。在暗场照明下呈现的绿色表明该颗粒在此波长范围内的散射特性。通过数码单反相机观察被捕获颗粒的颜色，可确保仅有单个等离激元纳米颗粒被聚焦激光捕获，因为若捕获第二个颗粒，由于等离激元耦合作用将导致颜色发生变化。图2B 展示了使颗粒被束缚在光阱中的总光力的计算分布。在无任何外部流体扰动的情况下，被捕获的等离激元纳米颗粒的位移呈现高斯分布，因其运动仅受布朗...

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讨论

暗场显微镜是一种强大的工具，可用于观察尺寸低于光学衍射极限的金纳米颗粒，因为金属纳米颗粒的散射截面超过其几何截面（参见图2A）18。在光镊系统中，该方法甚至能够区分激光束捕获的是单个还是多个金纳米颗粒，因为颗粒之间的等离激元耦合会导致等离激元共振频率发生红移15。因此，结合光镊配置的暗场显微镜提供了大量新颖且非常有用的实验可能性，但这种组合并非显而易见。为了实现稳定的光学捕获，需要高度聚焦的激光束，因为三维光学势阱的形成源于光场密度的梯度。通常，光镊系统使用高数值孔径（NA = 1.3–1.4）的物镜以实现激光的紧密聚焦19。然而， commercially available 暗场油浸聚光镜的最高数值孔径仅为1.2。这限制了可用于捕获颗粒的物镜的数值孔径范围，必须满足 NA < 1.2，因为更高数值孔径的物镜会带来问题：不仅收集散射光，还会收集直射光。在我们的实验装置中，通过使用数值孔径为1.0的水浸物镜和数值孔径为1.2的暗场聚光镜，仍可实现稳定的光学捕获。这是可行的，因为在显微镜前方对激光束进行了扩束，导致物镜后孔径被过度填...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢欧洲研究理事会（ERC）通过高级研究者资助项目HYMEM、德国研究基金会（DFG）通过纳米系统倡议慕尼黑（NIM）以及通过特别研究领域（SFB1032）项目A8提供的资金支持。我们感谢Alexander Ohlinger博士、Sol Carretero-Palacios博士和Spas Nedev给予的支持和富有成果的讨论。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
显微镜 Zeiss Axio Scope.A1Carl Zeiss490035-0012-000暗场照明
水镜 AchroplanCarl Zeiss440087100倍放大倍数，NA = 1.0
干镜 EpiplanCarl Zeiss44293410倍放大倍数，NA = 0.2
暗场油浸聚光镜Carl Zeiss445323NA = 1.2
Cobolt Rumba 连续波 1,064 nm 半导体泵浦固体激光器Cobolt1064-05-01-2000-5001,064 nm，连续波，λ = 1,064 nm，2 瓦，TEM00
光束扩束器Edmund Optics部件号 1064 2-8X 64414
高速相机 Dimax HDPCO. Germany
彩色相机 Canon EOS 500 D CanonFAQ-ID: 8201395700
陷波滤光片 StopLine 532/1064SemrockA11149-711265部件号 NF01-532U
水 
无节幼体 Artemia salina
金胶体BBInternational批次 13741 直径 60 nm
MQMie 版本 3.2 Michael Quinten 博士
Mathematica 8.0Wolfram
Comsol Multiphysics 4.0 COMSOL, Inc.

参考文献

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