山毛榉树皮病始于山毛榉绵粉蚧的取食活动，其取食会在树皮上形成真菌侵入点。 对绵粉蚧具有抗性的树木同样具有抗病性。 本文介绍了我们开发的用于筛选单株山毛榉对山毛榉绵粉蚧抗性的实验方案。
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摘要
摘要
山毛榉树皮病（BBD）会导致初期树木大量死亡，幸存下来的树木也往往严重衰弱并发生畸形。 该病害由入侵性山毛榉绵粉蚧Cryptococcus fagisuga的取食活动引发，其取食行为为Neonectria属真菌中的一种提供了侵染入口。 若无绵粉蚧的侵染，真菌感染几乎难以发生。在受BBD严重影响的林分中，利用绵粉蚧卵对健康树木进行人工接种，结果表明这些树木对病害复合体中的绵粉蚧部分具有抗性1。 本文介绍了一种基于Houston所建立的人工接种技术2而改进的实验方案，可用于在田间以及小型盆栽幼苗和嫁接植株中筛选抗绵粉蚧的个体。 鉴定出具有绵粉蚧抗性的树木，是通过树木改良计划和森林经营措施来管理BBD的重要环节。
引言
自19世纪90年代末，入侵性介壳虫——水青冈绵蚧（Cryptococcus fagisuga）被引入加拿大新斯科舍省以来，山毛榉树皮病（BBD）已对北美地区的美洲山毛榉造成了严重危害3。 该病害复合体始于山毛榉介壳虫将其取食口器刺入树皮，形成微小裂隙，从而为一种Neonectria属真菌（Neonectria ditissima或Neonectria faginata）的侵染提供入口。 随着真菌菌丝的生长，大片组织可能死亡，最终导致树木被完全环割。 病害造成的损伤使树木结构变弱，容易在强风中折断4。 在病害暴发的第一波中，树木死亡率据报高达50%5。 幸存的树木常因溃疡形成而严重变形，降低了其作为木材产品的经济价值。 这类树木倾向于从根部萌发新枝，形成“山毛榉密丛”，阻碍其他更具生态或经济价值的树种定植， 从而降低 林分的经济与生态价值6。 尽管山毛榉树皮病不太可能导致美洲山毛榉灭绝，但它改变了林分组成与健康状况，导致野生动物的食物和栖息地减少7,8。
在受山毛榉树皮病（BBD）影响多年的林分中，已有报道发现一些树木未表现出任何疾病症状。 人工接种试验表明，这些树木对介壳虫具有抗性2。 在没有介壳虫侵染的情况下，Neonectria 感染的机会极小，从而降低了真菌的影响。 迄今为止，从未有报道显示在无先前介壳虫侵染的情况下，Neonectria 感染导致美洲山毛榉大规模死亡，因此对山毛榉介壳虫的抗性即意味着对BBD的抗性。
近期关于山毛榉树枯萎病（BBD）管理的研究主要集中在鉴定、扩繁、培育和保留对山毛榉绵粉蚧具有抗性的美洲山毛榉树。 遗传学研究表明，对绵粉蚧的抗性具有可遗传性，通过精心选择和培育抗性植株，可在单一代际内实现显著的遗传改良9。 这一发现推动了美国各州及国家林业管理部门建立区域性抗性美洲山毛榉种子园的努力，旨在为生态恢复种植提供遗传多样性丰富的抗BBD种子来源10,11。研究还表明，通过移除感病树木并保留抗性树木，对林分遗传结构进行森林培育干预，可实现林分质量的提升9,12。
通过树木改良措施或实施森林培育方案来管理山毛榉树皮病（BBD），需要能够筛选并区分对山毛榉绵蚧具有抗性与感性的树木。 本文所述方法改编自 Dave Houston 首次提出的人工接种山毛榉绵蚧卵的方法1。 该方法可作为筛选工具，用于鉴定与抗性相关的数量性状位点（QTL），或在遗传学研究中区分具有抗性与感性的盆栽幼苗或嫁接无性系。 此外，也可用于田间成年树木的筛选，以鉴定可用于建立种子园或在林分中保留的抗性植株。 通过识别感性植株并予以清除，可降低病害影响。
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方案
1. 植物材料：成熟的田间树木、盆栽幼苗或盆栽嫁接植株
- 进行野外测试时，应选择成熟健康且无介壳虫侵害或病害迹象的美洲山毛榉树，以检测其可能具备的抗性。同时需识别出明显易感的树木，作为对照使用（图1）。
- 若对盆栽幼苗或嫁接材料进行测试，可按照 Koch & Carey（2004）所述方法采集并萌发山毛榉坚果，或按照 Carey et al.（2013）所述方法进行接穗嫁接。
- 将幼苗或嫁接植株种植于混合盆栽土中，每2.8立方英尺的基质中添加47 g微量元素、477 g缓释肥料（15N-3.9P-9.9K）、700 g粗珍珠岩和75 g硫酸铝。若生长季后期需要，可每周施用一次可溶性肥料（17N-1.3P-14.1K），氮浓度为200 ppm。
- 生长季期间，将植株置于遮阴棚内培养。秋季让植株在室外自然进入休眠状态，随后于11月至次年4月移入温度受控的贮存设施（约4 °C）中保存。
2. 榆树绵蚜卵的采集
- 在受BBD侵害的林分中，使用手持放大镜检查严重受害的树木（通常因其“粉刷过”的外观而易于识别，图1A），以确认是否存在虫卵，虫卵通常在7月中旬至8月中旬大量存在。
- 使用画笔轻轻将成虫分泌的白色蜡质团块、虫卵及其他碎屑刷入一个可密封的塑料一加仑收集袋中（图1B）。应从至少相距12米的三棵不同树木上进行采集。
- 如有需要，可将虫卵置于密封的收集袋中，在4 °C条件下保存最多两周。在袋内贴上一小块湿润的聚乙烯泡沫（2.5 cm见方），以防止虫卵干燥。
- 为将介壳虫卵（0.15 × 0.25 mm）与成虫（0.60 mm）及杂质分离，可使用一段短PVC管和一个接头支撑一块250微米尼龙筛网制成筛具（图2）。
- 将收集袋中的成虫、蜡质、虫卵和杂质混合物倒入筛具中，用小画笔轻轻刷动，促使虫卵穿过筛网落入下方的玻璃培养皿中。应避免使用塑料培养皿 ，因其静电较强，不利于虫卵移动。筛分前后虫卵的状态如图3所示。
- 纯化后的虫卵可在培养皿中于4 °C条件下保存至少一周。为防止虫卵干燥，可在皿盖内侧贴上湿润的泡沫块，并用Parafilm密封。
3. 卵活力检测
- 为评估卵的存活率，使用10 cc注射器在60 mm玻璃培养皿底部周围涂抹一圈薄薄的凡士林（图4A）。
- 将约100个卵转移至该环的中心，盖上培养皿盖，并用Parafilm密封。将密封的培养皿在室温下静置2周；若卵在开始检测前曾于4 °C储存，则静置3周。
- 孵化出的若虫会粘附在凡士林中，易于计数；空卵可通过颜色和光泽与未孵化的卵明显区分（图4B）。通过将若虫数量除以空卵数与剩余完整卵数之和，计算存活率。良好的存活率应在75%至90%之间。
4. 野外大龄成熟山毛榉树木的抗逆性筛选
- 进行定量检测时，使用解剖显微镜计数500粒卵，并用小刮铲将其轻轻均匀撒在预先润湿的、尺寸为10 × 15 × 1.3 cm的开孔聚乙烯泡沫矩形块中央。润湿泡沫的方法是将其浸水后用力挤出尽可能多的水分。进行定性检测时，可先计数500粒卵放入小玻璃瓶中，并在瓶壁标记“加样线”，用于后续大致量取约500粒卵的批次。
- 将带有卵的泡沫垫放置于测试树上，使卵面紧贴树皮。使用绳子、细绳、麻线或塑料包覆的金属丝固定泡沫垫。应选用塑料或金属材质而非天然纤维材料，因为后者更容易被野生动物啃食破坏。
- 用乙酸酯类硅胶粘合剂涂抹在预先裁剪好的23 × 30 cm透气性防水建筑膜的顶部和四周边缘，然后将其覆盖在泡沫测试垫上。将建筑膜边缘紧压于树干表面，形成防水密封。再用尼龙绳或塑料包覆的金属丝围绕树干和建筑膜缠绕固定，以确保粘合剂固化期间膜片保持原位（图5）。
- 每棵测试树至少放置两个测试垫，最好位于树干相对的两侧。在每个试验点，至少应在2 棵易感树（具有明显自然介壳虫侵染）上放置测试垫作为对照。在对照树上放置测试垫前，需使用硬毛刷清除树上自然存在的介壳虫或卵。
注意：带有卵的泡沫垫也可用于在树上饲养介壳虫卵，这在侵染水平较低的区域尤为有用。
5. 盆栽幼苗或嫁接苗的抗结垢筛选
- 进行测试时，选择盆栽树木，其直径至少为 1 cm（距土壤线以上 5 cm 处测量），且高度足以容纳至少 2 个独立的测试垫。必要时修剪细小的侧枝，以腾出空间放置测试垫。
- 使用解剖显微镜计数 150 个卵，并将其均匀撒在一块预先切割并润湿的 2.5 × 7.6 × 1.3 cm 开孔聚乙烯泡沫垫上。
- 将泡沫垫附着在幼苗上，使卵面紧贴树皮，使用塑料包被的金属丝固定。在泡沫垫上方稍高处，用一小块房屋防潮膜包裹幼苗，并用醋酸盐型硅胶密封（见图 6A）。
- 将已知易感的幼苗品系或嫁接材料作为对照。
6. 数据采集
注意：在将泡沫垫和卵放置于试验树上后约52至57周，可开始收集数据。必须在成虫开始产卵之后再进行数据采集，以确定其繁殖能力。在某些抗性树种上，偶尔可见少量成虫定殖，但未发生繁殖，这种情况并不罕见。
- 小心取下泡沫垫，使用手持放大镜或放大镜（10倍）仔细计数树皮上定殖的成虫蚧壳虫数量。
- 取下泡沫垫时，部分成虫及大多数卵块常会随泡沫垫从树体上被剥离（见图7）。使用解剖显微镜，计数仍附着在泡沫垫上的卵块和成虫数量。
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结果
图6 显示了一株抗性幼苗（C）和两株表现出不同程度感病性的感病幼苗（D、E）。在人工接种试验建立57周后，感病成年植株的典型症状如图5B所示。当将泡沫从树体上剥离时，介壳虫及其卵块常常会残留在泡沫上（如图7所示），因此必须同时从树体和泡沫垫上收集数据。
图8展示了在两个不同林分中人工接种的树木上每100粒卵成功发育为成虫的平均数量，这两个林分分别位于宾夕法尼亚州的阿勒格尼国家森林（ANF）和密歇根州的卢丁顿州立公园（LSP）。两个林分均受到栗疫病（BBD）侵染，且在每个林分中均鉴定出一组健康树木（LSP抗性组和ANF抗性组），并基于DNA分析确定为克隆群体（数据未显示）。在LSP还鉴定出一个BBD敏感型树木的克隆群体（LSP敏感组），而在ANF则使用了五株不同的敏感型树木（ANF敏感组）。克隆群体内部及之间，树木大小存在差异，胸径（DBH）范围为2...
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讨论
成功实施本实验的关键步骤包括对卵进行活力检测，以及在每个测试地点和盆栽材料中使用敏感性对照。 此外，每棵树或每株幼苗应使用多个测试垫。 我们发现，无论是在田间试验还是在对盆栽植物进行的更受控的测试中，测试垫失效都是常见的误差来源。 例如，在田间即使已采用房屋防潮膜覆盖测试垫以防止湿度过高，沿树干流下的水分仍可能偏向树的一侧，导致测试垫失效。
为了获得准确的结果，必须同时对垫片下方的树皮表面以及泡沫垫本身进行计数。 除了成虫和卵块外，介壳虫生活史中唯一的移动阶段——一型若虫，也可能被观察到。 这些可移动的若虫最终会将取食口针插入树皮，转变为二型若虫。 两种类型的若虫在大小和外观上均与小型椭圆形的卵非常相似，而较大的成虫则呈更接近球形的形态。 一型若虫与卵的区别在于其具有红色的眼睛且能够移动，但这种活动性使得准确计数变得非常困难。二型若虫很容易被误认为是卵，尤其是在野外使用手持放大镜或放大镜而非显微镜进行数据记录时。 基于这些原因，我们建...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者衷心感谢美国林务局森林健康保护评估监测与特殊技术发展项目提供的资助，这些资助支持了本文所述方案的开发、改进和应用，以鉴定对山毛榉绵粉蚧具有抗性或易感性的树木。 我们还感谢俄亥俄州克利夫兰的霍尔登植物园持续参与并支持我们的美洲山毛榉抗性筛选项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 尼龙网片，250 微米 |  小型部件 | CMN-0250-D | 网孔尺寸：250 微米方形，开孔面积百分比：34，丝径：180 微米，宽度：24”，长度：12”，包装数量：1 |
| Tyvek 建筑防潮层 | DuPont | D1349991 | 9 英尺 × 150 英尺卷装，可要求将其裁剪成两半。 |
| 聚乙烯泡沫 ½” 厚 | 哥伦布泡沫产品 | 2 英尺 x 50 英尺卷装 | |
| MetroMix 510 | Sun Gro Horticulture | 2.8 立方英尺 树皮、泥炭藓、蛭石、树皮灰、启动营养素（含石膏）、缓释氮及 白云质石灰岩 | |
| Osmocote Plus 15-9-12 | Everris | E903206 | 标准 3-4 个月发布 |
| Sight Savers 10X | Bausch & 隆布 | 813434 | 10倍放大率照亮科丁顿透镜 |
| 尼康 Mini Field 体视显微镜 | 尼康 | 7314 | 20倍放大 |
| Silicone II 透明 | GE | 159538 | 2.9 oz 透明窗口 & 门窗密封胶 |
参考文献
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