双光子在体内树突棘中的鼠标皮质用稀疏的头颅成像准备

Summary

活体动物的延时成像提供了有关完整大脑结构重组的宝贵信息。在这里，我们介绍了一种变薄的颅骨制备物，它允许通过双光子显微镜对活体小鼠皮层中荧光标记的突触结构进行经颅成像。

Abstract

在哺乳动物大脑皮层，神经元形态极为复杂的网络，并在突触交换信息。改变突触强度，以及突触的添加/删除，发生在经验依赖性方式，提供了神经元可塑性的结构基础。如在皮层中最兴奋性突触的突触后的部件，树突棘被认为是突触的一个良好指标。小鼠遗传学和荧光标记技术，单个神经元和突触的结构，以优势可以在标签完整的大脑。在这里，我们使用双光子激光扫描显微术跟随荧光标记的突触后树突棘随着时间在体内引入颅成像协议。这个协议利用一个稀疏颅骨制备，这使颅骨完好，并避免所引起的脑膜的曝光和皮质抗炎作用。因此，图像可立即苏收购后rgery被执行。的实验步骤可重复进行以上不同的时间间隔范围从小时到数年。此制剂中的应用也可以被扩展以调查不同的皮层区域，层，以及其它类型的细胞，生理和病理条件下。

Introduction

哺乳动物的大脑皮层参与了许多脑功能，从感官知觉和运动控制，以抽象的信息处理和认知。各种皮质的功能建立在不同的神经回路，不同类型的神经元沟通和个别突触交换信息这是由。突触的结构和功能都一致地被修改以响应经验和病状。在成熟的大脑，突触可塑性需要双方力量的变化和突触的添加/删除的形式，发挥着重要作用的形成和维持功能的神经电路。树突棘是大多数哺乳动物大脑兴奋性突触的突触后成分。不断更替和棘形态变化被认为是作为在突触连接^1-7修改一个很好的指标。

双光子激光扫描显微SCOPY透过厚厚的，不透明的准备和光毒性低，这使得它适合用在完整的大脑⁸实时成像提供深层渗透。与荧光标记的组合，双光子成像提供了一个强大的工具，不期而遇的活体脑并按照在具有高时空分辨率的单个突触的结构重组。各种方法已被用来制备老鼠实时成像^9-13。在这里，我们描述了一个稀疏的头颅制剂在体内双光子成像研究在小鼠大脑皮层突触后树突棘的结构可塑性。使用这种方法，我们最近的研究已经描绘的树突棘变化动态画面响应于运动技能学习用的转基因动物与荧光标记的神经元亚群的体内标记技术的快速发展提高可用性，此处描述的类似的程序也可应用于到investiga德其他细胞类型和皮层区域，并结合其它操作，以及在疾病模型中使用^16-23。

....

Protocol

审批需要从家里机构开展的手术和影像学前须获得。在这个手稿中描述的实验是按照从加州大学，圣克鲁斯机构动物护理和使用委员会的准则和法规的规定执行。

1，手术

1. 高压灭菌所有手术器械和手术前彻底用70％的酒精消毒的工作区。
2. 通过腹膜内（IP）注射的KX麻醉剂溶液（200毫克/千克氯胺酮和20毫克/公斤赛拉嗪）麻醉小鼠根据鼠标的体重注:KX剂量可以根据应变，年龄调整后，与健康状态小鼠。兽医咨询，以确定最佳剂量还建议。
3. 定期通过按鼠标的脚趾和检查自反响应监测麻醉状态进行脚趾捏测试。确保鼠标在开始手术前完全麻醉注意:在长时间的成像会议，定期检查鼠标的麻醉状态，如有必要，管理附加KX。
4. 放置在加热垫的鼠标来维持手术期间体温。
5. 使用刀片，露出头皮剃鼠标的头部。
6. 擦拭用酒精交替垫和优碘皮肤消毒剃区域。除去残留的头发剪下。
7. 轻轻涂抹眼膏，以润滑双眼，从而防止在实验过程中因缺水造成永久性损坏。
8. 使沿头皮正中直切口，然后将皮肤横向对颅骨的边缘。
9. 清除附着在头骨的结缔组织。

2，稀疏的头颅准备

1. 确定基于球面度的摄像区域。eotaxic坐标注:尽量避免大血管，从而阻挡光线穿透力....

Results

在YFP-H线的小鼠^25，黄色荧光蛋白表达在V层锥体神经元，其突出的顶端树突在皮质的表面层的一个子集。透过稀疏的头颅准备，荧光标记树突段可重复双光子显微镜下成像在不同成像时间间隔，从小时到几个月。这里，我们表明在1个月大的小鼠，其中个别棘以及丝状伪足可以沿着枝晶可清晰显示运动皮层8天以上相同的树突四时间摄像的一个例子。通常，图像堆栈的深度是从软脑膜表面约100-200微米。各种分析可以基于这些图像来进行。例如，该书脊形成，消除和周转可以通过从不同的会话比较图像进行量化。棘密度可以通过将刺的数目由dendrit的长度来计算集成电路分部。也可以分析脊柱活力和形态的变化。

图1稀疏的头颅准备双光子

Discussion

要获得成功变薄，颅准备，在这个协议的几个步骤是至关重​​要的。 1）颅骨的厚度。颅骨具有夹层结构，具有高密度的致密骨2层和低密度海绵骨的中间层。而高速微型钻孔机是适用于除去密质骨和松质骨的外层，显微叶片是理想的减薄致密骨的内层。由于在开发过程中的头骨的厚度增加和刚度，成年小鼠成像需要多个骨，以便获得质量良好的图像被删除。变薄的区域呈现出透明固体的外观，并提供良好的成像质量，当头骨的厚度约为20-30微米。颅骨厚度应定期在细化过程中进行检查的过度变薄使得在随后的重新映像会话细化处理困难。 2）减薄区域的大小。它建立了稳定的薄化颅骨配置，其中一圆锥状空腔的实现是重要的。减薄区的具有适当大小的体系结构可以防止造成损害的皮质，并有助于细化在随后的再成像会话。它建议，使减薄区域的底部区域（约直径200-300微米）比顶部开口​​（约0.5-1.0毫米的直径）小。 3）图像的稳定性。良好的固定准备有助于提高通过降低呼吸引起的运动伪影的图像质量。重要的是要保持干燥颅骨和缺乏结缔组织和骨骼碎片的头板连接到前囟是很重要的。额外的胶也可以应用来填充头板和颅骨之间留下的空隙。此外，针对一个地区远离大血管也最大限度地减少所造成的血泵的运动。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
氯胺酮	Bioniche Pharma	67457-034-10	与甲苯噻嗪混合用于麻醉
甲苯噻嗪	Lloyd 实验室	139-236	与氯胺酮混合用于麻醉
盐水	Hospira	0409-7983-09	0.9% NaCl 用于注射和成像
剃须刀片	显微镜科学	72000	双刃不锈钢剃须刀片
酒精垫	Fisher Scientific	06-669-62	无菌酒精制备垫
眼膏	Henry Schein	102-9470	凡士林眼药膏 无菌眼部润滑剂
高速微钻	Fine Science Tools	18000-17	高速微钻适用于减薄致密骨的外层，并针对小面积
微钻钢毛刺	Fine Science Tools	19007-14	直径 1.4 毫米
显微手术刀片	Surgistar	6961	显微手术刀片适用于减薄致密骨的内层和海绵状骨的中间层
氰基丙烯酸酯胶	Fisher Scientific	NC9062131	将头板固定在颅骨上
缝合	Havard Apparatus	510461	非吸收性、无菌丝缝合线，6-0单丝
解剖显微镜	奥林巴斯		SZ61
CCD相机	无限远
双光子显微镜	Prairie Technologies		Ultima IV
10X物镜	Olympus		NA 0.30，空气
60X物镜	Olympus		NA 1.1，红外通透，水浸
钛蓝宝石激光器	Spectra-Physics		麦泰 HP