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方法文章

双光子 体内 使用颅骨变薄制备法对小鼠皮层树突棘进行成像

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DOI：

10.3791/51520

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2014年5月12日

 , 
1Department of Molecular Cell and Developmental Biology, University of California, Santa Cruz

本文内容

摘要

在活体动物中进行延时成像可为完整大脑内的结构重组提供重要信息。本文介绍一种颅骨减薄制备方法，该方法可通过双光子显微镜对活体小鼠大脑皮层中荧光标记的突触结构进行经颅成像。

摘要

在哺乳动物的大脑皮层中，神经元形成极为复杂的网络，并在突触处交换信息。突触强度的改变以及突触的增加或消失均以依赖经验的方式发生，从而为神经元可塑性提供了结构基础。树突棘作为皮层中最主要的兴奋性突触的突触后成分，被认为是突触的良好替代指标。借助小鼠遗传学和荧光标记技术，可以在完整大脑中对单个神经元及其突触结构进行标记。本文介绍一种利用双光子激光扫描显微镜对活体（in vivo）中荧光标记的突触后树突棘进行长期动态观察的经颅成像方案。该方案采用颅骨减薄制备方法，保留颅骨完整，避免因脑膜和皮层暴露所引发的炎症反应。因此，手术完成后可立即进行成像。该实验操作可在数小时至数年的不同时间间隔内重复进行。该制备方法的应用还可扩展至在生理和病理条件下研究不同的皮层区域、皮层层次以及其他细胞类型。

引言

哺乳动物的大脑皮层参与多种脑功能，从感觉感知和运动控制到抽象信息处理和认知。各种皮层功能建立在不同的神经环路基础之上，这些神经环路由多种类型的神经元通过单个突触进行通信和信息交换而构成。突触的结构和功能会随着经验与病理状态持续发生改变。在成熟的大脑中，突触可塑性表现为突触强度的变化以及突触的增加或消除，在功能性神经环路的形成与维持中发挥重要作用。树突棘是哺乳动物大脑中大多数兴奋性突触的突触后成分。树突棘的持续更替和形态变化被认为可作为突触连接改变的良好指标1-7。

双光子激光扫描显微镜具有对厚且不透明样品的深层穿透能力以及低光毒性，因此适用于完整脑组织的活体成像8结合荧光标记，双光子成像技术为观察活体脑组织提供了强有力的工具，能够以高空间和时间分辨率追踪单个突触水平的结构重组。目前已采用多种方法制备小鼠以进行活体成像。9-13. 这里，我们描述了一种颅骨变薄制备方法 体内 双光子成像技术用于研究小鼠皮层中突触后树突棘的结构可塑性。利用该方法，我们近期的研究描绘了树突棘在运动技能学习过程中动态变化的图景。随着荧光标记特定神经元亚群的转基因动物日益可得，以及双光子成像技术的快速发展， 体内 标记技术，此处描述的类似方法也可用于研究其他细胞类型和皮层区域，结合其他干预手段，以及应用于疾病模型中16-23.

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方案

在开始手术和成像研究之前，必须获得所属机构的批准。本论文中描述的实验均按照加州大学圣克鲁兹分校机构动物照护与使用委员会的指南和规定进行。

1. 手术

  1. 手术前，将所有外科器械进行高压灭菌，并用70%酒精彻底消毒操作区域。
  2. 根据小鼠体重，通过腹腔（IP）注射KX麻醉剂溶液（200 mg/kg氯胺酮和20 mg/kg赛拉嗪）对小鼠进行麻醉。 注意：可根据小鼠品系、年龄和健康状况调整KX剂量，建议咨询兽医以确定最佳剂量。
  3. 通过按压小鼠脚趾并观察是否存在反射性反应，定期进行脚趾夹捏测试，以监测麻醉状态。确保小鼠在手术开始前已完全麻醉。注意： 在长时间成像过程中，应定期检查小鼠的麻醉状态，必要时追加KX麻醉剂。
  4. 将小鼠置于加热垫上，以维持其在手术期间的体温。
  5. 使用刀片剃除小鼠头部毛发，暴露头皮。
  6. 用酒精棉片和碘伏交替擦拭已剃毛区域以进行消毒。 清除残留的毛发碎屑。
  7. 轻轻涂抹眼膏以润滑双眼，防止实验过程中因脱水造成永久性损伤。
  8. 沿头皮中线做一直线切口，并将皮肤向颅骨两侧推开。
  9. 清除附着在颅骨上的结缔组织。

2. 薄颅骨制备

  1. 根据立体定位坐标确定成像区域。注意： 应尽量避开较大的血管，因为这些血管会阻碍光的穿透并导致成像结构模糊。当颅骨被无菌生理盐水润湿时，血管结构最易观察。
  2. 使用高速微型 钻头对颅骨进行环形区域减薄（直径 0.5–1.0 mm）。操作时应使钻头平行于颅骨表面移动，而不是将其抵住颅骨并向下按压。持续钻削，直至外层致密骨层和中间疏松骨层均被去除。注意： 为防止因过热造成损伤，应避免钻头与颅骨长时间接触。
  3. 在钻薄区域的中心，使用显微外科刀片继续减薄内层致密骨层。将显微外科刀片以约 45° 角度持握，轻轻刮除颅骨，避免向下施压，直至获得一个均匀减薄的小区域（直径 200–300 μm），厚度约为 20–30 μm。由于颅骨具有自发荧光特性，可在双光子显微镜下扫描颅骨上下表面之间的距离，以测量其厚度。注意：尽管厚度小于 20 μm 的颅骨可提供良好的成像质量，但不建议达到此程度，因为它会使后续重复成像时的再次减薄操作变得困难。为避免过度减薄，手术过程中需定期检查颅骨厚度（见 讨论）。

3. 固定化

  1. 小心清除骨碎片。
  2. 在已高压灭菌的无菌头板中心开口的每一边缘处，滴加少量氰基丙烯酸酯胶水 （见图1）。将头板紧贴颅骨，使变薄区域位于开口中央。注意： 若胶水意外污染变薄区域，需用显微外科刀片小心清除。
  3. 轻柔地将颅骨两侧的皮肤拉向头板中心开口的边缘。
  4. 等待约10分钟，直至头板牢固粘附于颅骨。
  5. 将头板置于固定板的两个侧块上，然后拧紧头板边缘上的螺钉，以将小鼠固定在固定板上（见图1）。注意： 在拧紧螺钉前，务必确保头板与侧块之间无皮肤或胡须夹入。良好的固定状态应表现为：当轻拍动物背部时，在解剖显微镜下观察不到颅骨有任何可察觉的移动。
  6. 用生理盐水冲洗暴露的颅骨，以去除未聚合的胶水。注意： 彻底清除残留胶水至关重要，因为未聚合的胶水会模糊成像并损坏显微镜物镜。

4. 成像

  1. 拍摄暴露颅骨血管结构的照片，其中变薄区域作为地图1（Map 1），用于在后续成像过程中重新定位已成像区域（见图2）。
  2. 将小鼠置于成像显微镜下，使用10倍空气物镜在荧光透射照明下找到变薄区域，并将最薄区域移至视野中心。
  3. 在颅骨表面滴加一滴生理盐水，切换至已用无菌水冲洗过的60倍物镜。选择树突上单个树突棘清晰可见的区域，并通过比较荧光视野与血管照片中的血管结构，在地图1（Map 1）上识别并标记对应区域。
  4. 根据所使用的荧光蛋白调整双光子激光波长。例如，YFP使用920 nm；GFP使用890 nm；DsRed和tdTomato使用1,000 nm24。
  5. 使用60倍物镜，沿z轴以2 μm步长采集图像堆栈。该图像堆栈覆盖约200 μm x 200 μm的区域（512 x 512像素），作为地图2（Map 2），用于后续成像过程中的重新定位（见图2）。
  6. 在地图2（Map 2）范围内，使用3倍数字放大采集九组图像堆栈。每组图像堆栈覆盖约70 μm x 70 μm的区域（512 x 512像素），z轴步长为0.7 μm。注意： 激光强度在样品处测得应低于40 mW ，以尽量减少光毒性。

5. 恢复

  1. 成像后，轻柔地将头板从颅骨上分离。
  2. 彻底清洁颅骨和皮肤，以去除所有残留的胶水。 注意： 皮肤上残留的任何胶水都会引起刺激并延缓皮肤愈合，而颅骨上残留的胶水则会导致颅骨侵蚀以及新生骨层中的血管生成，从而增加后续重新定位和再次成像的难度。
  3. 用生理盐水将颅骨和皮肤冲洗数次。
  4. 用无菌外科缝线缝合头皮。
  5. 将动物置于单独笼子中的加热垫上。皮下注射布托啡诺镇痛剂（0.1 mg/kg）以缓解术后疼痛。待动物完全恢复后，将其放回原饲养笼。 密切观察动物（至少每天检查一次），直至伤口愈合且缝线被拆除。如有需要，可给予后续的布托啡诺镇痛剂注射。

6. 重新成像

  1. 重复步骤 1.1–1.8。
  2. 重复步骤 3.1–3.6。
  3. 通过将血管模式与图 1 进行比对，树突分支模式与图 2 进行比对，定位先前成像的区域。
  4. 若在 1 周内重新成像，重复步骤 2.3，使用显微外科刀去除减薄区域表面新生成的薄层骨组织；若在超过 1 周后重新成像，则需同时重复步骤 2.2 和 2.3。注意： 新生骨层的结构较原始密质骨层更为疏松，会导致图像质量下降。因此，为了获得与之前相同质量的图像，需将颅骨减薄程度略大于前次成像时的水平。
  5. 调整位置和方向，使在双光子显微镜下获取的图像堆栈与先前采集的图像堆栈相匹配。
  6. 按照步骤 4.6 的方法采集图像。
  7. 成像完成后，重复步骤 5.1–5.5。

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结果

在 YFP-H 品系小鼠25中，黄色荧光蛋白在部分第五层锥体神经元中表达，这些神经元的顶树突投射至大脑皮层的浅层区域。通过磨薄颅骨制备方法，可在双光子显微镜下对荧光标记的树突节段进行重复成像，成像时间间隔可从数小时至数月不等。本文展示了一例对1月龄小鼠运动皮层中同一树突进行为期8天、共四次成像的实例，其中树突上的单个树突棘及丝状伪足均能被清晰观察。通常，图像堆栈的成像深度约为软脑膜表面下100–200 μm。基于这些图像可开展多种分析。例如，通过比较不同成像时段的图像，可定量分析树突棘的形成、消除及更替率；树突棘密度可通过将树突棘数量除以树突节段长度来计算；此外，还可分析树突棘的运动性及形态变化。

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讨论

要获得成功的去薄颅骨制备，本方案中的几个步骤至关重要。1）颅骨的厚度。颅骨具有三明治样结构，由两层高密度的密质骨和中间一层低密度的松质骨组成。高速微型钻适用于去除外层密质骨和中间松质骨，而显微外科刀片则非常适合进一步减薄内层密质骨。随着发育过程中颅骨厚度和硬度的增加，对成年小鼠进行成像时需要去除更多的骨组织，才能获得高质量的图像。当颅骨厚度约为20–30 μm时，去薄区域呈现透明固态外观，并可提供良好的成像质量。在去薄过程中应定期检查颅骨厚度，因为过度去薄会使后续重新成像操作变得困难。2）去薄区域的尺寸。建立一个稳定的去薄颅骨构型非常重要，应形成一个类似锥形的空腔。适当尺寸的去薄区域结构可避免对皮层造成损伤，并有助于后续重新成像时的进一步去薄操作。建议使去薄区域底部面积（直径约200–300 μm）小于顶部开口（直径约0.5–1.0 mm）。3）图像的稳定性。良好的固定有助于减少由呼吸引起的运动伪影，从而提高图像质量。在将头板固定到颅骨之前，必须保持颅骨表面干燥，并清除结缔组织和骨碎片。此外，还可额外使用胶水填充头板与颅骨之间的剩余缝隙。同时，选择远离大血管的区域作为成像靶点，也可最大限度地减少血液搏动引起的运动干扰。 

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢 James Perna 提供的插图。本工作获得了美国国家心理健康研究所向 Y.Z. 提供的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯胺酮Bioniche Pharma67457-034-10与赛拉嗪混合用于麻醉
赛拉嗪Lloyd Laboratories139-236与氯胺酮混合用于麻醉
生理盐水Hospira0409-7983-09注射和成像用0.9% NaCl
剃须刀片Electron Microscopy Sciences72000双刃不锈钢剃须刀片
酒精棉片Fisher Scientific06-669-62无菌酒精消毒棉片
眼药膏Henry Schein102-9470无菌石蜡眼用软膏，用于眼部润滑
高速微型钻机Fine Science Tools18000-17高速微型钻机适用于磨薄密质骨外层并精确定位小区域
微型钻机钢制磨头Fine Science Tools19007-14直径1.4 mm
显微外科刀片Surgistar6961显微外科刀片适用于磨薄密质骨内层及松质骨中层
氰基丙烯酸酯胶水Fisher ScientificNC9062131将头固定板粘附于颅骨
缝合线Havard Apparatus510461非吸收性无菌丝线，6-0单股
解剖显微镜OlympusSZ61
CCD相机Infinity
双光子显微镜Prairie TechnologiesUltima IV
10倍物镜Olympus数值孔径0.30，空气介质
60倍物镜Olympus数值孔径1.1，红外透射，水浸物镜
钛宝石激光器Spectra-PhysicsMai Tai HP

参考文献

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