利用整合行为检测站（INBEST）对小鼠疾病模型进行行为表型分析

摘要

在小鼠的笼内环境中进行长期且全面的监测，有助于深入理解脑部疾病小鼠模型中的异常行为。本文将集成化行为检测站（INBEST）描述为现代行为分析的关键组成部分。

摘要

由于基因工程的快速发展，小型啮齿类动物已成为生物医学研究多个领域的首选实验对象。在慢性中枢神经系统（CNS）疾病的研究中，对小鼠模型在行为学层面具有高度有效性的需求日益增加。然而，多种致病机制和复杂的功能缺陷常常给慢性病程小鼠行为的可靠测量与解释带来挑战。因此，需要通过一系列测试，在多个时间点评估外周病理变化及行为学特征。视频追踪、行为谱分析以及生理指标的远程采集是新兴技术，可在类似居家环境的条件下实现全面、准确且无偏倚的行为分析。本报告介绍了一种优化的表型分析方案，包括一种自制的监测装置（集成化行为站，INBEST），该装置专注于在相对低应激的环境中对基本功能输出进行长期测量，例如自发活动、食物/饮水摄入以及动机行为。INBEST在技术与概念设计上的改进，有望进一步提升行为学研究的可重复性与标准化水平。

引言

过去几十年中，基因工程的快速发展导致人类疾病动物模型以前所未有的速度大量涌现。小鼠由于多种原因已成为生物医学研究中的主要实验对象。从实践角度来看，小鼠繁殖率高、成本相对较低且易于饲养。从概念角度来看，小鼠在遗传上与人类相近，易于进行遗传修饰，并具有高度发达的内分泌系统、免疫系统和神经系统。除了在基因和细胞水平上的病变外，当前对脑部疾病的研究还需要展示可重复的功能缺陷，以突出新小鼠模型的表观效度、构念效度或预测效度¹。

恒温哺乳动物的急性感染常引发发热反应，这种反应与病态行为共同构成了一种主要的生存机制²。处于急性病状态的动物在食物/饮水摄入量以及反映情绪反应性、探索行为和学习/记忆能力的任务表现上均会出现显著改变。这些变化在很大程度上导致了社会/性活动能力下降，并有助于保存能量以支持防御性免疫反应。然而，当急性状态转为慢性（如许多免疫学、内分泌学和神经系统疾病中所见）时，由于包括大脑在内的多个器官发生结构性损伤，行为表现可能进一步恶化³。

人类和动物的神经退行性疾病通常伴随一系列神经学和行为学缺陷。因此，对慢性病动物进行行为学研究的一个关键目的是区分中枢效应与外周症状引起的缺陷。然而，标准行为学任务的持续时间相对较短，限制了对基本功能指标（如嗅觉、静息、睡眠、摄食/饮水或癫痫发作）相关信息的收集。纳入这些指标可改善行为学特征分析，并有助于更准确地解读动物在需要活动的任务中的表现。

疾病小鼠行为表型分析的优化

对患病小鼠行为特征评估的不足，促使人们需要利用高速处理的计算机对单只饲养的小鼠进行持续监测。尽管可以设计多种不同的行为测试组合^{4, 5}，但以下列出的程序已被成功用于建立神经精神性狼疮的动物模型⁶。该测试组合已被反复应用于疾病的亚慢性与慢性模型（图1），例如轻度认知障碍和阿尔茨海默病⁷。在一系列神经学测试^8-10的基础上，可采用一种定制设备，该设备通过在类似丰富化家居笼环境内持续监测多种行为输出，以满足上述需求。这种基于动物行为学的方法对自发探索活动和动机行为进行评估，有助于更全面地理解其他实验范式中的表现缺陷，例如反映学习与记忆能力的测试。

图 1. 本实验室纵向行为表型分析的示意图。行为测试组合的设计遵循从低应激性任务向高应激性任务逐步过渡的原则，并在不同时间点重复进行，以评估持续性因素（如疾病进展、药物治疗或免疫反应）的影响。INBEST 及各项单独测试均在黑暗期进行，通常分别持续 10 小时和 2 小时。缩略语：R – 反射测试；BW – 梁行走测试；RR – 转棒测试；OT – 嗅觉测试；SP – 蔗糖偏好测试；SD – 下台阶测试；NO – 新物体测试；OF – 开放场测试；SAB – 自发交替行为测试；FS – 强迫游泳测试；MWM – 莫里斯水迷宫测试。* – 在实验过程中后续试验中需要更改的测试要素（例如，位置、情境、颜色、形状）。

在类似家庭笼具环境中的行为连续录像与分析最早于2007年被报道 ¹¹一年后，在“行为测量”会议上展示了一种更为复杂的自动化设备，该设备整合了用于自身免疫小鼠研究中的行为学测试方法。 ¹²综合行为检测站（INBEST， 图2A）是一种模块化系统，包含一个遮蔽舱、计算机控制的光刺激装置、两个光电管控制的舔水计（一个用于水，另一个用于待测溶液）、一个自动喂食器、一个计算机化的跑轮，以及一个数字化的攀爬网。通过定制软件分析特定行为的潜伏期、频率和持续时间。运动和探索活动（例如，对新物体或陌生同种个体的反应）可通过视频追踪软件进行评估（材料/设备清单），而睡眠期间以及较少发生的行为模式（例如自伤行为和癫痫发作）可通过视频追踪软件或专用的事件记录软件包进行人工评分。共使用八套完整的INBEST/视频系统，从而可同时监测4只实验动物和4只对照动物。图2B).

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图 2. 集成化行为站。 （A）设计 INBEST 箱所用硬件与软件的示意图（长 = 39 × 宽 = 53 × 高 = 50 cm）。（B）八个完整的 INBEST 箱可同时对四只实验小鼠和四只对照小鼠进行笼内监测。

因变量包括摄食/饮水量、对可口刺激的反应性、自发性行走活动、攀爬、自主跑轮、焦虑相关行为（例如，对新物体的探索）、理毛、惊厥和睡眠的测量。此外，可呈现视觉刺激以用于条件反射和学习范式。与标准行为学测试相比，INBEST 的优势在于消除了由运输应激引起的混杂效应，并能够连续、自动地采集反映夜间活动、探索行为、焦虑相关行为及类抑郁行为的指标。通过将高灵敏度硬件组件与视频追踪软件包相结合，可获得大量信息，从而更准确地评估多种动物模型中慢性疾病进展与行为之间的关系。INBEST 可用于研究其他慢性中枢神经系统疾病（例如，自闭症、重度抑郁症、精神分裂症），也可应用于聚焦神经发育、全身性或肿瘤性疾病对行为的影响以及长期药物治疗的纵向研究。

方案

所有实验程序均经麦克马斯特大学动物护理委员会批准，并依照加拿大动物护理委员会制定的指南进行。

1. 一般步骤

1. 使小鼠适应已有的12小时光照/12小时黑暗循环，持续1-2周（例如， 8:00–20:00）。所有操作和检测均应在暗周期内进行，并保持室温、湿度和光照强度相对恒定。
2. 对所有小鼠进行标记或尾部纹身，以便在较长时间内进行数字编号识别，并在5-7天内每天抓取处理1-2小时。
3. 每日重复测量直肠温度、体重以及食物/水摄入量，以检测可能由衰老或疾病进展引起的发热和/或营养不良。标准排除标准包括因食物/水摄入减少导致的低体重、蜷缩姿势伴毛发竖起、脑积水、眼周出现卟啉分泌物。 等等。
4. 为了识别可能影响整体活动能力和表现的神经功能缺损，应进行标准的感觉运动功能测试，例如后肢握紧反射 ¹³视觉定位反射 ¹⁴，趋地性实验 ¹⁵，篮式试验 ¹⁶，平衡木行走测试 ^17-19，旋转杆 ²⁰，以及嗅觉测试 ²¹.
   注意：这些结果还可用于与 INBEST 测量指标的相关性分析，以及更审慎地选择其他操作流程（例如，若小鼠失明则采用莫里斯水迷宫实验，若小鼠嗅觉减退或缺失则采用新物体识别实验），降低组内变异性的措施，以及排除出生缺陷或感染的小鼠。
5. 以交替方式进行实验组和对照组小鼠测试时，使用消毒剂清洁塑料和玻璃器具，以去除尿液痕迹。

2. 集成化行为检测站（INBEST）操作流程

1. 家庭笼具装置
   1. 用20 mg的小鼠饲料颗粒填充食物分配器。
   2. 用自来水将瓶子装满。
      注意：可将第二个瓶子装入感兴趣的溶液，例如蔗糖或糖精溶液，用于偏好测试。
   3. 称量瓶重以计算实验结束时的消耗体积。
   4. 将瓶嘴插入舔舐监测仪中。确保喷嘴不会遮挡红外传感器；如果发生遮挡，应缩短喷嘴长度。
   5. 在选定的笼舍角落放置庇护所。
2. 计算机设置
   注意：步骤 2.2–2.11 中提供的软件命令适用于本实验室所使用的 Ethovision XT 8.5 软件包（见材料与设备列表）及测试条件。
   1. 使用漫射的弱光照亮房间，光线需足以支持视频追踪，但不会在箱子、地面或墙壁上产生反射。
   2. 打开一个默认的视频追踪项目，并通过输入相关详细信息来设置实验参数（例如研究日期/时间、分组信息、房间条件 等等。随后，选择合适的视频源（Picolo Diligent 采集卡）、区域数量（4 个）、追踪点（中心点、鼻尖点和尾部点）以及测量单位（厘米、秒和度）。
   3. 在“设置”下方选择“试验列表”选项卡后，通过点击“添加试验”按钮（1）来定义试验次数。接着，指定自变量（例如，小鼠编号、性别、分组、品系）使用“添加变量”按钮。
   4. 单击“区域设置”选项卡，从实时视频中捕获背景图像。使用适当的绘图工具（如创建矩形/折线/椭圆）勾勒外围轮廓，以定义各个区域的参数。
   5. 接下来，通过点击“添加区域”组按钮并勾画出各个区域来添加感兴趣区域（例如，地面，舔舐监测仪，食物分配器，攀爬网 等等。）的方式进行。为小鼠无法被观察到的区域添加隐藏区域（例如、庇护所和跑轮， 图2) 单击“添加隐藏区域组”按钮。确保为每个隐藏区域指定并关联入口/出口。
   6. 对每个实验区域重复步骤 2.4–2.5。通过选中“校准”并使用相应工具（创建校准标尺/坐标轴）输入实验区域的宽度和长度，完成区域校准。最后，点击“验证实验区域设置”按钮，以验证实验区域参数设置。
   7. 高亮“试验控制设置”选项卡，指定开始/停止条件和试验时长。将开始条件设置为当中心点持续时间在实验区域内超过1秒时开始。通过展开停止条件框并设置延迟（例如10小时）来调整试验持续时间，使试验在延迟结束后终止。
   8. 在“检测设置”选项卡下，选中相应的检测方法（例如，动态减影和基于模型的）
   9. 接下来，点击“检测”选项卡中的“设置”按钮，然后按“获取当前”按钮，以获取空实验区域的参考图像。
   10. 调整对比度范围，以确保每只小鼠的中心、鼻部和尾部检测可靠、准确且连续。对于白化小鼠，应设置为小鼠比背景亮；若使用有色品系小鼠，则应设置为小鼠比背景暗。
       注意：可根据头顶摄像机与受试者之间的距离以及所用计算机的处理速度，调整受试者尺寸和视频采样率例如， 14.9 帧/秒
   11. 退出检测设置模块前，请确保保存所有更改。
   12. 打开接口设备，该设备负责将输入设备记录的模拟信号转换为例如， 红外光束中断，跑轮运动 等等。) 转换为数字日志。
3. 数据采集
   注意：以下软件命令与定制的 Med PC IV 程序（“向导”）相关，该程序提供实验环节参数的逐步输入例如，10 小时试验时长，小鼠编号，分组分配 等。).
   1. 将每只小鼠放入指定的盒子中。
   2. 通过同时按下“record”按钮来同步视频和事件追踪软件。
   3. 安静地离开实验室。
   4. 当记录时间结束时（例如数小时、一天或数周后，取出小鼠并将其放回原代笼具中。
   5. 测量瓶子的重量，并将所有数字记录保存在数字存储介质（硬盘、U盘、DVD）中。
   6. 将原始数据转移至电子表格。
   7. 保存 MPG 文件，用于后续对罕见行为动作进行评分（例如、刻板行为、癫痫发作）。

结果

图3展示了在对CD1小鼠进行的长期行为学研究中不同的读数结果。数据代表了术前基线表现（手术前第6天至第2天）、术后恢复期（术后第2天至第4天）以及持续脑室内给予脑反应性抗体所诱导的行为效应（术后第6天至第10天；其中0表示手术日）。通过事件记录软件分析显示，实验组在实验期间表现出摄食行为受损，表现为饮水瓶舔舐频率降低（A）、接近蔗糖溶液的潜伏期延长（B）以及食物消耗量减少（C）。伴随这些变化，实验组小鼠在跑轮活动方面也较对照组小鼠明显减少（D）。通过视频追踪软件测量发现，实验组在笼内活动量减少（E），且更倾向于在庇护所内停留更长时间（F）。这些行为差异在样本行为谱图中得以体现（G）。

请点击此处查看此图的高清版本。

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图3. 连续10小时每日实验会话中代表性变量，展示INBEST系统的判别能力。 实验组小鼠（连续2周暴露于脑反应性抗体）在测试期间饮水量减少（A），接近蔗糖溶液所需时间更长（B），摄食量也更少（C）。伴随这些变化，它们的活动能力也受到损害，表现为转轮运行次数减少（D）、移动距离降低（E）以及在庇护所内停留时间延长（F）。这些行为差异在样本行为谱图中得以体现（G）。上图显示了实验组小鼠在第6天的行为特征，与接受载体处理的对照组小鼠（下图）相比，其摄食行为减少、转轮活动降低且在庇护所中停留时间增加。

讨论

在动物中检测功能效应在很大程度上取决于研究人员控制行为学研究固有变异性的能力。因此，必须严格控制并尽量减少可能降低行为数据可靠性和可重复性的潜在混杂因素。同时，必须认识到没有任何一种实验能够反映单一的行为领域，必须具备神经功能方面的知识，且行为对外部应激因素高度敏感。如果充分理解上述基本前提，就可以得出结论：全面的行为分析应包括所测反应的时间进程，并应涵盖能够反映特定行为特征的基本功能指标和实验范式。在丰富化的笼内环境中，利用计算机化系统对运动和行为活动进行评估，可满足上述许多标准。

迄今为止，人们一直强调，对人类疾病的小鼠模型进行行为表型分析需要额外的考虑。这一观点基于以下前提：在疾病发生过程中，功能稳态会受到内部和外部应激源的挑战。尽管引入自动化、笼内表型分析系统无法完全消除所有潜在的混杂因素，但其可显著减少因环境条件不一致、运输应激以及反复抓取动物所导致的问题。这极大地提高了不同研究之间的一致性和精确性；即使变异性的轻微降低，也能改善对早期疾病所诱导效应的检测能力。事实上，INBEST系统能够提供大量信息，从而更准确地评估行为变化的起始时间、动力学特征和严重程度，以及各种疾病诱导的行为缺陷之间的关键关联。可靠的视频追踪依赖于两种照明条件：首先，测试房间内需要漫射光，以防止附近反射物体产生伪影；其次，通过选择与实验动物体色差异尽可能大的笼底颜色，可以获得较高的颜色对比度。在本实验室中，我们通过在INBEST箱体下方安装泛光灯，并使用黑色笼底托盘来实现这一目标（若测试有色品系小鼠，则白色或灰色背景较为合适）。就INBEST系统的事件记录功能而言，当前的硬件配置（每台计算机配备1块Piccolo视频采集卡，含4个输入通道）限制了每台计算机最多同时连接4个笼盒。这一数量相对较少，而更理想的设置应支持8个甚至16个笼盒，分别需要2台或4台计算机。理想情况下，INBEST系统应作为动物的长期居住笼盒连续运行24小时。这将使动物充分适应环境，并建立稳定且具有昼夜节律的行为模式，从而实现无偏倚的行为分析。为防止因停电造成计算机数据丢失，必须配备持续供电装置（或至少配备不间断电源）。最后，为确保对每日食物摄入量的准确评估，需注意食物颗粒的尺寸不应超过饲料分配器孔洞的大小（推荐的单粒食物颗粒重量为20 mg）。

然而，不应忽视的是，该分析还应考虑不同的INBEST测量指标之间可能存在的相互作用。例如，花更多时间在跑轮上的小鼠可能会摄入更多的食物和水，以满足其增加的能量需求。同样，摄入更多蔗糖溶液的小鼠可能会减少食物摄入量。这些结果的解释还可能因行为表现随时间普遍改善而变得更加复杂，尤其是在摄食行为和跑轮活动方面。鉴于蔗糖溶液和跑轮具有激励属性，实验人员还可考虑限制其获取，以分别减少摄入后效应和过度体重减轻的可能性。然而，这些问题在不同品系的小鼠中可能具有不同的相关性，因为不同品系的小鼠具有不同的行为特征。尽管基线期和实验期的对照能够控制上述许多问题，实验人员仍需认识到，在解读INBEST数据时必须考虑这些变量。同时，某些行为特征无法在笼内环境中进行研究，因此需要结合标准行为测试，以完善受试动物的行为表型分析。

在标准化但具有灵活性的环境中进行计算机化监测，似乎是当代行为分析的逻辑下一步。这种非侵入性、基于动物行为学的方法可使研究人员在较长时间内观察到完整的行为反应谱。理论上，可通过在高度模拟自然栖息地的“虚拟”丰富化环境中研究行为来实现这一目标。多个研究团队已描述了基于视觉的追踪工具，可用于小鼠在笼内^22-25、成对^{26, 27}或大规模社交群体背景下²⁸的行为表型分析。通过将视频追踪技术与微芯片技术结合，可实现对一组小鼠行为数据的同步、并行采集，从而获得高精度和高空间分辨率的结果²⁸。热成像相机能够检测热信号，若与可植入微芯片或应答器结合使用，可提供每只小鼠的相对位置及其基本生理功能信息（例如，体温、心率/呼吸频率）。此外，先进的三维追踪系统将实现对行为动作更准确、更定量的识别。为了能够重复运行多种测试，此类系统应具备自动化、远程控制和模块化特性。例如，可通过编程控制LCD墙面上远端线索的出现，或通过可移动地板控制美味食物分配器的呈现与隐藏，从而在较大环境中研究空间记忆。类似地，可在实验过程中特定时间点呈现或隐藏新物体。此类计算机化表型分析可能有助于阐明行为的遗传决定因素、疾病模型背后的致病机制，以及新型治疗策略的开发。如果在测试条件、测试顺序以及所用硬件和软件方面达成共识，则有望实现期待已久的标准化，从而提高行为学研究的可重复性，并将实验心理测量学提升至新的水平。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
电源控制接口操作包	Med Associates Inc.	MED-SYST-8	管理所有 A/D 数据输入和输出的接口盒和 PCI 卡
刺激光源	Med Associates Inc.	ENV-221M	28 V DC，100 mA，2.5 cm 直径灯光（用于呈现条件刺激）
头部进入检测器	Med Associates Inc.	ENV-254-CB	允许检测头部进入食丸接收口
光束舔触检测仪	Med Associates Inc.	ENV-351W	红外传感器系统，用于检测鼻部对光束的阻断
食物颗粒	Bio-Serv	F0163	无尘精密食物颗粒（20 mg 啮齿类谷物基础饲料）
食物分配器	Med Associates Inc.	ENV-203-20	自动化食物分配系统，包含高位塑料容器和分配管
食物接收口	Med Associates Inc.	ENV-303R2W	红外敏感底座，用于信号指示食物颗粒已分配或被取走
攀爬网格	Med Associates Inc.	CT-Climbing mesh	耐用金属横杆，尺寸
Med PC IV 软件	Med Associates Inc.	SOF-735	整合来自所有电子设备的数据采集功能
MPC2XL v1.4	Med Associates Inc.	SOF-731	原始数据传输工具
Soft CR Pro v1.05	Med Associates Inc.	SOF-722	远程在线监控软件
转轮	Med Associates Inc.	CT-MSUB-ENV-3042-X1	小鼠活动转轮
数字计数器	Med Associates Inc.	ESUB-ENV-3000	LCD 计数器（4 次计数 = 1 转 = 54.6 cm 长度）
Picolo Diligent 图像采集卡	Euresys		高分辨率 PCI 视频采集卡
Ethovision XT 8.5	Noldus Information Technology		视频追踪软件
摄像机	Panasonic	WV-BP334	数字低照度摄像机，悬挂在定制金属支架上
视频分配器	American Dynamics	ADQUAD87	整合并数字化来自 4 台摄像机的输入信号