监测由快速生长的肿瘤形成细胞分泌因子招募的血管系统的功能与形态

摘要

我们描述了一种Matrigel栓塞实验，通过两种互补的成像方式——超声成像和内窥显微成像，来展示癌细胞分泌的一组因子所具有的促血管生成潜能。Matrigel是一种模拟细胞外基质（ECM）的凝胶，可用于将癌细胞分泌至条件培养基（C.M.）中的促血管生成因子引入宿主（小鼠）体内。 

摘要

小鼠皮下Matrigel栓塞实验是一种首选方法 体内 促血管生成与抗血管生成因子的评估。在该方法中，将目标因子引入低温液态ECM模拟凝胶，经皮下注射后，凝胶固化形成模拟肿瘤微环境的基质。该基质允许宿主细胞（如内皮细胞）浸润，从而促进血管系统的形成。

本文提出了一种改良的基质胶栓塞实验方法，可用于展示由癌细胞分泌的多种因子混合物所具有的促血管生成潜力，而非仅针对某一特定因子（例如 bFGF 和 VEGF）或试剂。该方法利用含有模拟细胞外基质（ECM）凝胶的栓塞物，将快速生长的胶质母细胞瘤细胞在条件培养基（C.M.）中分泌的多种因子引入宿主（即 小鼠）体内。我们此前已在该模型系统中详细比较了U-87 MG人胶质母细胞瘤细胞系及其静息状态衍生克隆的促血管生成能力，结果显示U-87 MG亲本细胞可诱导血管生成。条件培养基（C.M.）的制备方法是：将两种细胞系在融合状态下培养48小时后，收集培养液并进行过滤处理，因此其中仅包含细胞分泌的因子，而不含有细胞本身。本文还描述了两种成像技术的联合应用——微泡增强的超声成像与活体纤维共聚焦内窥显微镜，以实现对栓塞物内新生血管的范围、形态及功能进行精确、实时的表征。

引言

Matrigel 小栓血管生成实验最初由 Kibbey et al. 于 1992 年描述，当时用于评估肽段 SIKVAV（Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val）对血管生成的刺激作用¹。与其他 体内 血管生成实验（如小鼠角膜血管生成实验或鸡胚尿囊膜实验）相比，该实验相对易于操作²。注射的模拟细胞外基质（ECM）凝胶可包含细胞、促血管生成或抗血管生成化合物和/或因子。在评估抗血管生成化合物活性时，通常在小栓中加入血管内皮生长因子（VEGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）的混合物，抗血管生成物质可直接注入小栓内或通过全身给药^3,4。

将模拟细胞外基质（ECM）的凝胶注射到皮下，该凝胶在数分钟内即固化。通常通过测量凝胶栓内血红蛋白水平、注射荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的葡聚糖后检测荧光信号、对组织切片进行内皮特异性标志物免疫染色，或通过荧光激活细胞分选（FACS）^2,5,6来评估凝胶栓中血管的募集情况。然而，这些方法仅能进行终点分析，无法提供有关血管功能性和形态学的信息。此外，无论是通过血红蛋白水平还是使用葡聚糖-FITC作为指示剂来测量血浆体积，结果均可能具有误导性，因为血液含量受血管大小以及血液滞留池范围的影响。当所募集的血管系统表现出增强的通透性和滞留（EPR）效应时，这一点尤为关键⁷。

方案

注意：所有动物实验均经特拉维夫大学萨克勒医学院机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并按照其标准执行。

1. 条件培养基制备

1. 在10 cm培养皿中加入8 ml添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素/制霉菌素溶液的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），接种2 × 10⁶个U-87 MG细胞。
2. 将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下培养，至48小时达到完全汇合。
3. 使用10 ml注射器从培养皿中吸出全部培养基，经0.45 µm滤膜过滤后收集至15 ml离心管中。
4. 无需洗涤细胞，直接向培养皿中加入1 ml胰蛋白酶溶液（0.25%），并进行孵育。
5. 待所有细胞脱落后，加入至少5 ml含10% FBS的DMEM终止胰酶消化，并进行细胞计数。
6. 使用血细胞计数板或其他细胞计数装置计数细胞数量，并根据所用计数方法计算细胞总数。
   注意：该数值后续将用于标准化条件培养基（C.M.）的浓度。
7. 将条件培养基（C.M.）转移至玻璃圆底烧瓶中，使用高真空旋转蒸发仪进行浓缩。如需加快浓缩速度，可将水浴温度升至37 °C。持续浓缩至C.M.呈糊状。
8. 将每块培养皿所得的C.M.重新悬浮于400 µl生理盐水中。若使用多于一块培养皿，则按比例增加体积。例如，使....

结果

将表达快速生长的血管生成性肿瘤细胞系 U-87 MG 的条件培养基（C.M.）植入模拟细胞外基质（ECM）的凝胶塞中，可诱导显著的血管生成。该血管系统可通过两种互补的成像方法进行深入研究。

微泡造影增强超声成像通过显示载有U-87 MG条件培养基（C.M.）的凝胶中存在广泛的血流，揭示了功能性血管被大量招募至凝胶内部的现象；相比之下，含有休眠性肿瘤形成细胞条件培养基（C.M.）的凝胶内则几乎检测不到血流（图1）。

纤维状共聚焦内窥显微镜突出了这些新形成血管的形态（图2）。含有U-87 MG条件培养基的凝胶栓中，血管表现出典型的增强渗透与滞留（EPR）效应特征，该效应常见于此处使用的70 kDa大分子物质如FITC标记的葡聚糖。血管明显扩张且高度扭曲，血流不连续且缓慢（图2A，C）。此外，观察到血液向周围环境渗漏，表现为血管外出现强荧光信号（图2B）。

讨论

结合使用互补的成像方法，可获取有关血管生成不同组分的信息，包括微血管密度、功能性和形态学特征。将C.M.加载到模拟细胞外基质的凝胶塞中，可形成肿瘤微环境，该环境与其他细胞群体（如被招募并外渗进入凝胶塞的内皮细胞）相分离。

通过并行进行微泡造影增强超声成像和光纤共聚焦内窥显微成像，我们可以得出结论：由快速生长的血管生成性肿瘤形成细胞分泌的一组因子（不包括癌细胞本身）不仅能够募集血管，还能形成具有典型EPR特征的功能性脉管系统。此外，该方法可实现肿瘤微环境中分泌因子作用与细胞间相互作用的分离。

通过美国获取的信息以及使用光纤共聚焦内窥显微成像技术存在成像技术本身的局限性。例如，在使用光纤共聚焦内窥显微成像时，无法随时间推移对单个特定的血管进行成像，甚至无法对栓塞部位的同一区域进行重复成像。

ECM模拟凝胶塞实验相对容易操作，在将条件培养基（C.M.）加入ECM模拟凝胶时也能保持这一优势。然而，一个需要考虑的关键问题是C.M.与ECM模拟凝胶的比例。过高的C.M.体积可能阻碍E.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
旋转真空蒸发仪	-	-	-
生长因子减少的无酚红基质胶	BD生物科学	FAL356231	4℃过夜解冻 °在冰上
脱毛膏	-	-	-
Vevo2100 超声成像系统	VisualSonics 公司	-	需要具备操作经验或由授权技术人员协助
55 MHz 708 探头	VisualSonics 公司	-	-
Vevo2100 成像软件	VisualSonics 公司	-	-
VialMix	DEFINITY 成像	VMIX	-
DEFINITY 微泡	DEFINITY 成像	DE4	使用前用 VialMix 激活 45 秒
CellVizio（光纤共聚焦内窥显微镜）	Mauna Kea Technologies	-	需要具备操作经验或由授权技术人员协助
ProFlex MiniO/30 探针	Mauna Kea Technologies	-	-
70 kD FITC标记的葡聚糖	Sigma-Aldrich	46945	-
ImageCell 软件	Mauna Kea Technologies	-	-
校准试剂盒	Mauna Kea Technologies	-	-
杜尔贝科’改良型伊格尔’DMEM培养基	Gibco Life Technologies	41965-039
胎牛血清（FBS）	生物工业公司	04-007-1A
青霉素/链霉素/制霉菌素溶液	生物工业公司	03-032-1B